СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЮТЕНУРИНА Российский патент 2007 года по МПК A61K38/18 A61K36/62 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способам получения алкалоидов кубышки желтой (Nuphar lutea (L.) Smith - (С.К.Черепанов. Свод дополнений и изменений к "Флоре СССР" (т.т.I-XXX), Л., Наука, 1973) или (Nuphar luteum - Index kewensis, II, 1960) семейства кувшинковых (Nymphaceae). Препарат Лютенурин, получаемый из корневищ этого растения, обладающий протистоцидным и сперматоцидным действием, активным в отношении трихомонад, патогенных грибов, оказывающий бактериостатическое действие в отношении грамположительных микроорганизмов, используется для лечения урогенитальных заболеваний, в частности, для лечения трихомонадных кольпитов и уретридов, а также в качестве контрацептивного средства (Я.А.Алешкина, С.А.Вичканова, М.А.Рубинчик, Т.Н.Ильинская. Препарат лютенурин. Авт.свид. 145858, 04.05.1967, Бюл. №10, 28.07.1967; Лютенурин, Lutenurinum, ФС 42-948-75; Лютенурин, Lutenurin, Lutenurine, Проспект ЦБНТИ МП, 89 с.; Лютенурин, в кн.: Полный современный справочник лекарственных препаратов, 2 изд., С.А.Кржижановский и М.Б.Вититнова, Изд. Дом "Ринол Классик", М., 2002, с.950). Препарат лютенурин представляет собой смесь гидрохлоридов, преимущественно димерных серусодержащих хинолизидиновых алкалоидов: тиобинуфаридина, неотиобинуфаридина, нуфлеина. Действующим началом препарата является алкалоид нуфлеин (дигидрокси-тиобинуфаридин) (Т.Н.Ильинская, А.Д.Кузовков, Т.Г.Монахова. Химическое изучение алкалоидов кубышки желтой, в кн.: "Лекарственные растения. Химия", Том 15, ВИЛАР, под ред. А.И.Баньковского, "Колос", Москва, 1969, с.322-333).

Известен способ получения лютенурина, который заключается в следующем: высушенные и измельченные корневища кубышки желтой, содержащие 0,4% суммы алкалоидов, обрабатывают гидратом окиси аммония, экстрагируют дихлорэтаном, затем реэкстрагируют серной кислотой, подщелачивают водную фазу гидратом окиси аммония, извлекают алкалоиды эфиром, после сушки экстракта поташом его концентрируют, осаждают примеси петролейным эфиром, а затем получают гидрохлориды насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом, целевой продукт отделяют, промывают петролейным эфиром, сушат и просеивают через сито (Т.Н.Ильинская, А.Д.Кузовков, С.А.Вичканова, М.А.Рубинчик, Л.П.Толстых, Я.А.Алешкина. Способ получения лютенурина, Авт.свид. 216920, 26.04.1968, Бюл. №15; В.П.Захаров, Н.И.Либизов, Х.А.Асланов, Лютенурин, в кн.: "Лекарственные вещества из растений и способы их производства", Ташкент, ФАН Уз ССР, 1980, с.10-12). Выход 65%. Этот способ выбран в качестве прототипа.

Недостатками способа получения лютенурина является использование токсичного растворителя (дихлорэтана), а также большие потери целевых алкалоидов в процессе очистки.

С целью упрощения технологии получения препарата и повышения его выхода предлагается новый способ, который заключается в следующем: высушенные и измельченные корневища кубышки желтой экстрагируют водно-спиртовым раствором (предпочтительно, водным этанолом или изопропанолом), подкисленным фосфорной кислотой, фильтруют, удаляют органический растворитель в вакууме, затем водно-кислотный кубовый остаток обрабатывают бутанолом, перемешивают, органическую фазу отделяют, промывают водой, объединенные кислотные экстракты нейтрализуют гидратом окиси аммония, обрабатывают смесью карбоната кальция с водой, фильтруют, осадок промывают ацетоном и фильтрат упаривают в вакууме, полученную техническую сумму оснований очищают растворением в разбавленной серной кислоте, подщелачиванием гидратом окиси аммония, экстракцией толуолом, промыванием водой органического слоя, сушкой сульфатом натрия и упариванием. Полученную сумму алкалоидов (0,3-0,4%) превращают в гидрохлориды описанным в прототипе способом. Выход целевого продукта 0,35%.

