СПОСОБ РЕКУЛЬТИВАЦИИ ОТБЕЛИВАЮЩЕЙ ЗЕМЛИ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЕПРОДУКТАМИ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/08 C12R1/06 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к охране почвенных ресурсов от загрязнения нефтепродуктами.

В настоящее время предприятия нефтеперерабатывающего комплекса, использующие для контактной доочистки базовых масел (удаления смолистых соединений и полициклических ароматических углеводородов) глины, вынуждены отходы своего производства складировать в виде отвалов, тем самым усугубляя экологическую обстановку и занимая дополнительно отчуждаемые территории.

Известны различные биологические способы рекультивации почв, загрязненных нефтью или нефтепродуктами, основанные на интродукции в такие почвы специализированных микроорганизмов, предварительно выделенных из различных загрязненных источников или генетически модифицированных. Основными агентами биодеградации нефти и нефтепродуктов являются бактерии. Объясняется это тем, что использование углеводородов в своей жизнедеятельности среди бактерий распространено достаточно широко.

Ряд исследователей показали, что бактерии рода Rhodococcus являются перспективными для создания на их основе препаратов по биодеструкции нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву [1, 2].

Спорообразующие бактерии также широко используются для создания препаратов, способствующих очищению почвы и воды от контаминации нефтью [3-5].

Недостатками этих препаратов является низкая эффективность по рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, основную часть которых составляют смолистые вещества и полициклические ароматические соединения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, где для активации процесса биодеградации нефтепродуктов используют активный ил биологических очистных сооружений с добавками оксигенных соединений, например суперфосфат или перекись водорода [6].

Недостатком известного способа является сравнительно низкая степень биодеградации нефтепродуктов.

Технической задачей предлагаемого способа является повышение эффективности биодеградации нефтепродуктов, содержащихся в отбеливающих землях.

Поставленная задача решается путем внесения в отбеливающую землю добавки, содержащей кроме активного ила биологических очистных сооружений и оксигенных соединений дополнительно биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3, вносимой в количестве 3-5 мас.% по отношению к активному илу.

Указанный консорциум штаммов бактерий выделен из серой лесной почвы, искусственно загрязненной дизельным топливом и депонирован в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН.

Характеристика штамма Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1.

Морфолого-культуральные признаки. Прямые палочки с закругленными концами. Грамположительные. Подвижные. Эндоспоры сферические. На агаризованных средах формируют круглые, с ровными краями, плотные в центре колонии матового цвета, непрозрачные, люминесцирующие. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Аэробы. Хемоорганотрофы. Каталазо- и оксидазоположительны. Хорошо усваивает сахарозу, ксилозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, маннит, маннозу, арабинозу, L-рамнозу, глицерин. Усваивает аспарагин, аргинин, аланин; слабо усваивает валин, лизин. Реакция Вогес-Проскауэра отрицательная. Газ из глюкозы не образует. Индол не образует. Рост в анаэробном агаре отрицательный. Образует кислоту из глюкозы. Крахмал не разлагает. Способен окислять углеводороды нефти. Непатогенен.

Характеристика штамма Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3. Морфолого-культуральные признаки. Короткие палочки с возрастом укорачиваются до кокков. Грамположительные. На плотных питательных средах образуют круглые, матового цвета плоские колонии, по краям менее плотные, чем в центре. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Метаболизм окислительного типа. Хорошо усваивает сахарозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, ксилозу, маннит, маннозу, арабинозу, L-рамнозу, глицерин. При выращивании на глюкозе образует газ. Усваивает аспарагин, аргинин, аланин; слабо усваивает валин, лизин. Потребляет цитраты в качестве единственного источника углерода. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол не образует. Реакция Вогес-Проскауэра отрицательная. Отсутствие роста на среде с 6% NaCl. Способен окислять углеводороды нефти. Непатогенен.

