СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ГИПОТИРЕОЗА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2007 года по МПК A61B5/01 

Изобретение относится к области медицины, в частности экспериментальной патофизиологии, и может быть использовано при функциональной диагностике экспериментального гипотиреоза у лабораторных животных.

Известно множество способов получения экспериментальной модели гипотиреоза на лабораторных крысах, отличающихся между собой как среднесуточной дозой, так и продолжительностью введения тиреостатика, в частности мерказолила.

Так, одни авторы применяют малые среднесуточные дозы мерказолила, например 0,3 мг/100 г массы тела (1). Другие, наоборот, высокие - до 20 мг/100 г массы животного (2). При этом продолжительность введения тиреостатика варьирует в пределах от 21 до 25 суток (1, 2). В этих условиях, при воспроизведении вышеуказанных способов, экспериментатору трудно установить срок получения достоверной модели гипотиреоза, который в свою очередь зависит от среднесуточной дозы тиреостатика и продолжительности его введения. Утвердительный диагноз «Экспериментальный мерказолиловый гипотиреоз» можно поставить только после декапитации животных с последующим определением уровня содержания тиреоидных гормонов. В случае если гипотиреоз не подтвердится, экспериментатор теряет весь биологический материал, то есть всю группу животных.

Известен способ диагностики экспериментального гипотиреоза, включающий изучение таких симптомов, как вялость, сонливость, медлительность, понижение температуры тела, гиперхолестеринемия, лейкопения, анемия (3).

Недостатком данного способа является то, что все эти симптомы, кроме определения уровня содержания тиреоидных гормонов, не являются достоверными признаками гипотиреоза. А уровень содержания тиреоидных гормонов у мелких животных требует предварительного умерщвления их.

Наиболее близкой к заявляемой диагностике экспериментального гипотиреоза у лабораторных животных является классическая модель экспериментального гипотиреоза, воспроизводимая путем перорального введения тиреостатика мерказолила в организм лабораторных крыс из расчета 20 мг/100 г массы тела ежедневно в течение 3-х недель (2).

Недостатком данного способа является то, что в данном случае отсутствуют объективный контроль за состоянием функций щитовидной железы на промежуточных этапах эксперимента и диагностические критерии, позволяющие достоверно установить факт наступления гипотиреоза у животных. На этом фоне не исключены побочные эффекты и искажение модели патофизиологических нарушений при тиреоидной патологии. Все это затрудняет принятие решения о целесообразности прекращения дальнейшего введения тиреостатика.

Задача изобретения - разработка способа диагностики экспериментального гипотиреоза у лабораторных животных, отражающего получение полной клинической характеристики гипотиреоидного состояния.

Способ диагностики экспериментального гипотиреоза позволяет получить новый технический эффект - получение достоверной модели гипотиреоза, наиболее полно отражающей суть патофизиологических сдвигов в эксперименте, а также повышение эффективности исследований за счет экономии медикаментозных, лабораторно-диагностических средств и биологического материала.

Указанный технический эффект достигается тем, что предлагается способ диагностики экспериментального гипотиреоза у лабораторных животных, вызываемого путем перорального введения тиреостатика, включающий измерение температуры тела с последующим определением функциональной активности щитовидной железы, отличающийся тем, что дополнительно исследуют суточные ритмы терморегуляции путем измерения температуры тела в 07⁰⁰, 11⁰⁰, 15⁰⁰, 19⁰⁰, 23⁰⁰ и 07⁰⁰ ч с периодичностью, например, не менее одного раза в неделю. При достижении у экспериментальных животных признака устойчивого снижения показателей температуры тела во все фазы ритма по отношению к аналогичным показателям контрольной группы устанавливают диагноз «экспериментальный гипотиреоз», что в свою очередь позволяет приступить к следующим этапам исследования.

Известно, что гипотермия расценивается как диагностический признак гипотиреоза. В ныне известных способах диагностики гипотиреоза прибегают к однократному измерению значений температуры тела в течение суток, что снижает точность диагностики. Например, значения температуры тела у подопытных животных, в частности у крыс, претерпевают значительные колебания в течение суток. Более того, размах этих колебаний у здоровых животных контрольной группы может достигать 3°С, то есть в пределах от 35,9°С до 38,9°С - фиг.1.

Как видно из фиг.1, значения температуры тела у здоровой крысы в одних случаях можно рассчитывать как признак гипотиреоза (35,9°С при измерении в 07⁰⁰ ч), а в других - как признак гипертиреоза (38,7 и 38,9°С при измерении соответственно в 19⁰⁰ ч и 23⁰⁰ ч).

