КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ BACILLUS BREVIS И ARTHROBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/08 C12N1/20 C12R1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, касается нового консорциума штаммов бактерий-деструкторов нефти и нефтепродуктов и может быть использовано для очистки почв и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известен штамм Pseudomonas putida 36, обладающий способностью к биодеградации нефти и нефтепродуктов /1/.

Недостатком данного штамма является то, что он растет и утилизирует нефть очень медленно и лишь при высокой температуре (28-42°С). На 30 сутки Pseudomonas putida 36 утилизирует 68-74% нефти.

Известен штамм Bacillus species 739 /2/ и полученный на его основе бактериальный препарат “Бациспецин” /3/, используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Недостатком штамма является его низкая эффективность, особенно в условиях высокого содержания нефти и нефтепродуктов в углеводородсодержащем субстрате.

Технической задачей изобретения является получение консорциума штаммов бактерий, обладающих высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне содержания последних в углеводородсодержащем субстрате.

Полученный консорциум штаммов бактерий выделен из серой лесной почвы, искусственно загрязненной дизельным топливом и хранится в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, коллекционный номер ИБ-ДТ 5.

Полученный консорциум состоит из двух штаммов микроорганизмов, каждый из которых характеризуется следующими признаками.

Характеристика штамма Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1.

Морфолого-культуральные признаки. Прямые палочки с закругленными концами. Грамположительные. Подвижные. Эндоспоры сферические. На агаризованных средах формируют круглые, с ровными краями, плотные в центре колонии матового цвета, непрозрачные, люминисцирующие. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Аэробы. Хемоорганотрофы. Каталазо- и оксидазоположительны. Хорошо усваивает сахарозу, ксилозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, маннит, маннозу, арабинозу, L-рамнозу, глицерин. Усваивает аспарагин, аргинин, аланин; слабо усваивает валин, лизин. Реакция Вогес-Проскауэра отрицательная. Газ из глюкозы не образует. Индол не образует. Рост в анаэробном агаре отрицательный. Образует кислоту из глюкозы. Крахмал не разлагает. Способен окислять углеводороды нефти. Непатогенен. Характеристика штамма Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3. Морфологокультуральные признаки. Короткие палочки с возрастом укорачиваются до кокков. Грамположительные. На плотных питательных средах образуют круглые, матового цвета плоские колонии, по краям менее плотные, чем в центре. Сапрофит. Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Метаболизм окислительного типа. Хорошо усваивает сахарозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, ксилозу, маннит, маннозу, арабинозу, L-рамнозу, глицерин. При выращивании на глюкозе образует газ. Усваивает аспарагин, аргинин, аланин; слабо усваивает валин, лизин. Потребляет цитраты в качестве единственного источника углерода. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол не образует. Реакция Вогес-Проскауэра отрицательная. Отсутствие роста на среде с 6% NaCl. Способен окислять углеводороды нефти. Непатогенен.

Количественное содержание каждого из штаммов микроорганизмов, входящих в состав консорциума, составляло в культуральной жидкости 10⁸ КОЕ/мл и не изменялось при длительном хранении в надлежащих условиях. Методом математического анализа установлено, что в данном консорциуме Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 относится к доминирующей форме (51%) от всех изучаемых микроорганизмов в популяции. Бактерии Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 являются содоминантной культурой (49%).

Окислительную активность консорциума микроорганизмов определяли по конечному продукту окисления, т.е. по выделению СO₂ по методике, описанной в [4]. В колбы емкостью 500 мл вносят поглотитель углекислоты Ва(ОН)₂, 250 мл питательной среды вышеописанного состава, 2,5 мл дизельного топлива и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием клеток 1.0·10⁸ КОЕ/мл, а также индивидуальные чистые культуры (по 5 мл) микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 с титром 1,0·10⁸ КОЕ/мл, полученные при выделении их из предлагаемого консорциума. Окислительная активность консорциума в эксперименте длительностью 30 суток составила 1990 мг СO₂, в то время как окислительная активность Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter spesies ИБ ДТ 5-3 составила соответственно 750 мг СО₂ и 870 мг СО₂. По результатам этого эксперимента можно отметить, что тип предлагаемого консорциума является естественной природной симбиотической ассоциацией двух штаммов микроорганизмов.

Пример 1. Консорциум штаммов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0,1; CaCl₂ - 0,01; MnSO₄·7H₂O - 0,02; FeSO₄·7H₂O - 0,02; NaH₂PO₄ - 1,5; К₂HPO₄ - 1,0; MgSO₄·7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 2,0; вода дистиллированная - 1000 мл.

