СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ БЕТА-АМИЛАЗЫ ИЗ ЗЕРЕН ЗЛАКА И ЦЕЛЛЮЛАЗА ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ БЕТА-АМИЛАЗЫ ИЗ ЗЕРЕН ЗЛАКА Российский патент 2006 года по МПК C12N9/26 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к технологии ферментов. Точнее изобретение относится к способу экстракции β-амилазы из злака и к использованию фермента в указанной экстракции.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

β-амилаза представляет собой крахмалрасщепляющий фермент, который гидролизует альфа-1,4-связи. Она обнаружена, например, в бактериях и растениях и гидролизует крахмал, главным образом, с отщеплением мальтозы от невосстанавливающего конца цепи молекулы крахмала. β-амилаза присутствует в избытке, например, в хлебных злаках, где она при необходимости превращает питательный запас злака, например, крахмал, в сахар. В злаках крахмал запасается главным образом в форме амилозы и амилопектина. β-амилаза превращает всю амилозу в мальтозу, в то время как около 60% амилопектина превращается в мальтозу, а остальное превращается в декстрин.

β-амилаза является коммерчески важным ферментом, который применяют, например, в производстве крахмала для получения мальтозы. Продукты, содержащие большие количества мальтозы, применяют, например, в кондитерской и пищевой промышленности. β-амилаза была выделена как из бактерий, так и из растений. Например, она была получена из бактерий Bacillus (патент США 4970158 и патент Японии 60126080) и из термостабильных бактерий Clostridium (патент США 4647538). Кроме мальтозы, β-амилазы, выделенные из бактерий, производят мальтотриозу в значительных количествах в то время, как выделенные из растений β-амилазы производят относительно больше мальтозы, и поэтому они являются более подходящими для тех способов, задачей которых является получение по возможности сладких и/или способных к брожению продуктов. Кроме того, крупномасштабное получение β-амилазы из бактерий является трудным. Применяемая в промышленности β-амилаза имеет растительное происхождение, причем в таких случаях в качестве источника фермента обычно используют злак, особенно ячмень или пшеницу, а также сою культурную.

В процессе роста растения β-амилаза образуется в зернах, где она и запасается. Зерно состоит из зародыша и крахмалсодержащего эндосперма, т.е. сердцевины, которые отделены друг от друга скутеллумом. Эндосперм окружен алейроновым слоем, а целое зерно окружено слоем перикарпия, слоем тесты и собственно оболочкой. Пшеница не имеет характерной оболочки, но перикарпий и теста образуют твердую внешнюю оболочку. β-амилаза аккумулируется, главным образом, в эндосперме и скутеллуме. Наибольшие количества β-амилазы обнаружены в крайних частях эндосперма сразу под слоем алейрона.

β-амилаза ячменя была тщательно изучена. Указанная β-амилаза и ее получение описаны, например, в следующих публикациях: D.E.Briggs, Barley, Chapman & Hall, London, 1978; Cook, Barley and Malt, Academic Press, London, 1962; J.R.A. Pollock, Brewing Sciene, Academic Press, London, 1979. Систематическим названием фермента является 1,4-альфа-D-глюканмальтогидролаза (ЕС 3.2.1.2). Ранее β-амилазу злака выделяли сначала размолом или дроблением зерна и затем экстракцией β-амилазы водой или буфером. Выделение фермента из экстракта такого типа, естественно, является тяжелой и сложной для выполнения, так как кроме рассматриваемого фермента экстракт содержит несколько других растворимых компонентов зерна. Исследователями были предприняты попытки усовершенствовать выделение β-амилазы из содержащего ее раствора, например, адсорбцией фермента полимером в присутствии сульфата аммония (патент США 5294341). Высвобождение β-амилазы из клейковины было осуществлено посредством протеазы (патент Японии 63079590).

β-амилаза также была выделена из отработанной жидкости при производстве крахмала из пшеницы добавлением альгината натрия и извлечением коагулированного фермента (патент Японии 60027383) или образованием геля фосфата кальция, на котором фермент адсорбируется и из которого затем фермент извлекают (патент Японии 63248389). Отработанная в производстве крахмала жидкость не является хорошим источником β-амилазы, так как она очень разбавлена и содержит большие количества других компонентов, которые затрудняют очистку и концентрирование и в результате занижают выход.

