СПОСОБ РЕКУЛЬТИВАЦИИ ОТБЕЛИВАЮЩЕЙ ЗЕМЛИ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЕПРОДУКТАМИ Российский патент 2007 года по МПК B09C1/10 C12N1/26 C12R1/65 C12R1/08 C12R1/06 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к охране почвенных ресурсов от загрязнения нефтепродуктами.

В настоящее время предприятия нефтеперерабатывающего комплекса, использующие для контактной доочистки базовых масел (удаления смолистых соединений и полициклических ароматических углеводородов) отбеливающую землю, вынуждены отходы своего производства складировать в виде отвалов, тем самым усугубляя экологическую обстановку и занимая дополнительно отчуждаемые территории.

Известны различные биологические способы рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, основанные на интродукции в такие почвы специализированных микроорганизмов, предварительно выделенных из различных загрязненных источников или генетически модифицированных. Основными агентами биодеструкции нефти и нефтепродуктов являются бактерии. Объясняется это тем, что использование углеводородов в своей жизнедеятельности среди бактерий распространено достаточно широко.

Ряд исследователей показали, что бактерии рода Rhodococcus являются перспективными для создания на их основе препаратов по биодеструкции нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву [1, 2].

Спорообразующие бактерии также широко используются для создания препаратов, способствующих очищению почвы и воды от контаминации нефтью [3-5].

Недостатками этих препаратов является низкая эффективность по рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, основную часть которых составляют смолистые вещества и полициклические ароматические соединения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, где для активизации процесса биодеструкции нефтепродуктов используют биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 [6].

Недостатком известного способа является сравнительно низкая степень биодеструкции нефтепродуктов.

Технической задачей предлагаемого способа является повышение эффективности биодеградации нефтепродуктов, содержащихся в отбеливающей земле.

Поставленная задача решается путем внесения в отбеливающую землю добавки, содержащей кроме биомассы консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 биомассу аэробных азотфиксирующих микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4, вносимой в массовом соотношении 1:1 к консорциуму нефтеокисляющих микроорганизмов.

Указанный штамм микроорганизмов Azotobacter vinelandii известен в качестве основы биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая [7].

Примеры конкретного выполнения.

В лабораторных испытаниях способа биологической рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, использовали отбеливающую землю, отобранную с отвалов ОАО «Орскнефтеоргсинтез», биомассу консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species, полученную при их совместной ферментации, и биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii.

Консорциум микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 (биопрепарат «Ленойл») выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, г/л: Na₂СО₃ - 0,1; CaCl₂ - 0,01; MnSO₄·7H₂O - 0,02; FeSO₄·7H₂O - 0,02; NaH₂PO₄ - 1,5; К₂HPO₄ - 1,0; MgSO₄·7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 2,0; вода дистиллированная до 1000 мл. В качестве единственного источника углерода используется дизельное топливо, процесс ферментации проводят при комнатной температуре до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости, равного 10⁹ КОЕ/мл.

Биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 (биопрепарат «Азолен») выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, г/л: KH₂PO₄ - 0,2; К₂HPO₄ - 0,8; CaSO₄·2H₂O - 0,1; MgSO₄·7H₂O - 0,2; FeCl₃ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,01; дрожжевой экстракт - 0,5; сахароза - 20 г; вода дистиллированная до 1000 мл. Процесс ферментации проводят при комнатной температуре до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости, равного 10⁹ КОЕ/мл.

Для оценки интенсивности разложения нефтепродуктов использовали показатель остаточного содержания нефтепродуктов в отбеливающей земле.

Определение остаточного содержания нефтепродуктов проводили спектрофотометрическим и весовым методами [8]. По первому из них пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и переносили в аппарат Сокслета. Экстракцию проводили 120-150 мл гексана в течение 2-3 часов при температуре кипения гексана (69°С). Концентрацию углеводородов в пробе определяли по оптической плотности экстракта на спектрофотометре СФ-46 при длине волны, на которой данная смесь углеводородов имела максимальный пик поглощения. Максимальный пик поглощения определяли на спектрофотометре SPECORD UF-VIS. По весовому методу пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и взвешивали на электронных весах. Проэкстрагированные пробы вместе с патронами высушивали в жарочном шкафу при температуре 100-120°С и снова взвешивали на электронных весах. По разнице в весе проб до и после экстракции определяли содержание остаточных нефтепродуктов.

Численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефтепродуктов, определяли посевом почвенной суспензии методом разведений на плотные питательные среды [9]: бактерий, усваивающих органический азот - на мясопептонном агаре (МПА), олигонитрофилов - на питательной среде Эшби, микроскопических грибов (микромицетов) - на среде Чапека и углеводородокисляющих микроорганизмов - на среде Цукамуры, где в качестве источника углерода была использована стерильная смесь углеводородов, полученная после экстракции гексаном загрязненной отбеливающей земли.

Повторность опытов - трехкратная.

Схема лабораторного (модельного) опыта по рекультивации отбеливающей земли: в отбеливающую землю, содержащую 181 г/кг остаточных углеводородов, вносили минеральные удобрения (нитрофоска из расчета 0,25 г/кг субстрата), биопрепарат «Ленойл» из расчета к отбеливающей земле и биопрепарат «Азолен» в массовом соотношении к биопрепарату «Ленойл», составляющем 1:1, 1,25:1 и 0,75:1. Повторность опытов - трехкратная, длительность экспериментов - 150 сут. Влажность в сосудах в течение всего срока инкубации поддерживали на уровне 60%, температуру - 20-25°С. Отбор проб отбеливающей земли осуществляли через 30 суток.

