ШТАММ АЗИЯ-1/ТАДЖИКИСТАН/2004(1960) ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1 ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И/ИЛИ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к штаммам вируса ящура, которые могут быть использованы в качестве продуцентов специфических антигенов при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов.

Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на 35-40%.

Вирус ящура относится к роду афтовирусов, семейству пикорнавирусов. Он имеет 7 антигенных типов и значительное количество подтипов (1, 2).

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков.

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики (2, 3).

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны штаммы вируса ящура типа Азия-1, которые регистрировались на территории СССР: в Армении в 1973 и 1984 гг., в Таджикистане в 1974 г., в Туркмении в 1978 г. и в Грузии в 1984 и 2000 гг., при этом изоляты, выделенные в этих регионах, значительно отличались от производственного штамма Азия-1 №48 вируса ящура серологического типа Азия-1 (R составляло 38-58%).

Штамм Азия-1 №48 был выделен в феврале 1964 года на территории Московского района Таджикской ССР. Адаптирован к организму мышат-сосунов, 1-2-дневных крольчат и морских свинок, к культуре клеток СП в течение 10-12 пассажей и накапливался в титре 7,5 lg ЛД₅₀/мл; 7,0-8,0 lg ЛД₅₀/мл; 5,0 lg ИД₅₀/мл и 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/мл соответственно. По антигенному спектру этот штамм отличался от эталонных вариантов этого типа «Пакистан» 1/14 и «Израиль» 3/63. Указанный штамм используется в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на территории Российской Федерации и стран СНГ (4).

Недостатки данного штамма состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности. Вакцина из этого штамма обеспечивает защиту против заражения гомологичным вирусом.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм Азия-1 №1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1, выделенный в июле 2000 года в Богдановском районе Республики Грузия от больного крупного рогатого скота (КРС) и полученный в качестве производственного путем пассирования изолята на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм Азия-1 №1737/Грузия/2000 имеет антигенные отличия от производственного штамма Азия-1 №48 и реакции связывания комплемента (R=32%).

Полученный штамм депонирован 26.01.2001 г. в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ под регистрационным наименованием: штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 №1737/Грузия/2000-ДЕП (5).

Недостатки штамма-прототипа состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности. Вакцина из этого штамма обеспечивает защиту против заражения гомологичным вирусом.

В последние годы на территории некоторых государств Среднего и Ближнего Востока, Центральной и Средней Азии и Закавказья были зарегистрированы вспышки ящура, вызванные штаммами вируса, отличающимися от производственного штамма Азия-1 №48 по показателям серологического родства. Один из них был выделен в 2004 году в Республике Таджикистан.

В ФГУ ВНИИЗЖ лабораторными исследованиями афтозного материала, выделенного от больных животных в Горно-Бадахшанской автономной области Республики Таджикистан, был установлен вирус ящура типа Азия-1, имеющий антигенные отличия от производственного штамма Азия-1 №48 в РСК (R=27%).

Это свидетельствует о несоответствии применяемых средств специфической профилактики и диагностики ящура типа Азия-1, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в Республике Таджикистан в 2004 году.

В связи с этим назрела необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серологического типа Азия-1 для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса ящура серологического типа Азия-1, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся в странах Средней Азии.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серологического типа Азия-1, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодных для изготовления средств специфической профилактики и диагностики ящура типа Азия-1, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Средней Азии.

Указанный технический результат достигнут получением штамма Азия-1 /Таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа Азия-1 (авторское наименование) для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов. Штамм является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960) выделен в январе 2004 года от больных коров в Горно-Бадахшанской автономной области Республики Таджикистан. Производственный штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия-1 получен пассированием эпизоотического изолята на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Полученный штамм депонирован 11 августа 2004 года во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - Центр качества ветеринарных препаратов и кормов» (ФГУ ВГНКН) под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура Азия-1/Таджикистан/2004 (1960)-ДЕП.

По сравнению с прототипом штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины. Штамм Азия-1 /Таджикистан/2004 (1960) обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих проводить серологическую диагностику изолятов вируса ящура типа Азия-1, вызывающих вспышки заболевания в последние годы в странах Средней Азии, и противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания.