Неприемлем в диагностическом плане и вариант однократного измерения температуры тела в строго определенное время суток, так как акрофазы и батифазы ритма могут смещаться в течение суток.

В свою очередь применение принципа хронобиологических исследований в заявляемом способе повышает точность диагностики и позволяет:

- во-первых, своевременно принять решение об отмене дальнейшего введения тиреостатика и, следовательно, предотвратить передозировку и связанные с ней побочные эффекты;

- во-вторых, принять решение о необходимости продолжения введения тиреостатика для получения полной классической картины и лабораторных данных, подтверждающих завершение текущего этапа эксперимента;

- в-третьих, гарантировать получение в научных целях дополнительных лабораторных данных, подтверждающих достоверность экспериментальной модели гипотиреоза;

- в-четвертых, предотвратить на начальном этапе эксперимента развитие осложнений, приводящих к выбраковке и летальному исходу лабораторных животных;

- в-пятых, в целом повысить эффективность научных исследований за счет экономии медикаментозных, лабораторно-диагностических средств и рационального использования биологического материала.

Способ осуществляется следующим образом. Независимо от выбранной экспериментатором методики введения в гипотиреоз, как известно, отличающихся среднесуточной дозировкой и продолжительностью введения тиреостатиков, дополнительно, с периодичностью, например, не менее одного раза в неделю, исследуют суточные ритмы терморегуляции путем измерения температуры тела в 07⁰⁰, 11⁰⁰, 15⁰⁰, 19⁰⁰, 23⁰⁰ и 07⁰⁰ часов. При этом устойчивое снижение значений температуры тела на 0,3-1,0°С во все фазы ритма у крыс экспериментальной группы в сравнении с контрольной, как установлено, является дополнительным диагностическим критерием получения достоверной модели гипотиреоза.

Проведенные биоритмологические исследования позволяют сделать заключение о завершении 1-го этапа эксперимента - получение модели гипотиреоза и в свою очередь перейти к следующему после проведения частичного забоя животных для получения комплекса клинико-лабораторных данных - общий анализ и биохимия крови, измерение массо-ростовых показателей, определение уровня содержания в сыворотке крови тиреоидных гормонов - ТТГ, Т₄, Т₃, патоморфология органов и тканей убойных животных.

И, наоборот, при получении иных соотношений температурных кривых, что может выразиться либо сплошным, либо частичным превышением анализируемых показателей экспериментальной группы над контрольной, приходят к заключению о незавершенности 1-го этапа и необходимости продолжения курса введения тиреостатика.

Изобретение характеризуют следующие примеры реализации способа диагностики экспериментального гипотиреоза.

Пример 1 - диагностическая значимость хронобиологических исследований в установлении признака недостоверности экспериментальной модели гипотиреоза при малых суточных дозах тиреостатика. Моделирование гипотиреоза на половозрелых крысах-самцах массой 180-220 г путем внутрижелудочного введения мерказолила в малых дозах из расчета 1 мг/100 г массы тела животного. Все животные разделены на 2 группы по 12 крыс в каждой: 1-я - контрольная, 2-я - экспериментальная. Начиная с 8-го дня от начала эксперимента, исследовали суточные ритмы терморегуляции путем измерения температуры тела в 07⁰⁰, 11⁰⁰, 15⁰⁰, 19⁰⁰, 23⁰⁰ и 07⁰⁰ ч - таблица 1, фиг.2. Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики с использованием показателя точность опыта, Р.

Таблица 1
Температура тела крыс на 8-е сутки при введении мерказолила в среднесуточной дозировке 1 мг/100 г; (М±m), n=12Время суток (час)7⁰⁰11⁰⁰15⁰⁰19⁰⁰23⁰⁰7⁰⁰Температура тела, °С (контрольная группа)38,4±0,0736,9±0,1137,8±0,1537,0±0,0938,0±0,0938,0±0,07Показатель точности опыта, Р, %0,190,300,400,250,250,19Температура тела, °С (экспериментальная группа)37,4±0,0936,5±0,1437,0±0,1637,0±0,1036,9±0,2237,0±0,18Показатель точности опыта, Р, %0,250,390,450,450,590,49

Как видно из фиг.2, в данном случае отсутствует «признак устойчивого снижения показателей контрольной группы». Так, значения показателей контрольной и экспериментальной групп на 19⁰⁰ ч совпадают и составляют 37,0°С.

На основании вышеизложенного сделан вывод о невозможности постановки диагноза «экспериментальный гипотиреоз» и, следовательно, незавершенности текущего этапа эксперимента. Принято решение о продолжении курса введения мерказолила.

