ШТАММ О №2102/Забайкальский/2010 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА О ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА О Российский патент 2015 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Ящур - это острое, контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на (%): 30-40 [1].

Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus. Он имеет 7 антигенных типов, большое количество подтипов и множество штаммов [2].

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков [2, 3].

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны штаммы вируса ящура типа О, использовавшиеся в качестве производственных на территории России в течение последних 50 лет. К ним относятся следующие штаммы: O₁ №1618 Чечено-Ингушский, выделенный в 1966 году; O₁ №194, выделенный в 1957 году в Волгоградской области. Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны, в настоящее время поддерживаются в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Известен штамм типа О №1736/Абхазия/2000, выделенный от КРС в Гальском районе Абхазии, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Известен штамм типа О №1964/Монголия/2004, выделенный от КРС в феврале 2004 г. в Восточно-гобийском аймаке Монголии, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [4].

Известен штамм типа О №1734 «Приморский-2000», выделенный 13.04.2000 г. от свиней в ОПХ «Степное» с. Элитное Уссурийского района Приморского края [5, 6].

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм типа О №1734 «Приморский-2000» принадлежит к Паназиатской генетической линии вируса ящура типа О. Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе во Вьетнаме, Японии, Корее, Монголии, а также Армении и Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 г. также была вызвана паназиатским вирусом. Исследуемый вирус имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О Вьетнам/99 и О Тайвань/99. Установлено, что изолят О №1734 «Приморский-2000» отличается от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов O₁ №194 и O₁ №1618, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики.

Производственный штамм №1734 «Приморский-2000» используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.

В 2010 г. в Японии, Южной Корее, Гонконге и континентальном Китае вспышки ящура типа О были вызваны вирусом топотипа Юго-Восточная Азия, относящимся к генетической линии Муа-98 [7].

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм №1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Недостатки известных штаммов, в том числе и штамма-прототипа, состоят в антигенных отличиях от изолятов вируса ящура типа О, выделенных в различные временные промежутки, а приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.

Вспышка ящура на территории РФ была отмечена в июле 2010 г. во дворах у жителей поселка Абагайтуй Забайкальского района в 12 км от границы с Китаем в буферной зоне, где КРС и МРС с профилактической целью вакцинировали против ящура типов О, А, Азия-1. Из 2256 голов КРС разного возраста, имевшихся у жителей, переболело 112 голов (5%), из 50 свиней - 4.

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа О для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.

Указанная задача решена получением штамма О №2102/Забайкальский/2010 (авторское наименование) вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2102/Забайкальский/2010, был выделен в июле 2010 года от больной свиньи в поселке Абагайтуй Забайкальского района Забайкальского края (экспертиза №2102). Производственный штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О депонирован 01 марта 2012 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером (ссылкой): вирус ящура штамм О №2102/Забайкальский/2010 (производственный).

По сравнению со штаммом-прототипом штамм 0№2102/Забайкальский/2010 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма O №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма O №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О.

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О относится к семейству Picomaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного штамма типа О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30 и в ИФА в разведении 1:10000.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О имеет близкое филогенетическое родство с изолятами, выделенными в Гонконге, Южной Корее, Японии и континентальном Китае в 2010 г. и значительно отличается от штаммов O₁ Manisa, О №1734 «Приморский-2000» сублинии PanAsia, а также от вируса топотипа Средний Восток - Южная Азия (ME-SA) сублинии О PanAsia2. Гомология изолятов О №2102/Забайкальский/2010 и О/Гонконг/20/2010 составляет 97%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм О №2102/Забайкальский/2010 принадлежит к топотипу Юго-Восточная Азия (SEA) генетической линии Муа-98 вируса ящура серологического типа О.

Антигенное родство штамма О №2102/Забайкальский/2010 с производственными штаммами вируса ящура O₁ Manisa, О №1734/Приморский/2000 и О PanAsia2 изучено в ИФА и РМН.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) составило для O₁ Manisa - 0,31, О №1734 «Приморский-2000» - 0,36, О PanAsia2 - 0,3. При значении r₁>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [8].