Для того чтобы получить более чистый сырой экстракт и избежать трудностей, существующих в технологии производства и выделения целевого продукта, предположили, что β-амилазу нужно экстрагировать из целых или частично очищенных от шелухи зерен. Когда, например, зерна ячменя лущат таким способом, при котором их эндосперм не разрушается, крайние слои эндосперма служат фильтром, который предотвращает доступ нерастворимых веществ к воде для замачивания и ограничивает доступ растворимых веществ. Предпочтительно осуществлять экстракцию в присутствии восстановителя, который способствует освобождению β-амилазы от других белков зерна (патент Финляндии 61516 и патент США 4675296).

В настоящее время изобретен способ экстракции β-амилазы из злака, который приводит к уменьшению времени экстракции и увеличению выхода фермента. Способ является простым для выполнения и особенно применимым для обработанного лущеного злака, который также облегчает дальнейшую очистку фермента.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ экстракции β-амилазы согласно изобретению отличается тем, что для получения экстракта, содержащего β-амилазу, злак экстрагируют в присутствии целлюлазы в водной среде. Кроме того, изобретение относится к применению целлюлазы для экстракции β-амилазы из злака.

Целлюлазу применяют, например, в производстве крахмала из молотого злака, чтобы снизить вязкость суспензии и отделить крахмал от белка. Неожиданно было обнаружено, что добавление целлюлазы к воде для экстракции β-амилазы улучшает выход β-амилазы и позволяет уменьшить время экстракции. Предпочтительные аспекты изобретения описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.

На фиг.1 показано влияние температуры на выход β-амилазы как функции от времени.

Способ согласно изобретению применим для экстракции различных злаковых культур, содержащих β-амилазу, например, для обработки пшеницы, ячменя, ржи и сои. Способ предпочтительно применим для экстракции β-амилазы из пшеницы и ржи и особенно для экстракции из ячменя. Непроросшие зерна не содержат значительных количеств ферментов, отличных от β-амилазы, по этой причине целесообразно экстрагировать β-амилазу из таких зерен. Фермент можно экстрагировать из неочищенных от шелухи зерен, но предпочтительным является экстрагировать из лущеных, дробленых, размолотых или полированных зерен. Целесообразным является очищать от шелухи рожь и ячмень. Наилучшие результаты достигаются при экстракции лущеных зерен ячменя.

Для того чтобы предотвратить выход крахмала из эндосперма зерна в экстракт, лущение следует проводить таким образом, чтобы не разрушить собственно живое зерно. Однако собственно оболочка должна быть удалена по возможности аккуратно. Причина заключается в том, что оболочка является настолько плотной, что она затрудняет проникновение β-амилазы. Таким образом, лущеный ячмень означает ячмень, из зерна которого удалена собственно оболочка, но эндосперм остается нетронутым. На практике это означает, что самое большее приблизительно 20% массы нелущеного зерна удаляется при лущении. Обычно от 10 до 20% удаляется в виде очищенного материала. В таком случае крайние слои (слой перикарпия, тесты и алейрона) эндосперма служат ультрафильтром, который препятствует доступу нерастворимых веществ и в основном также доступу растворимых веществ к экстракционной воде. Экстракт, полученный из обработанных таким способом зерен, является относительно чистым, что облегчает дальнейшую обработку, такую как очистка и концентрирование фермента. В дальнейшей обработке могут быть использованы способы, хорошо известные в ферментной промышленности, такие как фильтрация и ультрафильтрация под давлением.

Злак экстрагируют водной средой, такой как вода или, возможно, буферный раствор. В течение экстракции рН среды обычно составляет между 6,0 и 6,5. Предпочтительно экстракцию проводят в восстановительных условиях. Используют столько восстанавливающей активности, чтобы высвободить β-амилазу, связанную со структурным белком зерна. Восстанавливающие условия создают способом, известным самим по себе, на практике часто с помощью SO₂, например, добавлением метабисульфита натрия и/или сульфита натрия. Отношение лущеных зерен к водной среде составляет предпочтительно между 5:8 и 2:3 (масса/объем). Способ согласно изобретению является подходящим для промышленных способов, где экстракцию проводят в стальном бункере, в который загружают, например, 19 тонн лущеного ячменя и 29 м³ воды, содержащей 0,5% метабисульфита натрия и 0,5% сульфита натрия.