Результаты испытания предлагаемого способа рекультивации отбеливающей земли показали, что внесение консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species с дополнительной добавкой биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 значительно повышает эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов в отбеливающей земле (табл.1). Через 150 суток инкубации степень снижения содержания нефтепродуктов по предлагаемому способу составила 81,3 мас.%. Применение биопрепарата «Ленойл» без внесения биопрепарата «Азолен» в условиях опыта оказалось менее эффективным по сравнению с предложенным техническим решением, а степень биодеградации нефтепродуктов составила всего 69,3 мас.%. При массовом соотношении биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 к биомассе консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов, составляющим 0,75:1, эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов снижалась, а при соотношении 1,25:1 величина степени биодеградации практически не отличалась от соответствующего показателя, достигнутого при массовом соотношении, равном 1:1.

Внесение биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 способствует значительному увеличению численности почвенных микроорганизмов, принимающих участие в трансформации нефтепродуктов, загрязняющих отбеливающую землю - гетеротрофных бактерий, растущих на МПА, олигонитрофилов, углеводородокисляющих бактерий и микромицетов (табл.2-5). В процессе своей жизнедеятельности бактерии Azotobacter vinelandii ИБ 4 секретируют в окружающую среду различные биологически активные вещества, в том числе цитокинины [7], и, по-видимому, биомасса этих микроорганизмов играет роль эффективного биологического удобрения, стимулирующего развитие всей микробиоты в нефтезагрязненном объекте.

Таким образом, предлагаемый способ биологической рекультивации отбеливающей земли с применением консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 и дополнительным внесением биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 по сравнению с известным позволяет повысить эффективность процесса биоразложения нефтепродуктов в почве, активизировать микробиологическую активность почвы.

Список литературы

1. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов: А.с. 1805097 СССР, МКИ⁵ С 02 В 3/34, Е 02 В 15/04 // Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н., Зиновьев А.П., Ягафаров И.Р.

2. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений: Пат. 2019527, Россия, МКИ⁵ С 02 F 3/34 // Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В.

3. Штамм бактерий Bacillus sp. - деструктор нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений: Пат. 1784592, СССР, МКИ⁵ С 02 F 3/34 // Астрова Н.Г., Моисеева Л.В., Протченко П.З.

4. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма - деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв //Прикладная биохимия и микробиология. - 1995 - Т. 31, №5. - С.534-539.

5. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами: Пат. 2077397, Россия, МКИ⁶ В 09 С 1/10, С 09 К 3/32 // Андресон Р.К., Хазиев Ф.Х., Дешура B.C., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Новоселова Е.И.

6. Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами: Пат. 2237711, Россия, МКИ⁷ С 12 N 1/20 // Логинов О.Н., Пилюгин В.В., Костюченко В.П., Комаров С.И., Силищев Н.Н.

7. Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая: Пат. 2245918, Россия, МКИ⁷ С 12 N 1/20 // Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф.

8. Груздякова Р.А. Спектрофотометрическое определение нефтепродуктов в пробах почвы // Гигиена и санитария. - 1993. - №3. - С.73-74.

9. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: МГУ. - 1980. - 223 с.

Таблица 1Динамика изменения степени биодеградации углеводородов в отбеливающей землеВарианты опытаСтепень биодеградации углеводородов, мас.%30 сут.60 сут.90 сут.120 сут.150 сут.Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов5,36,113,113,115,3Биопрепарат «Ленойл»32,139,343,155,469,3Биопрепарат «Азолен»23,225,225,728,331,1Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в массовом соотношении 1:142,361,268,179,281,3Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в массовом соотношении 1,25:141,460,066,877,278,6Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в массовом соотношении 0,75:142,361,569,079,381,3

Таблица 2Динамика изменения численности бактерий на МПАВарианты опытаКоличество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы30 сут.60 сут.90 сут.120 сут.150 сут.Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов20±180±1180±690±5130±8Биопрепарат «Ленойл»670±43320±13590±46990±1041120±82Биопрепарат «Азолен»530±50160±31280±35530±72640±47Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»980±682800±631750±1221390±1111180±101

Таблица 3Динамика изменения численности олигонитрофилов на среде ЭшбиВарианты опытаКоличество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы30 сут.60 сут.90 сут.120 сут.150 сут.Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов10±1180±8280±50360±22410±31Биопрепарат «Ленойл»40±6750±92790±103850±68900±68Биопрепарат «Азолен»270±11670±72550±54540±48410±35Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»560±49490±57580±97640±38680±50

Таблица 4Динамика изменения численности углеводородокисляющих бактерий на среде ЦукамурыВарианты опытаКоличество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы30 сут.60 сут.90 сут.120 сут.150 сут.Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов15±250±350±750±630±1Биопрепарат «Ленойл»270±48130±19148±22176±14180±20Биопрепарат «Азолен»160±11180±14241±21270±16270±11Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»310±28200±20267±17281±32310±30

Таблица 5Динамика изменения численности микромицетов на среде ЧапекаВарианты опытаКоличество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы30 сут.60 сут.90 сут.120 сут.150 сут.Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов15±218±213±520±413±2Биопрепарат «Ленойл»53±325±613±133±213±4Биопрепарат «Азолен»33±265±440±550±830±7Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»60±965±660±870±870±20

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к очистке отбеливающей земли от загрязнения нефтепродуктами. Способ включает внесение в почву биомассы консорциума нефтеокисляющих штаммов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 и биомассы штамма бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 при массовом соотношении биомасс, равном 1:1. Изобретение позволяет активировать процесс биодеградации нефтепродуктов, причем степень деградации за 5 месяцев составляет 81%. 5 табл.

Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, путем внесения в почву добавки, содержащей биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3, отличающийся тем, что указанная добавка дополнительно содержит биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4, вносимой в массовом соотношении, равном 1:1 к консорциуму нефтеокисляющих микроорганизмов.