Результаты исследований в ИФА представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r₁) составило для O₁ №1618 - 0,22, О №1734/Приморский/2000 - 0,35, О PanAsia2 - 0,23. При значении r₁ - 0,4-1,0 производственный штамм находится в близком антигенном родстве; при значении r₁ - 0,2-0,39 - полевой изолят антигенно родственен производственному штамму, вакцина из производственного штамма может быть использована, если не будет найдено более родственного штамма и при условии, что животные будут иммунизированы более 1 раза; при значении r₁<0,2 - полевой изолят отличается от производственного штамма, вакцина из которого не приемлема для защиты от заражения полевым вирусом.

Биотехнологические характеристики

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки сирийского хомячка (ВНК-21) и почки свиньи (IB-RS-2). В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 6,0 до 7,5 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VР₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VР_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2102/Забайкальский/2010, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в июле 2010 года от подозреваемой в заболевании ящуром свиньи из поселка Абагайтуй Забайкальского района Забайкальского края (экспертиза №2102/2010). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 18 июля 2010 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [9].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение вируса и его адаптацию.

Выделение вируса на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 и свиньях с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ» и «Набор для выявления антигена вируса ящура в ИФА», изготовленный ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18-24 часов проявлялось (%) 90-100 ЦПД в монослое.

Адаптация эпизоотического изолята О №2102/Забайкальский/2010 к различным клеточным линиям наступала на уровне 3 пассажей. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2? использовали для получения антигена для РСК и ИФА.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в реакциях: РСК и ИФА с целью идентификации его типовой принадлежности (таблицы 4 и 5). Проведена проверка штамма на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблицах 4 и 5 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2102/Забайкальский/2010 выявлен антиген вируса ящура типа О в разведении 1:2 в РСК и 1:16 в ИФА.

Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма O №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищают от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении рН 8,0-8,3.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см³ внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяют и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [9].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°С в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют во флаконы по 0,5-1,0 см³ и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 6.

Данные, приведенные в таблице 6, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для серологических и иммунохимических реакций используют штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура Aphtae epizooticae, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ВПК-21, ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%) 8-10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Антиген, полученный на культуре клеток ВНК-21, используется для получения иммуноспецифических компонентов для ИФА.

Указанным способом было приготовлено 3 серии диагностического антигена, характеристики которой приведены в таблице 7.

Результаты исследований, приведенные в таблице 7, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 4

Для изготовления вакцины инактивированной сорбированной типа О штамма О №2102/Забайкальский/2010 вирус ящура репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2-7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,001-0,05 ТЦЦ₅₀ на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре (36°С)-(37°С). Через 8-10 часов культивирования проводят подсчет живых и мертвых клеток путем окраски трипановым синим. Если количество живых клеток составляет (%) 15-20, то культивирование продолжают еще 2-3 часа. При достижении количества мертвых клеток (%) 90-95 культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75 S компонентов.

Количество 146S и 75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см³. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной (%) 0,025-0,05. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при (36°С)-(37°С) и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до (4°С)-(8°С). В охлажденную суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).

Расчетный объем геля ГОА 3%-ной концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/см³ Р<0,01 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/см³. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10%-ный раствор сапонина до конечной концентрации не менее 0,075%.

Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТ 28085-89.

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 см³, затем подкожно в дозе 10 см³. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Пример 5

Проведены испытания на КРС противоящурной вакцины инактивированной сорбированной из штамма О №2102/Забайкальский/2010, изготовленной так, как описано в примере 4.

КРС массой 200-250 кг иммунизировали подкожно, вводя по 2 см³ цельной вакцины. Вакцина в цельном виде уже на 7 день после прививки индуцировала достаточный уровень вируснейтрализующих антител (1,78±0,11 lg), а к 35 дню после вакцинации количество вируснейтрализующих антител (ВНА) увеличилось до 2,11±0,26 lg (таблица 8). После контрольного заражения заболели с генерализацией процесса 2 контрольных головы КРС и 1 вакцинированная голова КРС.

Пример 6

Для изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа О вирус штамма О №2102/Забайкальский/2010 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют, очищают от балластных примесей, контролируют полученный антиген на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность так, как описано в примере 4.

Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией. Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6°С до момента использования в вакцине.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно. Из масляных адъювантов, которые применяются в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (ГОА, сапонин), а также масляный адъювант марки Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).

В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную против вируса ящура типа О, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для КРС в дозе 2 см³ через 35 дней после вакцинации. Вакцину вводят КРС подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S и 75S компонентов.

Пример 7

Проведены испытания иммуногенной активности противоящурной вакцины инактивированной эмульсионной из штамма О №2102/Забайкальский/2010, изготовленной так, как описано в примере 6. Иммуногенная активность данной вакцины проверена на КРС массой 200-250 кг. Результаты исследований представлены в таблице 8. КРС, привитые цельной вакциной на основе адъюванта марки Montanide ISA-70, на 35 день после вакцинации имели титр ВНА, равный 2,63±0,16 lg, а на основе адъюванта марки Montanide ISA-206 - 2,57±0,16 lg. После контрольного заражения заболели с генерализацией процесса только 2 контрольных головы КРС.

Пример 8

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250-300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000-10000000 ИД₅₀/1 см³ с антибиотиками, вводят по 0,2-0,3 см³ в 20-40 каналов интрадермалингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20-30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцем. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей с последующим добавлением в нее антибиотиков и равного объема глицерина. Полученную 10% суспензию вируса оценивают в РСК на типоспецифичность и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на соответствие исходному вирусу по первичной структуре гена VP1. Активность вируса в РСК должна быть не ниже 1:4.

Инфекционную активность вируса определяют на КРС и в первичной культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 10^4,0 ИД₅₀/0,1 см³. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при температуре минус (70°С - 40°С).

Пример 9

Штамм О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на свиньях, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на свиньях, заражая 1-2 животных массой 30-50 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение 2 лет не проводили вакцинацию скота против ящура. Вируссодержащую суспензию вводят под слизистую оболочку языка или в кожу венчика конечностей. Созревшие афты снимают через 24-72 часа после заражения. Приготовление суспензии вируса и контроль его активности осуществляют так, как описано в примере 8. Титрование инфекционной активности вируса ящура проводят на свиньях и в культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 10^4,0 ИД₅₀/0,1 см³.

Источники информации

1. Рёрер X. Ящур. Пер. с нем. Г.А. Сурковой. / Под ред. и с предисл. канд. вет. наук. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971, 432 с.

2. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.] - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Вирусные болезни животных / Сюрин В.П., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. [и др.] - М., ВНИИТИБП, 1998, С.532-548.

4. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 / Т.А. Фомина, В.К. Спирин, А.И. Егорова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 94-104.

5. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1734 «Приморский-2000» / В.К. Спирин, А.И. Егорова, С.Р. Кременчугская [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 52-57.

6. Пат. РФ №2204599, C12N 7/00, А61К 39/135, 20.05.2003 г.

7. Southeast Asian Foot-and-Mouth Disease Vimses in Eastern Asia / N.J. Knowles, J.J. He, Y. Shang [et al] // Emerg Infect Dis. - 2012. - V. 18(3): P. 499-501.

8. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and beers). - 7th Edition, Paris, 2008. - Vol. 1. - P. 203-207

9. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2102/Забайкальский/2010. Представленный штамм репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах ПСГК-30, ВНК-21 и IBRS-2, в течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,63-7,5 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей. Представленный штамм может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 9 пр.

1. Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа О, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2102/3абайкальский/2010 (производственный) для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О, характеризующийся тем, что он получен в течение последовательного пассирования в культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения, обладает высокой биологической активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную и иммуногенную активность после инактивации.

2. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в первично трипсинизированной культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) с титром инфекционной активности не менее 6,63 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:4.

3. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток свиной почки (СП) с титром инфекционной активности не менее 7,0 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:8.

4. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки свиньи (IB-RS-2) с титром инфекционной активности не менее 6,75 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:6.

5. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он получен в течение нескольких последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21) с титром инфекционной активности не менее 7,5 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:12.

6. Штамм по любому из пп.1-5, характеризующийся тем, что после инактивации он индуцирует в организме морских свинок образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведениях 1:30 и в ИФА в разведении 1:10000.