Повторные исследования суточных ритмов терморегуляции были проведены через неделю, т.е. на 15-е сутки от начала эксперимента - данные представлены таблице 2 и на фиг.3.

Как видно из фиг.3, и в эти сроки не был достигнут «признак устойчивого снижения показателей температуры тела во все фазы ритма по отношению к аналогичным показателям контрольной группы», что также не позволило выставить диагноз: «экспериментальный гипотиреоз».

Таблица 2
Температура тела крыс на 15-е сутки при введении мерказолила в среднесуточной дозировке 1 мг/100 г; (М±m), n=12Время суток, ч7⁰⁰11⁰⁰15⁰⁰19⁰⁰23⁰⁰7⁰⁰Температура тела, °С (контрольная группа)37,1±0,1138,0±0,0737,3±0,1538,9±0,1036,9±0,0937,4±0,14Показатель точности опыта, Р, %0,310,200,410,280,240,37Температура тела, °С (экспериментальная группа)36,1±0,0836,1±0,1237,3±,0837,7±0,1335,8±0,1735,9±0,14Показатель точности опыта, Р, %0,230,330,220,360,480,41

Таблица 3
Уровень содержания Т₃, сТ₄ и ТТГ в сыворотке крови лабораторных крыс при экспериментальном гипотиреозе (М±m)Названия групп животныхКоличество животных в группеПродолжительность опыта, суткиТ₃ (н/моль/л)С Т₄ (п/моль/л)ТТГ мкМЕ/млКонтрольная12-1,88±0,1316,68±0,500,124±0,01Экспериментальная №4 - мерказолил 1 мг/100 г12-* 2,32±0,07* 8,19±0,08* 0,216±0,01* различие с контролем статистически значимо (Р<0,05)

С целью подтверждения диагностической ценности хронобиологических исследований на 16-е сутки эксперимента произвели декапитацию животных с последующим определением уровней содержания тиреоидных гормонов - 3,5,3' - трийодтиронина (Т₃), свободного тироксина (сТ₄) и тиреотропного гормона (ТТГ). Данные представлены в таблице 3.

Как и следовало ожидать, результаты иммуноферментного анализа сыворотки крови подтвердили сделанный на основании биоритмологических исследований прогноз о получении недостоверной модели гипотиреоза. Так, концентрация 3,5,3' - трийодтиронина (Т₃) в сыворотке крови крыс экспериментальной группы составляла 2,32±0,07 н/моль/л против 1,88±0,13 н/моль/л у контрольных животных, что уже не позволяет установить достоверный диагноз «экспериментальный гипотиреоз».

Пример 2 - диагностическая значимость хронобиологических исследований в установлении признака недостоверности экспериментальной модели гипотиреоза при высоких суточных дозах тиреостатика. Моделирование гипотиреоза на половозрелых крысах-самцах массой 180-220 г также путем внутрижелудочного введения мерказолила в уже высоких суточных дозах из расчета 20 мг/100 г массы тела животного. Все животные разделены на 2 группы по 12 в каждой: 1-я - контрольная; 2-я - экспериментальная.

Начиная с 8-го дня от начала эксперимента, исследовали суточные ритмы терморегуляции по схеме путем измерения температуры тела в 07⁰⁰, 11⁰⁰, 15⁰⁰, 19⁰⁰, 23⁰⁰ и 07⁰⁰ ч. Данные представлены на фиг.4 и в таблице 4.

Как видно из фиг.4, в данном варианте опыта отсутствует «признак устойчивого снижения показателей температуры тела во все фазы ритма по отношению к аналогичным показателям контрольной группы» и, более того, присутствует признак десинхроноза ритмов: в 11⁰⁰ ч показатель температуры тела экспериментальных животных (37,5°С) значительно превышает аналогичный показатель у контрольной группы (37°С); батифаза (наименьшее значение изучаемого показателя) у экспериментальных животных смещена на 23⁰⁰ ч, т.е. нарушена структура суточных ритмов терморегуляции.

Таблица 4
Температура тела крыс на 8-е сутки при введении мерказолила в среднесуточной дозировке 20 мг/100 г; (М±m), n=12Время суток (час)7⁰⁰11⁰⁰15⁰⁰19⁰⁰23⁰⁰7⁰⁰Температура тела, °С (контрольная группа)38,0±0,0737,0±0,0636,9±0,1537,6±0,1137,2±0,0837,2±0,14Показатель точности опыта, Р, %0,190,170,420,300,240,39Температура тела, °С (экспериментальная группа)36,9±0,3937,5±0,1636,7±0,1136,8±0,1436,3±0,1336,9±0,13Показатель точности опыта, Р, %1,060,440,310,380,360,35

Данные биоритмологических исследований свидетельствовали о значительных патофизиологических сдвигах в организме животных, что не позволяет в данном варианте говорить о получении достоверной модели экспериментального гипотиреоза. В данной группе летальный исход отмечали у 3-х крыс, кроме того, наблюдали практически у всех животных такие осложнения, как алопеция, носовые кровотечения, развитие шокового состояния, выпадение зубов, в частности нижних резцов.