Сущность изобретения пояснена на дендрограмме (см. чертеж), отражающей филогенетические взаимоотношения штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура типа Азия-1 (дендрограмма основана на сравнении полных пуклеотидных последовательностей гена VP1), и в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID N 0:1 представляет последовательность нуклеотидов гена VP1 штамма Азия-1 /Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия-1;

SEQ ID N 0:2 - последовательность аминокислот VP1 штамма Азия-1 /Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия-1.

Штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия-1 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия-1 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции диффузионной преципитации (РДП), иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации (РН). При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным антигеном индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции связывания комплемента (РСК) в разведениях 1:128-1:180 и в ИФА в разведениях 1:4000-1:6000,

Антигенное родство штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) с производственным штаммом Азия-1 №48 и штаммами, ранее выделенными на территории Ирана и Закавказья, изучено в РСК. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) отличаются от производственного штамма Азия-1 №48 (R=27%), от штамма Азия-1 №1737/Грузия/2000 (R=42%), а также от ранее выделенных эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1. В то же время он является антигеннородственным штаммам Азия-1 №1238/Грузия/84 и Азия-1/Пакистан 1/54.

Молекулярно-генетическая характеристика

Методом нуклеотидного секвенирования определена первичная структура гена VP1 (SEQ ID N 0:1) штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) и из нее выведена аминокислотная последовательность белка VP1 (SEQ ID N 0:2).

Сравнительный анализ установленных последовательностей показал, что по первичной структуре гена и белка VP1 штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) значительно отличается от российского вакцинного штамма Азия-1 №48 и имеет близкое филогенетическое родство с эпизоотическими изолятами Иран/99, Грузия/2000, Грузия/2001 и Армения/2000. Филогенетические взаимоотношения штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) с ранее изученными изолятами вируса ящура типа Азия-1, выделенными в разных регионах мира за четыре последних десятилетия, отражены в дендрограмме.

Биотехнологические характеристики

Штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия-1 проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации.

Вирус ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) репродуцируется в монослойных культурах клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и IB-RS-2 в течение 18-24 часов, накапливаясь в титрах от 6,0 до 7,66 lg ТЦД₅₀/мл. При высокой множественности заражения (1-10 ТПД/клетку) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Штамм предназначен для получения диагностических сывороток, антигенных препаратов, а также для изготовления инактивированной противоящурной вакцины.

Хемо- и гевотаксономическая характеристика

Штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (I960) является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках.

В свою очередь предшественники расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66а) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S и градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, крольчат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и нарентальном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм Азия-1 /Таджикистан/2004 (1960) по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа Азия-1.

Для снижения его эпизоотической опасности необходимо обеспечить своевременную лабораторную диагностику и вакцинопрофилактику вновь возникающих очагов болезни. Для чего необходимы высокоактивные и специфичные антительные и антигенные диагностикумы и вакцина, полученные с использованием данного штамма в качестве производственного.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1.

Штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия-1 был изолирован из полевого материала (экспертиза №1960), поступившего 23.01.2004 г. в ФГУ ВНИИЗЖ из Горно-Бадахшанской автономной области Республики Таджикистан в виде эпителия афт от КРС, подозреваемого в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и его дифференциации от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных Методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура. Владимир, 2002, 31 с.

Указанные методы включали интрадермолингвальную инокуляцию материала полевого изолята КРС (1 пассаж) и последующую адаптацию вируса, выделенного от заболевшего животного, к культурам первичных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВНК-21. Первичные и перевиваемые культуры клеток для постановки биопробы выращивали на соответствующих питательных средах во флаконах емкостью 50 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% ГЛА и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом (10%). После 30-минутного инкубирования при +37°С во флаконы вносили по 5-10 мл поддерживающей среды и инкубировали при +37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 минут. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ФГУ ВНИИЗЖ.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960) к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура и везикулярного стоматита с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что в материале экспертизы №1960 выявлен комплементсвязывающий антиген вируса ящура типа Азия-1 в разведении 1:2.