Экстракцией ячменя способом, описанным выше, экстракционный выход, включающий приблизительно от 45 до 50% всего содержания β-амилазы в ячмене, может быть достигнут без отделения воды, которая остается внутри зерна. В таком случае время экстракции составляет приблизительно 72 часа. При добавлении целлюлазы к экстракционной воде может быть экстрагировано до 65% всего количества β-амилазы в злаке в то время, как продолжительность экстракции снижается приблизительно до 60 часов.

Целлюлоза представляет собой линейный полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, которые соединены β-1,4-глюкозидными связями. Она встречается в клеточных стенках растений, где она часто присутствует вместе с лигнином и гемицеллюлозой. Ферменты, которые принимают участие в реакциях расщепления целлюлозы, относятся к целлюлазам. Целлюлазы применяют в промышленности, например, производстве крахмала, бумажной промышленности, текстильной промышленности, для деградации β-глюкана на пивоваренных заводах и для улучшения качества муки в пекарнях. В способе согласно настоящему изобретению целлюлаза расщепляет структуры на поверхности под любой оболочкой живого зерна.

Коммерчески доступные препараты целлюлазы получают либо из бактерий, таких как род Bacillus, либо из грибов, таких как дрожжи (например, Saccharomyces), или плесневых грибов. В частности, большое количество целлюлаз было выделено из плесневых грибов. Наиболее используемые для выделения целлюлаз плесневые грибы принадлежат к родам Humicola, Fusarium, Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium и Trichoderma. Некоторые из продуцирующих штаммов были генетически модифицированы. В настоящем изобретении предпочтительно применяют целлюлазу, выделенную из плесневых грибов, в частности из плесневых грибов Trichoderma.

Коммерческие препараты фермента обладают несколькими ферментативными активностями, и уровни активностей и их соотношения могут незначительно отличаться в зависимости от производителя. Важным для изобретения является то, что продукт должен проявлять, по меньшей мере, целлюлазную, гемицеллюлазную и β-глюканазную активности. Другими словами, в данном контексте целлюлаза относится к ферментативному препарату, который расщепляет, по меньшей мере, целлюлозу, гемицеллюлозу и β-глюкан. Все коммерческие препараты целлюлазы, протестированные заявителем (произведенные Genencor International, Rohm Enzymer GmbH and Novo Nordisk), улучшали выход β-амилазы. Целлюлазная, гемицеллюлазная и β-глюканазная активности описаны, например, в Novo′s Handbook of Practical Biotechnology, 1986.

Целлюлазы можно подразделить, например, на эндоцеллюлазы, экзоцеллюлазы, экзоцеллобиогидролазы и целлобиазы. Эндоцеллюлазы, т.е. 1,4-β-D-глюканглюканогидролазы, произвольно расщепляют β-1,4-связи в сердцевине молекулы целлюлозы и в результате расщепления образуются олигосахариды. Экзоцеллюлазы, т.е. 1,4-β-D-глюканглюкогидралазы, расщепляют β-1,4-связи на конце молекулы, освобождая глюкозу. Их действие на целлобиозу является замедленным. Экзоцеллобиогидролазы, т.е. 1,4-β-D-глюканцеллобиогидролазы, расщепляют вышеуказанные связи на невосстанавливающем конце молекулы, образуя целлобиозу, и целлобиазы, т.е. β-D-глюкозидглюкогидролазы, расщепляют целлобиозу до глюкозы. Для гидролиза целлюлозы до глюкозы требуется эндоглюканаза (1,4-β-D-глюканглюканогидролаза, ЕС 3.2.1.4), которая расщепляет связи в сердцевине молекулы и также замещенные субстраты, но не разрушает кристаллическую целлюлозу, целлобиогидролаза (1,4-β-D-глюканцеллобиогидролаза, ЕС 3.2.1.91), которая расщепляет кристаллическую целлюлозу, и β-глюкозидаза (β-D-глюкозидглюкогидролаза, ЕС 3.2.1.21), которая является целлобиазой, которая расщепляет целлобиозу и целлоолигосахариды до глюкозы.