Действительно, при применении столь высоких доз меразолила снижается уровень содержания тиреоидных гормонов (Т₃, сТ₄), повышается концентрация ТТГ, но с точки зрения экспериментальной патофизиологии в данном случае нельзя говорить о получении достоверной модели гипотиреоза в силу многочисленных осложнений, развивающихся в результате срыва защитно-приспособительных механизмов в организме животных - таблица 5.

Таблица 5
Уровень содержания Т₃, сТ₄ и ТТГ в сыворотке крови лабораторных крыс при экспериментальном гипотиреозе (М±m)Названия групп животныхКоличество животных в группеПродолжительность опыта в суткахТ₃ (н/моль/л)сТ₄ (п/моль/л)ТТГ, мкМЕ/млКонтрольная12-1,88±0,1316,68±0,500,124±0,01Экспериментальная №1 - мерказолил 20 мг/100 г  ***9-1,44±0,106,0±0,230,196±0,02* различие с контролем статистически значимо (Р<0,05)

Таким образом, выявление нарушений в суточных ритмах терморегуляции позволило диагностировать получение недостоверной модели гипотиреоза.

Пример 3 - диагностическая значимость хронобиологических исследований в установлении признака достоверности экспериментальной модели гипотиреоза при оптимальных дозах тиреостатика. Моделирование гипотиреоза на половозрелых крысах-самцах массой 180...220 г путем внутрижелудочного введения мерказолила в оптимальных дозах из расчета 5 мг/100 г массы тела животного. Все животные были разделены на 2 группы по 12 в каждой: 1-я - контрольная, 2-я - экспериментальная. Начиная с 8-го дня от начала эксперимента, исследовали суточные ритмы терморегуляции путем измерения температуры тела в 07⁰⁰, 11⁰⁰, 15⁰⁰, 19⁰⁰, 23⁰⁰ и 07⁰⁰ часов. Результаты исследований представлены на фиг.5 и в таблице 6.

Таблица 6
Температура тела крыс на 8-е сутки при введении мерказолила в среднесуточной дозировке 5 мг/100 г; (М±m), n=12Время суток (час)7⁰⁰11⁰⁰15⁰⁰19⁰⁰23⁰⁰7⁰⁰Температура тела (°С) (контрольная группа)38,4±0,0736,9±0,1137,8±0,1537,1±0,0938,0±0,0938,0±0,07Показатель точности опыта (Р) в %0,190,300,400,250,250,19Температура тела (°С) (экспериментальная группа)36,7±0,1235,9±0,1236,0±0,1337,3±0,1736,2±0,1136,1±0,13Показатель точности опыта (Р) в %0,330,340,360,460,310,30

Как видно из фиг.5, на 8-е сутки эксперимента еще не представляется возможным установить диагноз «экспериментальный гипотиреоз» и перейти к следующему этапу исследования, так как не был достигнут у экспериментальных животных признак устойчивого снижения показателей температуры тела во все фазы ритма по отношению к аналогичным показателям контрольной группы

В связи с вышеизложенным было принято решение о необходимости продолжения курса введения тиреостатика еще в течение семи суток.

Как показывает анализ соотношения температурных кривых, и в эти сроки не представляется возможным установить диагноз «экспериментальный гипотиреоз».

Через неделю, то есть на 15-е сутки от начала эксперимента, проведено повторное исследование суточных ритмов терморегуляции. Данные представлены на фиг.6 и в таблице 7.

Таблица 7
Температура тела крыс на 15-е сутки при введении мерказолила в среднесуточной дозировке 5 мг/100 г; (М±m), n=12Время суток, ч.7⁰⁰11⁰⁰15⁰⁰19⁰⁰23⁰⁰7⁰⁰Температура тела, °С (контрольная группа)37,4±0,1237,3±0,036,9±0,1137,9±0,137,5±0,1037,1±0,11Показатель точности опыта, Р, %0,340,200,300,380,280,31Температура тела, °С (экспериментальная группа)35,3±0,1136,8±0,1236,9±0,0837,0±0,0735,2±0,1534,7±0,06Показатель точности опыта, Р, %0,320,340,230,210,420,18

Следовательно, было продолжено введение тиреостатика. Ровно через неделю, то есть на 22-е сутки от начала эксперимента, повторили исследование суточных ритмов терморегуляции.