Пример 2.

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма Азия-1 /Таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа Азия-1, полученный в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% раствора полигексаметиленгуанидина (ПГМГ). Очищенный вирус концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,01-0,05%, pH 7,8-8,0.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адьюванта вводят морским свинкам в объеме 1,0 мл внутримышечно. Спустя 21 день иммунизацию повторяют и через 10 дней животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК. После этого готовят серию путем смешивания типоспецифических индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при 14°С в течение 25-30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 0,5-1,0 мл.

Была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 4.

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3.

Для получения антигена для иммунохимических реакций используют вирус ящура типа Азия-1 штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960), адаптированный к культурам клеток перевиваемых линий ПСГК-30 или ВПК-21.

Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% суспензии афт КРС. Адаптацию проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученную матричную расплодку вируса используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Полученную вируссодержащую жидкость концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом было приготовлено 2 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в таблице 5.

Результаты исследований, приведенные в таблице 5, свидетельствуют о том, что получен диагностический антиген, специфическая активность которого соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 4.

Для изготовления адсорбат-вакцины вирус ящура типа Азия-1 штамма Азия-1 /Таджикистан/2004 (1960) репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВПК-21.

В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,01-0,1 ТЦД₅₀ на клетку.

Культивирование вируса ведут при температуре 35-36,5°С. Через 8-10 часов инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то инкубирование продолжают еще 1-3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S+75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до 4-8°С. В охлажденную суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка и 146S+75S компонентов вируса, стерильность. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).

В охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке добавляют расчетный объем геля ГОА 3% концентрации. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62+0,488 мг/мл р<0,01 n=10, а концентрация 146S+75S компонентов вируса ящура не менее 2,0 мкг/мл. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТу 28085-89 «Препараты биологические. Метод биологического контроля стерильности».

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 мл, затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

В таблице 6 отражены результаты сравнительного опыта по культивированию вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960) и вируса ящура производственного штамма Азия-1 №48 в культиваторах КС-6, из которых следует, что вирус ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960) имеет более короткий период оптимальной репродукции, что обусловило необходимость выбора оптимальных условий культивирования вируса и множественности заражения.

Пример 5.

Проведены сравнительные испытания на морских свинках иммуногенной активности противоящурной вакцины инактивированной, сорбированной из штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960), и противоящурной вакцины инактивированной, сорбированной из производственного штамма Азия-1 №48.

Для определения иммуногенной активности каждого препарата использовали по 40 морских свинок, из которых 8 являлись контрольными.

Вакцины разбавляли фосфатным буферным раствором в соотношении 1:3, 1:9, 1:27 и 1:81. На каждое разведение вакцины брали по 8 морских свинок. Каждую группу из 8 морских свинок содержали в отдельном вольере, на котором закрепляли этикетку с указанием серии вакцины, ее разведения, даты начала испытаний и количества морских свинок, привитых данным разведением.

Каждую вакцину вводили 4 группам морских свинок внутримышечно в объеме 2 мл в область правого и левого бедра по 1 мл. Контрольные группы морских свинок использовали для проверки активности контрольных серотипов вируса ящура.

За вакцинированными свинками вели наблюдение в течение 15-17 суток. После этого всех привитых и контрольных животных заражали адаптированным к ним вирусом ящура гомологичного и гетерологичного штаммов интрадермально в плантарную поверхность одной из задних лапок в дозе 10^-4 ГД_{50/0,1 мл}.

Учет результатов заражения проводили через 3, 5 и 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса на передних и одной задней лапках.

Контроль вакцины считали действительным, если из 8 контрольных свинок генерализованной формой ящура заболевали не менее 7 животных.

Сыворотки крови от морских свинок, отобранные через 30 дней после вакцинации, проверяли на наличие вируснейтрализующих антител в реакции микронейтрализации (РМН) с гомологичным и гетерологичным штаммами.