Группа ферментов, расщепляющих гемицеллюлозу, т.е. полисахариды, которые встречаются в природе и содержат пентозы, например, арабинаны, галактаны, маннаны и ксиланы, названа гемицеллюлазами. β-глюканазы расщепляют β-D-глюканы, т.е. полимеры глюкозы, которые могут быть разветвлены и могут содержать как β-1,3-связи, так и β-1,4-связи. β-глюкан обнаружен, например, в клеточных стенках эндосперма в зернах. Лихеназа представляет собой эндо-β-глюканазу (1,3·1,4-β-D-глюкан-4-глюканогидролаза), которая расщепляет β-1,4-связи β-глюкана, содержащего β-1,3-связи и β-1,4-связи. Ламинариназа (1,3-β-D-глюкан-3-глюканогидролаза) расщепляет β-глюкан, который содержит только β-1,3-связи, такие как β-1,3-связи в углеводах типа ламинарина, и экзоглюканаза (1,3-β-D-глюканглюкогидролаза) расщепляет β-1,3-связи у β-1,3-глюкана, образуя, главным образом, глюкозу.

В экстракции β-амилазы обнадеживающие результаты были достигнуты, например, с помощью препаратов целлюлазы Spezyme CE и GC 440, произведенных компанией Genencor International. Указанная целлюлаза получена из генетически модифицированного штамма Trichoderma longibrachiatum, и она особенно эффективно расщепляет целлюлозу, гемицеллюлозу и β-глюкан. Ее активность выражается как действие на карбоксиметилцеллюлозу (RBB-CMC), причем активность по отношению к RBB-CMC составляет, по меньшей мере, 1400 МЕ/г. Кроме целлюлазной активности, препарат GC 440 проявляет β-глюканазную, β-глюкозидазную, β-ксилозидазную, ксиланазную и ацетилэстеразную активность. Средняя партия препарата GC 440 проявляет активность по отношению к DNS-CMC в среднем приблизительно от 7000 до 9000 Ед/мл, β-глюканазную активность, составляющую приблизительно от 6000 до 8000 Ед/мл, β-глюкозидазную активность, составляющую приблизительно от 80 до 90 Ед/мл, β-ксилозидазную активность, составляющую приблизительно от 500 до 600 нкат/мл, ацетилэстеразную активность, составляющую приблизительно от 1700 до 2000 нкат/мл, ксиланазную активность по отношению к RBB-CMC, составляющую приблизительно от 700 до 1400 Ед/мл, и ксиланазную активность по отношению к DNS-CMC, составляющую приблизительно от 1900 до 2100 Ед/мл. Очень хорошие результаты были достигнуты при использовании целлюлазы, произведенной компанией Rohm Enzyme GmbH, которая продается под торговой маркой Rohalase®Sep. Препарат получают из штамма Trichoderma reesei, и он проявляет достаточно высокую β-1,4-эндоглюканазную активность (по меньшей мере, 4700 ед/г (CU/g)) и ксиланазную активность (по меньшей мере, 3000 XylH/г), и незначительную целлобиогидролазную активность. Препарат также проявляет β-1,3-глюканазную активность, т.е. содержит ламинариназу. Когда используют вышеуказанные ферментные препараты, то подходящее количество целлюлазы составляет, по меньшей мере, 0,015%, предпочтительно, по меньшей мере, 0,020%, например, от 0,018 до 0,040 и особенно от 0,024 до 0,030% от массы злака.

β-амилазу можно экстрагировать в присутствии целлюлазы при температуре от 20 до 45°С. Предпочтительной температурой является от 25 до 32°С, например, от 29 до 31°С. Время экстракции может быть от 30 до 72 часов, обычно, по меньшей мере, 48 часов, например, от 48 до 66 часов и особенно от 55 до 62 часов. Наиболее подходящее время экстракции при 30°С составляет приблизительно 60 часов. По окончании экстракции зерна крупу или муку отделяют от экстракционной воды, используя, например, сито, и β-амилазу выделяют из экстракционной воды, из которой ее очищают и/или концентрируют, если желательно.