Окислительную активность консорциума микроорганизмов определяли по конечному продукту окисления, т.е. по выделению СO₂ по методике, описанной в [7]. В колбы емкостью 500 мл вносят поглотитель углекислоты Ва(ОН)₂, 250 мл питательной среды Раймонда, 2,5 мл дизельного топлива и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием клеток 1,0· 10⁸ КОЕ/мл, а также индивидуальные чистые культуры (по 5 мл) микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ЦБ ДТ 5-3 с титром 1,0· 10⁸ КОЕ/мл, полученные при выделении их из указанного консорциума. Окислительная активность консорциума в эксперименте длительностью 30 суток составила 1990 мг СO₂, в то время как окислительная активность Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 соответственно 750 мг СО₂ и 870 мг СO₂. Таким образом, тип указанного консорциума является естественной природной симбиотической ассоциацией двух штаммов микроорганизмов. Количественное содержание каждого из штаммов микроорганизмов, входящих в состав консорциума, составляло в культуральной жидкости 10⁸ КОЕ/мл и не изменялось при длительном хранении в надлежащих условиях. Методом математического анализа установлено, что в данном консорциуме Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 относится к доминирующей форме (51%) от всех изучаемых микроорганизмов в популяции. Бактерии Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 являются содоминантной культурой (49%).

Примеры конкретного выполнения.

В лабораторных испытаниях способа биологической рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, использовали отбеливающую землю, отобранную с отвалов ОАО “Орскнефтеоргсинтез”, активный ил, используемый для очистки нефтесодержащих сточных вод на биологических очистных сооружениях г.Орска, оксигенные химические соединения - суперфосфат и перекись водорода и биомассу консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species, полученную при их совместной ферментации.

Консорциум штаммов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, г/л: Na₂CO₂ - 0,1; CaCl₂ - 0,01; MnSO₄·_{7H2O - 0,02; FeSO4·7H2O - 0,02; NaH2PO4 - 1,5; К2НРO4 - 1,0; MgSO4·7H2O - 0,2; NH4NО3 - 2,0; вода дистиллированная - 1000 мл. В качестве единственного источника углерода используется дизельное топливо, процесс ферментации проводят при комнатной температуре до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости, равного 10⁸ КОЕ/мл.}

Для оценки интенсивности разложения нефтепродуктов использовали показатель остаточного содержания нефтепродуктов в отбеливающей земле.

Определение остаточного содержания нефтепродуктов проводили спектрофотометрическим и весовым методами [8]. По первому из них пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и переносили в аппарат Сокслета. Экстракцию проводили 120-150 мл гексана в течение 2-3 часов при температуре кипения гексана (69° С). Концентрацию углеводородов в пробе определяли по оптической плотности экстракта на спектрофотометре СФ-46 при длине волны, на которой данная смесь углеводородов имела максимальный пик поглощения. Максимальный пик поглощения определяли на спектрофотометре SPECORD UF-VIS. По весовому методу пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и взвешивали на электронных весах. Проэкстрагированные пробы вместе с патронами высушивали в жарочном шкафу при температуре 100-120° С и снова взвешивали на электронных весах. По разнице в весе проб до и после экстракции определяли содержание остаточных нефтепродуктов.

Численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефтепродуктов, определяли посевом почвенной суспензии методом предельных разведений на плотные питательные среды [9]: бактерий, усваивающих органический азот - на мясопептонном агаре (МПА), утилизирующих минеральные формы азота - на крахмало-аммонийном агаре (КАА), микроскопических грибов (микромицетов) - на среде Чапека и углеводородокисляющих микроорганизмов на среде Цукамуры, где в качестве источника углерода была использована стерильная смесь углеводородов, полученная после экстракции гексаном загрязненной отбеливающей земли.

Повторность опытов - трехкратная.

Схема лабораторного (модельного) опыта по рекультивации отбеливающей земли:

1) 150 г отбеливающей земли (ОЗ);

2) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 9,6 г суперфосфата (или 6,4 мас.% по отношению к активному илу);

3) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 17,04 г перекиси водорода (33%-ной) (или 11,36 мас.% по отношению к активному илу);

4) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 9,6 г суперфосфата + 4,5 г биомассы упомянутого консорциума микроорганизмов;

5) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 17,04 г перекиси водорода + 4,5 г биомассы;

6) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 9,6 г суперфосфата + 7,5 г биомассы;

150 г ОЗ + 150 г активного ила + 17,04 г перекиси водорода + 7,5 г биомассы;

8) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 9,6 г суперфосфата + 3,0 г биомассы;

9) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 17,04 г перекиси водорода + 3,0 г биомассы;

10) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 9,6 г суперфосфата + 9,0 г биомассы;

11) 150 г ОЗ + 150 г активного ила + 17,04 г перекиси водорода + 9,0 г биомассы.