Результаты этих исследований, представленные в таблице 7, свидетельствуют о том, что пробы сывороток от морских свинок, иммунизированных противоящурной вакциной из штамма Азия-1 №48, в РМН с гомологичным штаммом, обнаруживают более высокие титры антител и менее низкие с гетерологичным штаммом Азия-1/Таджикистан/2004(1960).

Сыворотки крови от морских свинок, иммунизированных противоящурной вакциной инактивированной сорбированной из штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960), обнаруживают высокие титры антител в РМН как с гомологичным штаммом, так и с гетерологичным.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании данного изобретения следующей совокупности условий:

- штамм Азия-1/Таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа Азия-1, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм Азия-1/Таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа Азия-1, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, специфической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригоден для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации

1. Ререр X. Ящур. Пер. с нем. Г.А.Сурковой /Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В.Малярца. - М., Колос, 1971, 432 с.

2. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур /Под ред. А.Н.Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИИТИБП, 1998. - С.532-548.

4. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВПК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.91.

5. Патент РФ №2218397; С12N 7/00, А61К 39/135 // (С12N 7/00, С12R 1:93); 10.12.2003 г. (протитип).

Таблица
Антигенный спектр штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа Азия-1 по данным РСКСравниваемые штаммыПоказателиr₁r₂R%Азия-1 №480,170,4627Азия-1 №1737/Грузия/20000,390,4642Азия-1 №1730/Иран 58/990,160,0913Азия-1 №1731/Таиланд 2/950,560,2537Азия-1 №746/Таджикистан/740,241,049Азия-1 №1238/Грузия/840,780,6470Азия-1/Пакистан 1/540,820,7076Азия-1/Иран 1/730,500,7661Азия-1 №674/Армения/730,660,7168Таблица 2
Биологические свойства штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа Азия-1Система репродукции вирусаВремя проявления биологической активности (часы)Количество адаптационных пассажейХарактеристика адаптированного материалаАктивность в РСКТитр инфекционности lg ТЦД_50/млСП18-963цельн.-1:43,0-6,0ПСГК-3018-1203цельн.-1:42,5-6,33IB-RS-218-723цельн.-1:84,5-7,66ВНК-211811:128,25

Таблица 3
Определение типа вируса в 33%-ной суспензии афтозного материала (экспертиза №1960/Таджикистан/2004)г/и сыворотки в рабочем разведенииЭкспертиза №1960Контрольцельный1:21:41:81:16 А₂₂O₁С₁Азия-1САТ-1САТ-2САТ-3ВС ИндианаВС НДК/сA₂₂ №550------4---------O₁ №194-------4--------С₁ №564--------4- -----Азия-1 №4844-------4------CAT-1 №96----------4-----CAT-2 №325-----------4----CAT-3------------4---ВС Индиана-------------4--ВС Нью Джерси--------------4-Без сыв.-----к/а----------Примечание: 4-100% задержка гемолиза;
- полный гемолиз.Таблица 4
Характеристика диагностической сыворотки, полученной на антиген из штамма Азия-1/Таджикистан/2004/(1960) вируса ящура типа Азия-1Наименование препаратаОбъем, млАктивность в РСКс гомологичным диагностикумомс гетерологичными диагностикумами Азия-1Гипериммунная сыворотка1001:80№48№1737№1238Азия-1 Пакистан 1/541:201:201:501:50

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен штамм вируса ящура типа Азия-1/Таджикистан/2004(1960). Штамм получен путем пассирования эпизоотического изолята на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Депонирован 11.08.2004 г. в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером Азия-1/Таджикистан/2004(1960)-ДЕП. Вирус штамма репродуцируется в чувствительных культурах клеток и в течение 18-24 часов инкубирования накапливается от 6,0 до 7,66 lg ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток в течение 10 пассажей. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Изобретение может быть использовано для изготовления средств специфической профилактики и/или диагностики ящура типа Азия-1. 1 ил., 7 табл.

Штамм вируса Aphtae epizooticae, сем.Picomaviridae, рода Aphtovirus, типа Азия-1, коллекция ФГУ ВГНКИ Азия-1/Таджикистан/2004(1960)-ДЕП, для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.