ШТАММ "АМУРСКИЙ" № 1987 ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1 ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1 Российский патент 2009 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к штаммам вируса ящура, которые могут быть использованы для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и в качестве продуцентов специфических антигенов при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов.

Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на 35-40%.

Вирус ящура относится к роду афтовирусов, семейству пикорнавирусов. Он имеет 7 антигенных типов и значительное количество подтипов (1, 2).

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков.

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики (2, 3).

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны штаммы вируса ящура типа Азия-1, которые регистрировались на территории СССР: в Армении в 1973 и 1984 г., в Таджикистане в 1974 г., в Туркмении в 1978 г. и в Грузии в 1984 и 2000 г., при этом изоляты, выделенные в этих регионах, значительно отличались от производственного штамма Азия-1 №48 вируса ящура серологического типа Азия-1 (R составляло 38-58%).

Штамм Азия-1 №48 был выделен в феврале 1964 года на территории Московского района Таджикской ССР. Адаптирован к организму мышат-сосунов, 1-2-дневных крольчат и морских свинок, к культуре клеток СП в течение 10-12 пассажей и накапливался в титре 7,5 lg ЛД₅₀/см³; 7,0-8,0 lg ЛД₅₀/см³; 5,0 lg ИД₅₀/см³ и 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ соответственно. По антигенному спектру этот штамм отличался от эталонных вариантов этого типа «Пакистан» 1/14 и «Израиль» 3/63. Указанный штамм используется для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1, применяемых на территории Российской Федерации и стран СНГ (4).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм №1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1, выделенный в июле 2000 года в Богдановском районе Республики Грузия от больного крупного рогатого скота (КРС) и полученный в качестве производственного путем пассирования изолята на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм Азия-1 №1737/Грузия/2000 имеет антигенные отличия от производственного штамма Азия-1 №48. В реакции связывания комплемента по 100% гемолизу R составило 32%.

Полученный штамм депонирован 26.01.2001 г. в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным наименованием: штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 №1737/Грузия/2000-ДЕП (5).

Штамм №1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1 используется для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1.

Недостатки вышеуказанных штаммов, в том числе и прототипа, состоят в том, что приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только от заражения гомологичным вирусом.

В последние годы на территории некоторых государств Среднего и Ближнего Востока, Центральной и Средней Азии и Закавказья были зарегистрированы вспышки ящура, вызванные штаммами вируса, отличающимися от производственного штамма Азия-1 №48 по показателям серологического родства.

В 1999 году ящур типа Азия-1 был обнаружен в Иране и Турции, в 2000-2004 г.был занесен в страны Закавказья - Грузию, Армению и Азербайджан; Средней Азии - Таджикистан и Киргизию.

В июне 2005 года очаг ящура был зарегистрирован в Амурской области Российской Федерации. Лабораторными исследованиями в ФГУ «ВНИИЗЖ» в патологическом материале от КРС был выявлен вирус ящура экзотического для России типа Азия-1. В дальнейшем вспышки ящура, вызванные вирусом данного типа, возникли в Хабаровском, Приморском краях и Читинской области Российской Федерации.

Вакцина из производственного штамма вируса ящура типа Азия-1 №48, применяемая на территории России в плановом порядке с профилактической и вынужденной целью, не обеспечивала удовлетворительную защиту иммунизированных животных и не предотвращала распространение ящура. Это свидетельствовало о несоответствии используемых средств специфической профилактики и диагностики ящура типа Азия-1, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему на территории России в 2005 году.

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа Азия-1 для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.

Указанная задача решена получением штамма «Амурский» №1987 (авторское наименование) вируса ящура типа Азия-1 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «Амурский» №1987, был выделен в июне 2005 года от больных коров села Буссе Свободненского района Амурской области (экспертиза №1987/05 «Амурский»). Производственный штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 депонирован 16 мая 2006 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой): производственный штамм «Амурский» №1987-ДЕП вируса ящура типа Азия-1.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1.

Штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих проводить серологическую диагностику изолятов вируса ящура типа Азия-1, вызывающих вспышки заболевания в последние годы в России и Монголии, и противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания, а также осуществление контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 с известными изолятами вируса ящура типа Азия-1 и основанная на сравнении полных последовательностей нуклеотидов гена VP1, а также в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена VP1 штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1;

SEQ ID NO:2 - последовательность аминокислот VP1 штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1.

Штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «Амурский» №1987 вируса ящура относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции диффузионной преципитации (РДП), иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации (РН). При иммунизации КРС вакцина из инактивированного вируса штамма «Амурский» №1987 индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции связывания комплемента (РСК) в разведениях 1:128-1:180 и в ИФА в разведениях 1:12000-1:48000.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 (SEQ ID NO:1) вируса ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987 и выведена первичная структура белка VP1 (SEQ ID NO:2). Сравнительный анализ установленных последовательностей показал, что штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 наряду с выделенными в 2005 году изолятами №1993/Хабаровский, №1994/Приморский, №1991/Монголия и изолятами этого типа, вызвавшими вспышки ящура в Китае, имеет близкое филогенетическое родство со штаммами Азия-1/Индия/18/80 и Азия-1/Индия/15/81 (процент нуклеотидных различий 1,42-1,74) и значительно отличается от вакцинных штаммов Азия-1 №48 и Азия-1/Шамир3/89. Кроме того, он отличается от штаммов вируса этого типа, выделенных в 2004 г. в Таджикистане и Пакистане и в 2005 г. в Гонконге. Степень нуклеотидных отличий последовательностей штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 со штаммами вируса ящура типа Азия-1 №48 составила 11,55%, Азия-1/Шамир3/89 - 14,45%, Азия-1/Иран/58/99 - 15,38% (см. дендрограмму).

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 принадлежит к новой генетической линии вируса ящура серологического типа Азия-1.

Антигенное родство штамма «Амурский» №1987 с производственным штаммом вируса ящура типа Азия-1 №48 и штаммами, ранее выделенными на Азиатском континенте и в Закавказье, изучено в РСК. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 1, штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 отличается как от производственных штаммов Азия-1 №48 (R=26%), Азия-1/Шамир3/89 (R=17%), Азия-1/Иран 58/99 (R=23%), так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Амурский» №1987 репродуцируется в монослойных культурах клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2 и в течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 6,0 до 7,5 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой мол. массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66а) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «Амурский» №1987 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, Y-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуноген в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «Амурский» №1987, был выделен в ФГУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в июне 2005 года от подозреваемого в заболевании ящуром КРС села Буссе Свободненского района Амурской области (экспертиза №1987/05 «Амурский»). Пробы афтозного материала поступили в ФГУ «ВНИИЗЖ» 12 июня 2005 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура (6).

Биологические и вирусологические методы включали инокуляцию материала полевого изолята КРС (1 пассаж) и последующую адаптацию вируса к культурам первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВПК-21. Для постановки биопробы первичные и перевиваемые культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах в стационарных условиях во флаконах емкостью 50-100 см³, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5-10 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток, хранящихся в музее штаммов ФГУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18-24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое. Адаптация эпизоотического изолята №1987/05 «Амурский» к различным клеточным линиям наступала на уровне 3-5 пассажа. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для получения вируса для изготовления экспериментальной серии вакцины и получения гипериммунных сывороток морских свинок.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура и везикулярного стоматита с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 3.

Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №1987 выявлен комплементсвязывающий антиген вируса ящура типа Азия-1 в разведении 1:2.

Полученному штамму вируса ящура типа Азия-1 присвоено авторское наименование: штамм «Амурский» №1987.

Штамм «Амурский» №1987 депонирован 16 мая 2006 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой): производственный штамм «Амурский» №1987-ДЕП вируса ящура типа Азия-1.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1, репродуцированного в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% полигексаметиленгуанидина (ПГМГ). Очищенный вирус концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении рН 8,0-8,3.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см³ внутримышечно. Через 21 день иммунизацию повторяют и спустя 10 дней животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура (6).

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при 4°С в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 0,5-1,0 см³.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 4.

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для иммунохимических реакций используют вирус ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ВНК-21 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% суспензии афт КРС. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% ПЕГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом. Антиген, полученный на культуре клеток ВПК-21, используется для получения диагностических компонентов для ИФА. Антиген, полученный на культуре клеток IB-RS-2, используется в РСК.

Указанным способом было приготовлено 4 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в таблице 5.