Способ прост в исполнении, увеличивает выход целевого продукта, позволяет исключить токсичные галогенсодержащие растворители на головной стадии экстракции, сокращает общую длительность технологического процесса по сравнению с прототипом, исключает образование эмульсий при жидкостной экстракции и упрощает последующую очистку целевого продукта.

Способ получения приведен в прилагаемых примерах 1-3.

Пример 1. 200 г высушенных (с влажностью 10,7%) и измельченных корневищ кубышки желтой экстрагируют при перемешивании (3 часа при 40-45°С) водно-спиртовым раствором фосфорной кислоты, полученным смешением 630 мл 96% спирта (60%) и 445 мл 5%-ной фосфорной кислоты (40%), при соотношении сырье - экстрагент (1:7), фильтруют в вакууме. Операцию повторяют 3 раза, прибавляя экстрагент в количестве, равном объему слитого экстракта, удаляют органический растворитель в вакууме, водно-кислотные кубовые остатки объемом 320-330 мл объединяют, затем образовавшуюся суспензию смешивают с бутанолом (1:3 от общего объема раствора), настаивают 1 ч, бутанол отделяют, операцию повторяют 2 раза, (при этом выпавший мелкий осадок переходит в раствор), водную фазу фильтруют через вату, затем еще один раз встряхивают с бутанолом, объединенную органическую фазу отделяют и промывают водой 4 раза. Объединенные кислотные экстракты объемом 1600 мл нейтрализуют гидратом окиси аммония до рН 8, прибавляют смесь 100 г карбоната кальция и 20 мл воды, перемешивают 5-10 мин, фильтруют через воронку Бюхнера, водный фильтрат далее не используют, а осадок тщательно отделяют, промывают ацетоном (3 раза по 100 мл) и фильтрат упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в разбавленной серной кислоте (около 20 мл), подщелачивают гидратом окиси аммония (рН 8), экстрагируют толуолом, органический слой промывают водой, сушат сульфатом натрия и упаривают. Полученную сумму оснований алкалоидов (0,3-0,4%) превращают в гидрохлориды описанным в прототипе способом. Выход целевого гидрохлорида 0,35%.

Продукт удовлетворяет требованиям ФС 1975 на лютенурин по содержанию в нем активного компонента (нуфлеина дигидрохлорида) (не менее 52%), содержанию в препарате нуфлеина дигидрохлорида (по данным ЯМР-спектра в сравнении с заведомым образцом серийного препарата), а также по антимикробной активности образца в отношении Staphyllococcus aureus, изученной методом серийных разведений, которая была равной по активности заведомого препарата (0,98 мкг/мл).

Пример 2. Процесс осуществляют как в примере 1, отличающийся тем, что в качестве экстрагента на головной стадии используют 20% водный этиловый спирт, подкисленный 5%-ной фосфорной кислотой. Выход основания 0,3-0,4%. Выход гидрохлорида 0,35%.

Пример 3. Процесс осуществляют как в примере 1, отличающийся тем, что в качестве экстрагента на головной стадии используют вместо водного этилового спирта 60%-ный водный изопропиловый спирт, подкисленный 5%-ной фосфорной кислотой. Выход основания 0,4-0,6%. Выход гидрохлорида 0,5%.

Изучение антимикробной активности лютенурина, полученного по заявляемому способу в сравнении с прототипом

В лаборатории фармакологии и химиотерапии ВИЛАР была изучена антимикробная активность лютенурина, полученного по заявляемому способу (алкалоиды в виде основания и в виде соли) в сравнении с прототипом.

Изучение бактериостатической активности в опытах in vitro

При изучении бактериостатической активности в опытах in vitro использовали метод двукратных серийных разведений препарата в жидких питательных средах.

Микроорганизмы

В качестве патогенного тест-микроорганизма использовали грамположительный кокк - Staphylococcus aureus 209-P.

Среды

При определении бактериостатической активности образцов лютенурина использовали мясо-пептонный бульон (МПБ).

Методика исследований

Бактериостатическую активность в опытах in vitro изучали методом серийных разведений препарата в жидкой питательной среде (МПБ). При изучении образцов лютенурина в первую пробирку, содержащую 4 мг препарата, добавляли питательную среду в количестве 4 мл для получения первоначальной концентрации 1000 мкг/мл и затем, путем двукратных разведений, готовили ряд убывающих концетраций образцов лютенурина. Последняя пробирка с чистой средой (без добавления лютенурина) служила контролем.