Результаты испытания предлагаемого способа рекультивации отбеливающей земли показали, что внесение активного ила с оксигенными соединениями с дополнительной добавкой биомассы консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 значительно повышает эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов в отбеливающей земле (табл. 1). Через 30 суток инкубации степень снижения содержания нефтепродуктов по предлагаемому способу составила 83,07-87,11 мас.%. Применение способа по прототипу в условиях опыта оказалось менее эффективным по сравнению с предложенным техническим решением, а степень биодеградации нефтепродуктов не превышала 62,57-70,9 мас.%. При этом внесение биомассы консорциума микроорганизмов менее чем 3 мас.% снижало эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов, а внесение биомассы более чем 5 мас.% практически не отражалось на повышении эффективности этого процесса.

Внесение биомассы консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов способствует значительному увеличению численности почвенных микроорганизмов, принимающих участие в трансформации нефтепродуктов, загрязняющих отбеливающую землю - бактерий, растущих на МПА, КАА, углеводородокисляющих микроорганизмов и микромицетов (табл. 2-5).

Реализация предлагаемого способа рекультивации на отвалах ОАО “Орскнефтеоргсинтез”, где на участке 15 соток было отсыпано 3000 тонн отбеливающей земли, позволила снизить содержание остаточных нефтепродуктов за 3 месяца с 34,0 мас.% до 5,2 мас.%, т.е. в 6,5 раз.

Таким образом, предлагаемый способ биологической рекультивации отбеливающей земли с применением активного ила и оксигенных соединений и дополнительным внесением биомассы консорциума микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 по сравнению с известным позволяет повысить эффективность процесса биоразложения нефти в почве, активизировать микробиологическую активность почв.

Список литературы

1. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов: А.с. 1805097 СССР, МКИ⁵ С 02 В 3/34, Е 02 В 15/04 //Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н., Зиновьев А.П., Ягафаров И.Р.

2. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений: Пат. 2019527, Россия, МКИ⁵ С 02 F 3/34 //Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В.

3. Штамм бактерий Bacillus sp. - деструктор нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений: Пат. 1784592, СССР, МКИ⁵ С 02 F 3/34 //Астрова Н.Г., Моисеева Л.В., Протченко П.З.

4. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма - деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв. //Прикладная биохимия и микробиология. - Т.34, №5. - С.534-539.

5. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами: Пат. 2077397, Россия, МКИ⁶ В 09 С 1/10, С 09 К 3/32 // Андресон Р.К., Хазиев Ф.Х., Дешура B.C., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Новоселова Е.И.

6. Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами: Пат. 2183142, Россия, МКИ⁷ В 09 С 1/10 //Логинов О.Н., Костюченко В.П., Комаров С.И., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф., Подцепихин А.К.

7. RU патент №2115629, С 02 F 3/34, В 09 С 1/10, 1998.

8. Груздякова Р.А. Спектрофотометрическое определение нефтепродуктов в пробах почвы. //Гигиена и санитария. - 1993. - №3. - С.73 и 74.

9. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: МГУ. - 1980. - 223 с.

Изобретение относится к охране почвенных ресурсов от загрязнения нефтепродуктами. Для активации процесса биодеградации нефтепродуктов в отбеливающей земле в способе используют активный ил биологических очистных сооружений, оксигенные соединения и биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species. Консорциум вносят в количестве 3-5 мас.% по отношению к активному илу. Способ позволяет снизить содержание остаточных нефтепродуктов за 3 месяца в 6,5 раз. 5 табл.

Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, путем внесения в почву добавки, содержащей активный ил биологических очистных сооружений и оксигенные соединения, отличающийся тем, что указанная добавка дополнительно содержит биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3, вносимой в количестве 3-5 мас.% по отношению к активному илу.