Результаты исследований, приведенные в таблице 5, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 4

Для изготовления вакцины инактивированной сорбированной вирус ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВПК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2-7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,001-0,05 ТЦД₅₀ на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре 36-37°С. Через 8-10 часов культивирования проводят подсчет живых и мертвых клеток путем окраски трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то культивирование продолжают еще 2-3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов.

Количество 146S и 75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см³. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до 4-8°С. В охлажденную суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).

Расчетный объем геля ГОА 3%-ной концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/см³ Р<0,01 n=10, a концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/см³. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10%-ный раствор сапонина до конечной концентрации не менее 0,075%.

Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТу 28085-89.

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 см³, затем подкожно в дозе 10 см³. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Пример 5

Проведены испытания на КРС противоящурной вакцины инактивированной сорбированной из штамма «Амурский» №1987, изготовленной так, как описано в примере 4.

КРС массой 200-250 кг иммунизировали подкожно, вводя по 2 см³ цельной вакцины и в разведении 1:5. Вакцина в цельном виде уже на 10 день после вакцинации (ДПВ) индуцировала достаточный уровень вируснейтрализующих антител (4,73±0,62 лог₂), а к 20 ДПВ количество вируснейтрализующих антител (ВНА) увеличилось в 2 раза до 5,65±0,20 лог₂. Протективная (защитная) доза вакцины для 50% животных (ПД₅₀) была равной 0,25 см³, т.е. в прививной дозе 2 см³ содержалось 8ПД₅₀, что свидетельствует о высокой иммуногенной активности сорбированной вакцины.

Пример 6

Проведены сравнительные испытания на морских свинках иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа Азия-1 из штамма «Амурский» №1987 и вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа Азия-1 из штамма №1737/Грузия/2000, изготовленных так, как описано в примере 4.

Для определения иммуногенной активности каждого препарата использовали по 128 морских свинок и дополнительно для контроля 4 группы морских свинок по 6 животных в каждой. Вакцины вводили в цельном виде и разбавленные фосфатным буфером в соотношении 1:3, 1:9 и 1:27. На каждое разведение вакцин брали по 8 морских свинок. Каждую группу их 8 свинок содержали в отдельном вольере, на котором закрепляли этикетку с указанием серии вакцины, ее разведения, даты начала испытаний и количества животных, привитых данным разведением.

Каждую вакцину вводили 16 группам морских свинок внутримышечно в объеме 2 см³ в область правого и левого бедра по 1 см³. Невакцинированные группы морских свинок использовали для проверки активности контрольных серотипов вируса ящура.

За вакцинированными морскими свинками вели наблюдение в течение 21 суток. После этого всех привитых и контрольных свинок заражали адаптированным к морским свинкам вирусом ящура штаммов Азия-1 №48, Азия-1/Иран/58/59, Азия-1/Шамир 3/89 и Азия-1 «Амурский» №1987. Вирусную суспензию вводили морским свинкам интрадермально в плантарную поверхность одной из задних лапок в дозе 10⁴ ГД₅₀/0,1 см³. Учет результатов заражения проводили через 3, 5 и 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса на передних и одной из задних лапок. Генерализацией считали образование вторичных афт хотя бы на одной лапке, в которую не вводили вирус. Контроль вакцины считали действительным, если из 6 невакцинированных свинок генерализованной формой ящура заболевали 6 животных. В таблице 6 представлены результаты изучения на морских свинках иммуногенной активности моновалентных противоящурных вакцин инактивированных сорбированных из штамма Азия-1 №1737/Грузия/2000 и штамма Азия-1 «Амурский» №1987 при контрольном заражении гомологичным и гетерологичными штаммами вируса ящура Азия-1 №48, Азия-1 №1737/Грузия/2000, Азия-1/Шамир 3/89 и Азия-1 «Амурский» №1987. Вакцина, приготовленная из штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1, при проверке на морских свинках оказалась высокоиммуногенным препаратом как против гомологичного вируса, так и против гетерологичного вируса штамма Азия-1/Шамир 3/99 (ИмД₅₀ составляет 0,047 и 0,065 соответственно) и менее иммуногенна против вируса ящура штаммов Азия-1 №48 и Азия-1 №1737/Грузия/2000 (ИмД₅₀=0,23).