После этого все пробирки (опытные и контрольные) засевали тест-культурой микроорганизма.

Взвесь тест-культуры готовили в изотоническом растворе натрия хлорида по бактериальному стандарту мутности 10 ЕД (10⁹ микробных тел /мл), затем в каждую пробирку вносили по 0,2 мл взвеси, содержащей 10⁴ микробных тел/мл. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч.

Опыты проводили в трех повторностях.

Учет результатов

Антибактериальный эффект изучаемых образцов лютенурина определяли по минимальной ингибирующей рост бактерий концентрации (МИК), при которой визуально не наблюдали роста микроорганизмов.

Результаты исследования представлены в таблице.

Результаты исследования

В результате исследований установлена (см.табл.) высокая бактериостатическая активность всех изученных образцов лютенурина в концентрации 1 мкг/мл в отношении изученного штамма Staphilococcus aureus 209-Р. При этом следует отметить, что активность лютенурина, полученного по заявляемому способу (алкалоиды в виде основания и алкалоиды в виде соли), по активности не отличается от прототипа.

Таблица
Бактериостатическая активность образцов лютенуринаОбразцы лютенуринаАктивность МИК (мкг/мл)Сумма алкалоидов (алкалоиды в виде основания)1,0Сумма алкалоидов (алкалоиды в виде соли)1,0Лютенурин (прототип)1,0

ВЫВОДЫ

В результате проведенных исследований установлено следующее.

1. Изучена антибактериальная активность образцов лотенурина, полученного по заявляемому способу (алкалоиды в виде основания и алкалоиды в виде соли) в сравнении с прототипом.

2. Установлена высокая антибактериальная активность всех изученных

образцов лютенурина в концентрации 1 мкг/мл в отношении Staphylococcus aureus 209-P.

3. Активность лютенурина, полученного по заявляемому способу (алкалоиды в виде основали и алкалоиды в виде соли), не отличается по активности от прототипа.

4. На основании полученных результатов можно сделать вывод о целесообразности получения лютенурина по заявляемому способу.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вичканова С.А. Ингибиторы микроорганизмов среди природных веществ растительного происхождения. // Дисс. док. наук. М., 1981.

2. Вичканова С.А., Макарова Л.В., Рубинчик М.А., Адгина В.В. // К вопросу об изучении антимикробных свойств эфирных масел. «Лекарственные растения», т.14. «Фармакология и химиотерапия», 1972.

3. Милованова С.Н., Степанищева З.Г. // Методы экспериментальной химиотерапии. М., 1971.

4. Першин Г.Н. // Методы экспериментальной химиотерапии. М., 1971.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Корневища с корнями кубышки желтой экстрагируют кислым 20-60%-ным водно-спиртовым раствором, предпочтительно этиловым или изопропиловым, подкисленным 5%-ной фосфорной кислотой. Проводят фильтрование, удаление органического растворителя в вакууме, нейтрализацию углекислым кальцием, отделение твердой фазы, обработку ее ацетоном, фильтрацию, упаривание, очистку суммарной фракции алкалоидов через образование соответствующих сульфатов и оснований, экстракцию оснований толуолом и получение гидрохлоридов алкалоидов насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом. Изобретение позволяет повысить выход продукта. 1 табл.

Способ получения лютенурина из корневищ кубышки желтой (Nuphar Lutea (L.), заключающийся в экстракции сырья, извлечении алкалоидов и получении гидрохлоридов насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом, отличающийся тем, что экстракцию сырья на головной стадии осуществляют 20-60%-ным водным алифатическим спиртом, предпочтительно этиловым или изопропиловым, подкисленным 5%-ной фосфорной кислотой, фильтруют, удаляют органический растворитель, водный кубовый остаток после отгонки спирта обрабатывают бутанолом, который затем отделяют, водно-кислотную фазу после нейтрализации до рН 8 обрабатывают карбонатом кальция для удаления фосфат-ионов, выпавший осадок фильтруют, промывают ацетоном и фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в разбавленной серной кислоте, подщелачивают до рН 8, экстрагируют основания алкалоидов толуолом, упаривают экстрагент и получают гидрохлориды.