После экстракции экстрагированный и отделенный таким способом злак может быть использован, например, для производства крахмала. Согласно настоящему изобретению β-амилазу экстрагируют и отделяют от злака до того, как фракционируют крахмал и отделяют его от злака. Если фермент экстрагируют из необработанных зерен, то экстрагированные зерна сначала дробят, после чего осуществляют способ получения крахмала по технологии, известной самой по себе, т.е. измельченные зерна перемешивают в воде, и злак фракционируют, используя просеивание и центрифугирование. В процессе дробления целлюлазу обычно добавляют вместе с β-глюканазой для уменьшения вязкости и отделения крахмала от белка.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его описанными в тексте аспектами.

Пример 1

Определение β-амилазы

До определения общего количества β-амилазы, выделенной из злака, любую оболочку удаляли, анализируемый сухой злак измельчали до тонкой муки и 10 г ее помещали в 100-мл колбу Эрленмейера. Добавляли 100 мл 0,5% (масса/объем) раствора сульфита натрия, и вещества тщательно перемешивали. Смесь оставляли в колбе в течение 24 часов, но время от времени ее встряхивали. После указанной процедуры смесь тщательно перемешивали и фильтровали через тонкий бумажный фильтр (MN 640 W). Фильтрат разбавляли дистиллированной водой в отношении 1:50 и активность определяли описанным ниже методом. Данный ферментативный анализ использовали как таковой для определения содержания β-амилазы в экстракционных растворах в примерах, описанных ниже.

В принципе, активность β-амилазы определяли, как описано в Food Chemical Codex IV, General Test and Apparatus, 485.

В данном описании единицу ДС (диастатическая сила) определяют как количество фермента в 0,1 мл 5% раствора разбавленного образца, которое продуцирует количество редуцирующих сахаров, достаточное для восстановления 5 мл раствора Фелинга из 100 мл субстрата при 20°С в течение 1 часа. (Метод определения не соответствует дефиниции ДС.)

Ферментативную активность определяли с помощью гидролиза крахмала при 20°С, рН 4,6 в течение 30 минут. Образующиеся редуцирующие сахара определяли титриметрически посредством щелочного раствора феррицианида. Чтобы получить крахмал в качестве субстрата, 20 г (сухое вещество) крахмала (Baker 1130) смешивали приблизительно с 50 мл воды. Добавляли приблизительно 500 мл кипящей воды и смесь кипятили в течение ровно 2 минут. Затем добавляли 20 мл ацетатного буфера (0,5 М, рН 4,6) к охлажденному раствору крахмала и разбавляли дистиллированной водой до 1 л. 200 мл крахмального субстрата, температуру которого доводили до 20°С, добавляли с помощью пипетки в 250-мл мерную колбу, затем добавляли 10 мл разбавленного ферментного образца и вещества тщательно перемешивали. Образец инкубировали в течение ровно 30 минут на водяной бане при 20°С и добавляли 20 мл 0,5 н. NaOH. Вещества хорошо перемешивали и разбавляли до 250 мл. Для приготовления 0 образца 10 мл разбавленного фермента и 20 мл 0,5 н. NaOH добавляли с помощью пипетки в 250-мл мерную колбу. Вещества хорошо перемешивали и добавляли 200 мл крахмального субстрата и разбавляли до 250 мл.

0,05 н. феррицианидный реагент готовили растворением 16,5 г феррицианида калия (K₃Fe(CN)₆) и 22 г карбоната натрия (Na₂CO₃) в воде и разбавлением раствора до 1 л. A-P-Z раствор готовили растворением 70 г хлорида калия (KCl) и 20 г сульфата цинка (ZnSO₄Ч7H₂O) в 700 мл дистиллированной воды, добавлением 200 мл концентрированной уксусной кислоты и разбавлением раствора до 1 л. Раствор йодида калия готовили растворением 50 г йодида калия (KI) в 100 мл дистиллированной воды и добавлением 2 капель 50% гидроксида натрия (NaOH). В 250-мл мерную колбу добавляли пипеткой 10 мл феррицианидного реагента и 5 мл образца. Вещества хорошо перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение ровно 20 минут. Раствор охлаждали и добавляли 25 мл A-P-Z реагента и 1 мл раствора KI. Смесь титровали с помощью 0,05 н. раствора сульфата натрия до исчезновения синего окрашивания (темно-синий цвет → белый)

Активность β-амилазы рассчитывали по формуле

где

V0 = расход при титровании 0 образца (мл)

V1 = расход при титровании образца (мл)