Вакцина, приготовленная из производственного штамма Азия-1 №1737/Грузия/2000 при проверке на морских свинках оказалась высокоиммуногенной против всех изучаемых штаммов вируса ящура: Азия-1 №48, Азия-1 №1737/Грузия/2000, Азия-1/Шамир 3/89 и Азия-1 «Амурский» №1987. Однако ее иммуногенность в 2,3 раза выше по отношению к гомологичному вирусу (ПД₅₀МС=37,04) по сравнению с эпизоотическим штаммом «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 (ПД₅₀МС=20,41).

Пример 7

Для изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура Азия-1 вирус штамма «Амурский» №1987 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют, очищают от балластных примесей, контролируют полученный антиген на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность так, как описано в примере 4.

Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией. Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6°С до момента использования в вакцине.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно. Из масляных адъювантов можно использовать масляный адъювант ВНИИЗЖ (7), а также масляный адъювант марки Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).

В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную против вируса ящура Азия-1, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов, общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 2 см³ и для КРС в дозе 5 см³ через 3-21 ДПВ. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S и 75S компонентов.

Пример 8

Проведены испытания иммуногенной активности противоящурной вакцины инактивированной эмульсионной из штамма «Амурский» №1987, изготовленной так, как описано в примере 7. Иммуногенная активность данной вакцины проверена на подсвинках массой 40-50 кг.Результаты исследований представлены в таблице 7. ПД₅₀ вакцины составила 0,05 см³, т.е. в прививном объеме 2 см³ содержалось 40 ПД₅₀ для свиней. Подсвинки, привитые цельной вакциной, на 21 ДПВ имели титр ВНА, равный 6,07±0,24 лог₂. После контрольного заражения заболели с генерализацией процесса 2 контрольных подсвинка и 1 подсвинок, вакцинированный разведением вакцины 1:25.

Испытанная эмульсионная вакцина имела высокую иммуногенную активность на свиньях (40 ПД₅₀/2 см³).

Пример 9

Вирус ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250-300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000-10000000 ИД₅₀/см³ с антибиотиками, вводят по 0,2-0,3 см³ в 20-40 каналов интрадермолингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20-30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцом. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей вышеописанным способом с последующим добавлением в нее антибиотиков и глицерина. Полученную суспензию вируса оценивают в РСК на типо- и штаммоспецифичность. Активность вируса должна быть не меньше 1:4. Инфекционную активность определяют на КРС. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционности не меньше 10⁴ ИД₅₀/см³. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при (-40)-(-70)°С.

Пример 10

Вирус ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на свиньях, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на свиньях, заражая 1-2 животных массой 30-50 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение 2 лет не проводили вакцинацию скота против ящура. Вируссодержащую суспензию вводят под слизистую оболочку языка или в кожу венчика конечностей. Созревшие афты снимают через 24-48 часов после заражения. Приготовление суспензии вируса и контроль его активности осуществляют так, как описано в примере 9. Титрование инфекционной активности вируса ящура проводят на свиньях и в культуре клеток СП.

Пример 11

Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной сорбированной из вируса ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987, изготовленной так, как описано в примере 4, осуществляли следующим образом. Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 10 голов КРС массой 200-250 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны. Первой группе животных из 5 голов КРС ввели вакцину подкожно в цельном виде. Второй группе животных из 5 голов КРС ввели подкожно разведение вакцины на фосфатно-буферном растворе в соотношении 1:5. Объем прививной дозы составил 2 см³. На 20 ДПВ у 10 вакцинированных и 2 контрольных голов КРС взяли пробы крови и провели контрольное заражение животных введением под слизистую языка суспензии вируса ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987 второго пассажа на КРС в дозе 10⁴ ИД₅₀/0,2 см³.

Антигенную активность вакцины контролировали по уровню ВНА в сыворотке крови в РН на монослое клеток свиной почки. На 20 ДПВ ВНА у КРС, привитых цельной вакциной, составил 5,65±0,20 лог₂ р<0,001. Через 8 дней после заражения провели патологоанатомическое исследование КРС. Заболели 2 контрольных животных и 1 животное, привитое разведением вакцины 1:5. ПД₅₀ вакцины составила 0,25 см³. Прививная доза вакцины содержала 8 ПД₅₀, что свидетельствовало об эффективности препарата. Такая вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.

Пример 12

Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной эмульсионной из вируса ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987, изготовленной так, как описано в примере 7, осуществили следующим образом.

Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 17 голов свиней массой 30-50 кг. Свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Двух животных использовали в качестве контрольных. Первую группу животных иммунизировали внутримышечно цельной дозой вакцины объемом 2 см³, содержащей 6,0 мкг иммуногенных компонентов вируса ящура типа Азия-1 штамма «Амурский» №1987. Вторую группу животных иммунизировали разведением вакцины 1:5, а третью - разведением 1:25. На 21 ДПВ 15 вакцинированным и 2 контрольным свиньям под слизистую языка ввели суспензию афтозного вируса ящура Азия-1 штамма «Амурский» №1987, адаптированного к свиньям, в дозе 10⁴ ИД₅₀/0,2 см³. Количество ВНА у свиней, привитых цельной дозой вакцины, было равным 6,07±0,24 лог₂ р<0,001. На 8 день после заражения провели патологоанатомическое исследование животных. Заболели генерализованной формой ящура 2 контрольных и 1 животное, привитое разведением вакцины 1:25. ПД₅₀ вакцины составила 0,05 см³. Прививная доза вакцины содержала 40 ПД₅₀ для свиней.

Таким образом, вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1».

1. Ререр X. Ящур. Пер. с нем. Г.А.Сурковой. / Под ред. и с предисл. канд. вет. наук. П.В.Малярца. - М.: Колос, 1971, 432 с.

2. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИИТИБП, 1998, С.532-548.

4. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.1991 г.

5. Пат. РФ №2218397, C12N 7/00, A61K 39/135 // (C12N 7/00, C12R 1/93), 10.12.2003 г.

6. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура. Владимир, 2002, 31 с.

7. Пат. РФ №2108111, А61K 39/39 // А61K 39/00, 39/102, 39/12, 39/135, 10.04.1998 г.

Таблица 1Антигенный спектр штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1 по данным РСКСравниваемые штаммыПОКАЗАТЕЛИr₁r₂R%Азия-1 №480,160,4226Азия-1 №1737/Грузия/20000,080,2213Азия-1 №1730/Иран 58/990,070,6423Азия-1 №1731/Таиланд 2/950,220,8042Азия-1 №1960/Таджикистан/20040,280,5640Азия-1/Шамир 3/890,200,1517Азия-1/Пакистан 1/540,230,1418Азия-1/Иран 1/730,180,6033

Таблица 2Биологические свойства эпизоотического изолята №1987/05 «Амурский» вируса ящура типа Азия-1Система репродукции вирусаВремя проявления биологической активности (часы)Количество адаптационных пассажейХарактеристика адаптированного материалаАктивность в РСКТитр инфекционности lg ТЦД₅₀млСП2031:26,0ПСГК-301831:46,33IB-RS-22241:87,66ВНК-212451:127,5-8,25

Таблица 3
Определение типа вируса в 33%-ной суспензии афтозного материала (экспертиза №1987/05 «Амурский»)г/и сыворотки в рабочем разведенииЭкспертиза №1987Контрольцельный1:21:41:81:16 А₂₂O₁C₁Азия-1САТ-1САТ-2САТ-3ВС ИндианаВС НДК/сА₂₂ №550----- 4---------O₁ №194----- -4--------C₁ №564----- - 4-------Азия-1 №4844--- ---4------CAT-1 №96----- --- 4-----CAT-2----- -----4----CAT-3----- ------4---ВС Индиана----- -------4--ВС Нью-Джерси----- --------4-Без сыв.-----к/а--------- Примечание: 4-100% задержка гемолиза
- полный гемолиз

Таблица 4
Характеристика диагностической сыворотки, полученной на антиген из штамма «Амурский» №1987 вируса ящура типа Азия-1Наименование препаратаОбъем (мл)Активность в РСКс гомологичным диагностикумомс гетерологичными диагностикумами Азия-1№48№1737№1238Пакистан 1/54гипериммунная сыворотка2251:1601:201:101:201:20

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен новый производственный штамм вируса ящура типа Азия-1, депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером «Амурский» №1987-ДЕП. Изобретение расширяет арсенал производственных штаммов вируса ящура типа Азия-1, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью и пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1. 1 ил., 7 табл.

Штаммм вируса ящура, Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, типа Азия-1, депонированный в коллекции ФГУ «ВГНКИ» под №1987-ДЕП «Амурский», для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин или для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1.