Изучена деструктирующая активность консорциума штаммов при его выращивании на минеральной среде вышеуказанного состава с внесением в качестве единственного источника углерода дизельного топлива. Среду разливают по 100 мл в колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм в течение 30 минут. Засевают 2% бактериальной суспензии, дизельное топливо вносят стерильно в количестве 1; 5; 10; 15 мас.%. Выращивание осуществляют стационарно при комнатной температуре, обеспечивая аэрацию путем принудительной подачи воздуха при помощи микрокомпрессора (расход воздуха 0,2 л/мин). В виде контроля ставят такую же колбу с добавкой 100 мл среды, соответствующего количества нефтепродуктов без клеток микроорганизмов. Параллельно ставят такую же колбу со средой, нефтепродуктами и клетками Bacillus species 739 для сравнения их утилизирующей способности в одинаковых условиях. По окончании эксперимента (через 7 суток) культуральную жидкость экстрагируют гексаном, биомассу клеток удаляют, остаток нефтепродуктов высушивают до постоянного веса. Сравнивают “сухой” вес остатка нефтепродуктов в контроле и в опытных пробах, находят процент утилизации нефтепродуктов. Сравнительные данные утилизации нефтепродуктов представлены в табл. 1.

Пример 2. Культуральную жидкость консорциума микроорганизмов с титром 10⁸ КОЕ/мл наносили на нефтезагрязненную почву методом дождевания при расходе 1 мл/кг почвы. Исходное количество товарной сырой нефти Правдинского месторождения составляло в почве 12,4; 23,1 и 39,3 мас.%. Образцы почвы инкубировали при температуре 22°С и влажности 60% от полной влагоемкости. Через каждые 7 суток производились перемешивание и полив почвы, длительность эксперимента составила 30 суток.

Для сравнения при соответствующем исходном содержании нефти в почве аналогичным образом в эксперименте использована культуральная жидкость Bacillus species 739 (титр 10⁶ КОЕ/мл). Контролем служила нефтезагрязненная почва без интродукции микроорганизмов, процесс утилизации нефти здесь происходил только при участии аборигенной микрофлоры. Результаты эксперимента приведены в табл. 2.

Пример 3. Для моделирования реальных условий “старого” нефтяного загрязнения из нефти Самотлорского месторождения удаляли легкокипящую фракцию при нагреве до 100°С. Полученную таким образом более “тяжелую” и в какой-то степени окисленную нефть смешивали с торфом. Культуральную жидкость консорциума микроорганизмов с титром 10⁶ КОЕ/мл наносили на нефтезагрязненный торф при расходе 1 мл/кг торфа. Образцы торфа инкубировали при температуре 22°С и влажности 60% от полной влагоемкости. Длительность эксперимента составила 60 суток. Для сравнения использована культуральная жидкость Bacillus species 739 (титр 10⁸ КОЕ/мл). Контролем служил нефтезагрязненный торф без интродукции микроорганизмов. Результаты эксперимента приведены в табл. 3.

Таким образом, приведенные в табл. 1-3 результаты экспериментов свидетельствуют о высокой степени утилизации нефти и нефтепродуктов предлагаемым консорциумом штаммов микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species. Преимуществом консорциума является его эффективность в широком диапазоне содержания нефти или нефтепродуктов в углеводородсодержащем субстрате, в том числе и при высокой степени загрязнения.

Источники информации

1. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья//Почвоведение. - 1990, № 9. - С.148-151.

2. А.с. СССР 1743019 , кл. А 01 N 63/00, С 12 N 1/20, 1989.

3. Пат. РФ 2077397, кл. В 09 С 1/10, С 09 К 3/32. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. /Р.К.Андресон, Ф.Х.Хазиев, B.C.Дешура, Ф.Я.Багаутдинов, Т.Ф.Бойко, Е.И.Новоселова//Б.И. - 1997. - № 1. - С.73.

4. Пат. РФ 211.5629 , кл. С 02 F 3/34, В 09 С 1/10, 1998.

Изобретение относится к биологической очистке воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. В состав консорциума, депонированного в коллекции микрорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером НБ ДТ-5, входят штаммы Bacillus brevis ИБ ДТ5-1 (51%) и Arthrobacter species ИБ ДТ5-3 (49%). Консорциум выделен из почвы, загрязненной дизельным топливом. Тип консорциума является естественной природной симбиотической ассоциацией двух штаммов микроорганизмов. Консорциум обладает высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне содержания последних в углеводородсодержащем субстрате. 3 табл.

Консорциум штаммов микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3, депонированный в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером ИБ ДТ-5, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.