K = коэффициент разбавления

Пример 2

Заявители изучали влияние целлюлазы на время экстракции β-амилазы. β-амилазу экстрагировали из ячменя в отсутствие целлюлазы и в присутствии целлюлазы. 10 кг ячменя, лущеного с помощью машины для вылущивания ячменя, экстрагировали 15 л воды, содержащей 0,5% метабисульфита натрия и 0,5% сульфита натрия. Кроме того, препарат целлюлазы GC440, произведенный Genencor, добавляли ко второй партии, количество целлюлазы соответствовало 0,029% массы лущеного ячменя. Экстракцию проводили при 30°С. Активность используемого в экстракции зерна, определенная согласно примеру 1, составляла 155 ДС°/г. Результаты приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1
Экстракция в отсутствие целлюлазыВремя, часыАктивность β-амилазы в ДС°/мл экстракционного раствора102024473055488360926698721029686

Таблица 2
Экстракция в присутствии целлюлазыВремя, часыАктивность β-амилазы в ДС°/мл экстракционного раствора10232455307048926010466104721009690

Полученные результаты показывают, что добавление целлюлазы к экстракционной воде приводит к уменьшению времени экстракции β-амилазы.

Пример 3

Заявители изучали влияние целлюлазы на экстракционный выход. 10 кг лущеного ячменя с β-амилазной активностью, составляющей 155 ДС°/г, экстрагировали 15 л воды, содержащей 0,5% метабисульфита натрия и 0,5% сульфита натрия. Экстракцию осуществляли при 30°С либо в отсутствие целлюлазы, либо в присутствии целлюлазы.

Время экстракции в отсутствие целлюлазы составило 72 часа. Общая активность количества используемого ячменя составила 1550 кДС°. Разделением экстракта с помощью сита было получено 8175 мл экстракта с активностью 95 ДС°/мл. Таким образом, общая активность полученного экстракта была 776,6 кДС°, и выход экстракта составил 50,1%.

Соответственную экстракцию осуществляли в присутствии целлюлазы добавлением количества GC440, соответствующего 0,025% массы лущеного ячменя. Время экстракции составило 60 часов. Общая активность количества используемого ячменя была 1550 кДС°. Разделением экстракта с помощью сита было получено 9825 мл экстракта с активностью 102 ДС°/мл. Таким образом, общая активность полученного экстракта была 1002,2 кДС°, и выход экстракта составил 64,7%.

Полученные результаты показывают, что добавление целлюлазы к экстракционной воде приводит к значительному увеличению выхода β-амилазы.

Пример 4

Заявители изучали влияние температуры на степень экстракции β-амилазы. Лущеный ячмень экстрагировали способом, описанным в предыдущих примерах, в присутствии целлюлазы при различных температурах. Порция целлюлазы GC440 соответствовала 0,027% массы лущеного ячменя, и температура экстракции была 20, 25, 30 или 40°С. Результаты показаны на фиг.1. Наилучшие результаты были достигнуты при 30°С.

Пример 5

Заявители изучали влияние целлюлазы на выход β-амилазы из пшеницы. 10 кг размолотой пшеницы с β-амилазной активностью, составляющей 128 ДС°/г, экстрагировали 15 л воды, содержащей 0,5% метабисульфита натрия и 0,5% сульфита натрия. Экстракцию осуществляли при 30°С либо в отсутствие целлюлазы, либо в присутствии целлюлазы.

Время экстракции в отсутствие целлюлазы составило 72 часа. Общая активность количества используемой пшеницы была 1280 кДС°. Разделением экстракта с помощью сита было получено 9175 мл экстракта с активностью 55 ДС°/мл. Таким образом, общая активность полученного экстракта была 504,6 кДС°, и выход экстракта составил 39,4%.

Соответственную экстракцию осуществляли в присутствии целлюлазы добавлением количества целлюлазы GC440, соответствующего 0,036% массы крупы по отношению к размолотой пшенице. Время экстракции составило 60 часов. Общая активность количества используемой пшеницы была 1280 кДС°. Разделением экстракта с помощью сита было получено 10080 мл экстракта с активностью 72 ДС°/мл. Таким образом, общая активность полученного экстракта была 725,8 кДС°, и выход экстракта составил 56,7%.

Полученные результаты показывают, что добавление целлюлазы к экстракционной воде приводит к значительному увеличению выхода β-амилазы.