Таблица 8
Температура тела крыс на 22-е сутки при введении мерказолила в среднесуточной дозировке 5 мг/100 г; (М±m), n=12Время суток, ч23⁰⁰7⁰⁰11⁰⁰15⁰⁰19⁰⁰23⁰⁰7⁰⁰Температура тела, °С (контрольная группа)37,2±0,0837,9±0,1336,8±0,1038,1±0,1038,3±0,0537,4±0,1237,0±0,16Показатель точности опыта, Р, %0,230,340,290,260,150,330,45Температура тела, °С (экспериментальная группа)35,9±0,0735,9±0,1135,8±0,0937,2±0,0937,2±0,0735,9±0,0935,5±0,07Показатель точности опыта, Р, %0,210,330,270,240,200,270,19

Согласно анализа данных, представленных на фиг.7 и в таблице 8, был выставлен диагноз «экспериментальный гипотиреоз» и, следовательно, сделано заключение о завершении текущего этапа эксперимента и возможности перехода к следующему. В данном варианте эксперимента был получен признак устойчивого снижения показателей температуры тела во все фазы ритма по отношению к аналогичным показателям контрольной группы.

Результаты иммуноферментного анализа сыворотки крови на содержание тиреоидных гормонов однозначно подтвердили (таблица 9) правомерность сделанного заключения о получении достоверной модели гипотиреоза.

Как видно из таблицы 9, у экспериментальных животных снижен уровень тиреоидных гормонов (Т₃ и Т₄) в сравнении с аналогичными показателями контрольной группы и наоборот, повышен уровень содержания тиреотропного гормона (ТТГ), что объективно подтверждает ранее выставленный диагноз.

Таблица 9
Уровень содержания Т₃, с Т₄ и ТТГ в сыворотке крови лабораторных крыс при экспериментальном гипотиреозе (M±m)Названия групп животныхКол-во животных в группеПродолжительность опыта, суткиТ₃(н/моль/л)c Т₄ (п/моль/л)ТТГ мкМЕ/млКонтрольная12-1,88±0,1316,68±0,500,124±0,01Экспериментальная №3, мерказолил 5 мг/100 г  ***12-1,6±0,023,4±0,120,164±0,01* различие с контролем статистически значимо (Р<0,05)

Литература, принятая во внимание при экспертизе:

1. Августинович М.С., Детюк Е.С. Морфо-цитохимические особенности гонад потомства при сниженной функции щитовидной железы самки//Труды Крымского мед. ин-та - 1986. - Т.109. - С.119-121.

2. Кузьмак Н.И. Влияние тиреостатических препаратов и тиреоидэктомии на содержание сиаловых кислот в сыворотке крови и печени у крыс //Вопросы мед. химии. - 1978. - Т.24, в.1. - С.52-56.

3. Потемкин В.В. Эндокринология. - М.: Медицина, 1987. - С.137-153.

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики экспериментального гипотиреоза у лабораторных животных. Измеряют температуру тела с последующим определением функциональной активности щитовидной железы. Дополнительно, с периодичностью не менее одного раза в неделю, исследуют суточные ритмы терморегуляции путем измерения температуры тела в 07⁰⁰, 11⁰⁰, 15⁰⁰, 19⁰⁰, 23⁰⁰ и 07⁰⁰ часов. При достижении у экспериментальных животных признака устойчивого снижения показателей температуры тела во все фазы ритма по отношению к аналогичным показателям контрольной группы устанавливают диагноз «экспериментальный гипотиреоз». Способ позволяет получить достоверную модель гипотиреоза, наиболее полно отражающую суть патофизиологических сдвигов. 9 табл., 7 ил.

Способ диагностики экспериментального гипотиреоза у лабораторных животных, включающий измерение температуры тела с последующим определением функциональной активности щитовидной железы, отличающийся тем, что дополнительно, с периодичностью, например, не менее одного раза в неделю, исследуют суточные ритмы терморегуляции путем измерения температуры тела в 07⁰⁰, 11⁰⁰, 15⁰⁰, 19⁰⁰, 23⁰⁰ и 07⁰⁰ часов, и при достижении у экспериментальных животных признака устойчивого снижения показателей температуры тела во все фазы ритма по отношению к аналогичным показателям контрольной группы устанавливают диагноз «экспериментальный гипотиреоз».