Пример 6

Заявители изучали влияние целлюлазы на выход β-амилазы из полированной пшеницы. Пшеницу полировали с помощью машины, на которой полируют рис, разрушением поверхности и удалением крайней части, т.е. бóльшая часть перикарпия при этом удалялась и незначительно повреждался слой тесты. 10 кг полированной пшеницы с β-амилазной активностью, составляющей 128 ДС°/г, экстрагировали 15 л воды, содержащей 0,5% метабисульфита натрия и 0,5% сульфита натрия. Экстракцию осуществляли при 30°С либо в отсутствие целлюлазы, либо в присутствии целлюлазы.

Время экстракции в отсутствие целлюлазы составило 72 часа. Общая активность количества используемой пшеницы была 1280 кДС°. Разделением экстракта с помощью сита было получено 9780 мл экстракта с активностью 15 ДС°/мл. Таким образом, общая активность полученного экстракта была 146,7 кДС°, и выход экстракта составил 11,5%.

Соответственную экстракцию осуществляли в присутствии целлюлазы добавлением количества целлюлазы GC440, соответствующего 0,036% массы полированной пшеницы по отношению к размолотой пшенице. Время экстракции составило 60 часов. Общая активность количества используемой пшеницы была 1280 кДС°. Разделением экстракта с помощью сита было получено 9250 мл экстракта с активностью 35 ДС°/мл. Таким образом, общая активность полученного экстракта была 323,8 кДС°, и выход экстракта составил 25,3%.

Полученные результаты показывают, что добавление целлюлазы к экстракционной воде приводит к значительному увеличению выхода β-амилазы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения ферментов. Способ экстракции β-амилазы из зерен злака ведут в водной среде с целлюлазой с последующим выделением β-амилазы из полученного экстракта. β-амилазу экстрагируют из ячменя, или пшеницы, или лущеного ячменя. Экстракцию осуществляют при температуре от 25 до 33°С, предпочтительно от 29 до 31°С. Время экстракции составляет от 48 до 66 часов, предпочтительно от 55 до 62 часов. Применяют целлюлазу предпочтительно из плесневого гриба Trichoderma. Изобретение предлагает использование целлюлазы для выделения β-амилазы из зерен злака. Изобретение обеспечивает значительное увеличение выхода β-амилазы и приводит к уменьшению продолжительности экстракции. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ экстракции β-амилазы из зерен злака, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют в водной среде, в присутствии целлюлазы с последующим выделением β-амилазы из полученного экстракта.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что β-амилазу экстрагируют из зерен ячменя, пшеницы или ржи.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что β-амилазу экстрагируют из лущеного ячменя.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что β-амилазу экстрагируют из зерен злака, обработанных способом, выбранным из лущения, дробления, помола, полирования и их комбинаций.5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют в восстанавливающих условиях.6. Способ по п.5, отличающийся тем, что восстанавливающие условия создают таким образом, чтобы достичь восстанавливающей активности, способной высвободить β-амилазу, связанную со структурным белком зерна.7. Способ по п.5, отличающийся тем, что восстанавливающие условия создают с помощью воды, содержащей SO₂.8. Способ по п.3, отличающийся тем, что β-амилазу из лущеного ячменя экстрагируют водой, содержащей SO₂, в соотношении от 5:8 до 2:3, соответственно.9. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют при температуре от 25 до 33°С, предпочтительно от 29 до 31°С.10. Способ по п.1, отличающийся тем, что продолжительность экстракции составляет от 48 до 66 ч, предпочтительно от 55 до 62 ч.11. Способ по п.1, отличающийся тем, что целлюлаза представляет собой ферментный препарат, проявляющий целлюлазную, гемицеллюлазную и/или β-глюканазную активности.12. Способ по п.1, отличающийся тем, что целлюлаза представляет собой целлюлазу из плесневого гриба.13. Способ по п.12, отличающийся тем, что используют целлюлазу из плесневого гриба Trichoderma.14. Способ по п.1, отличающийся тем, что целлюлаза представляет собой целлюлазу из рода, выбранного из Humicola, Fusarium, Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma и их комбинаций.15. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что β-амилазу экстрагируют из дробленых зерен.16. Применение целлюлазы для экстракции β-амилазы из зерен злака.