СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ ФТОРИСТОЙ ОСТЕОПАТИИ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ФТОРИСТОЙ ИНТОКСИКАЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2007 года по МПК A61K31/375 A61K33/06 A61K33/16 A61K33/38 A61P19/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной профпатологии, и может быть использовано для профилактики хронической фтористой остеопатии.

Фтор обладает исключительной реакционной способностью среди всех неметаллических элементов. Обладая кумулятивными свойствами, он постоянно накапливается в костной ткани, ежегодно повышаясь на 0,02%, и может составлять от 0,38% до 0,41% в норме до 0,843-1,052% при хронической фтористой интоксикации (ХФИ) - флюорозе. (Авцын А.П., Жаворонков А.А. Патология флюороза. - Новосибирск. -Наука - 1981. - c.13).

Вопрос о биогенном влиянии фтора на организм остается открытым. Недостаточно изучен патогенез фтористой интоксикации на молекулярном, клеточном и функциональном уровнях. Современных данных по этим вопросам очень мало, порой они противоречивы, так как эффекты этого микроэлемента многоплановы и не могут быть охарактеризованы однозначно (Авцын А.П., Жаворонков А.А. Патология флюороза. - Новосибирск. - Наука. -1981. - c.66).

Известен способ защитной роли аскорбиновой кислоты, тиамина, рибофлавина, никотиновой кислоты при воздействиях фтора, которые способствовали выведению фтора из организма. (Габович Р.Д. Фтор и его гигиеническое значение. - М. - 1957. - 231 с.).

Недостатками способа являются:

Повышенная кислотность, возникающая под действием аскорбиновой кислоты на фоне ХФИ.

Наиболее близким способом по данной теме является назначение в дозе 300 мг/кг массы тела витаминно-минерального комплекса "Золотой шар" на модели хронической фтористой интоксикации. (Уланова Е.В., Михайлова Н.Н., Фоменко Д.В., Поздняковский В.М., Арсентьев С.Г. Влияние витаминно-минерального комплекса "Золотой шар" на течение хронической фтористой интоксикации у белых крыс. В сб. тез.: Всерос. конференции "БАД в профилакт. и клинич. медицине. - Улан-Уде. - 2003. - с.60-62.). Создание фтористой интоксикации проводили пассивным запаиванием в течение 60 дней среднетоксичной дозой фторида натрия (ежедневно с питьевой водой в концентрации 10 мг/л, что соответствует суточной дозе 3,5 мг/кг массы тела) взрослых нелинейных белых крыс - самцов.

Однако и он имеет ряд недостатков.

Форма препарата хуже усваивается и для достижения профилактического эффекта нужна более высокая доза.

Задача изобретения состоит в том, чтобы повысить эффективность профилактики при хронической фтористой интоксикации за счет использования биологически активной добавки, которая влияет на обменные процессы микроэлементов в организме и способствует выведению фтора из организма. Добавка является донором необходимого организму кальция и выступает как регулятор обмена паратиреоидного гормона и кальцитонина.

Поставленная задача решается тем, что при моделировании фтористой интоксикации в эксперименте пассивным запаиванием раствора фторида натрия одновременно вводят в питание дополнительную добавку, содержащую минеральные компоненты. В качестве дополнительной добавки вводят биологически активную добавку "ALKA-Mine" в количестве от 2 мг/кг до 4 мг/кг массы тела экспериментального животного. Новизна изобретения состоит в том, что:

- в питание вводят биологически активную добавку "ALKA -Mine";

- добавка вводится в количестве от 2 мг/кг до 4 мг/кг массы тела экспериментального животного.

Предлагаемая биологически активная добавка является поставщиком минерального комплекса, по своему составу приближенному к минеральному составу костной ткани. Добавка благоприятно влияет на биофизические параметры среды организма: рН среды, окислительно-восстановительный потенциал, структурирует воду. А также способствует повышению эластичности мышц и суставов. Положительно влияет на сердечно-сосудистую систему, органы пищеварения.

Эффективность способа объясняется тем, что дополнительное поступление кальция в организм в комплексе с другими минералами уменьшает деградацию соединительной ткани, так как не происходит снижения уровня С-концевых телопептидов и остеокальцина, что свидетельствует об уменьшении повреждающего действия фтора на коллаген и неколлагеновые белки кости. Снижается уровень ПТГ, восстановление уровня кальцитонина у животных, получающих вместе с фтористым натрием предлагаемую добавку, что приводит к уменьшению деградации костной ткани. Усиливается экскреция фтора с мочой, что приводит к детоксикации организма. Добавка выступает как донор необходимого организму кальция и как регулятор обмена паратиреоидного гормона и кальцитонина, что важно при лечении остеопатий.

Биологически активная добавка "ALKA -Mine" компании Coral Clab Int.-RBC содержит в 1 г.: измельченный коралл 993 мг, L-аскорбиновой кислоты 5 мг, серебро 2 мг. Измельченный коралл содержит около 70 жизненно важных элементов, в том числе кальций - 34,6%, магний - 2,16%, а также натрий, серу, железо, калий, фосфор, йод, бром, марганец, хром, бор, углерод, цинк, селен, медь, золото и др. 1 г. Добавки разводят в 1,5 л воды и выпивают в течение дня. Для увеличения концентрации компонентов и достижения лечебного эффекта допускается уменьшение количества воды.

Эффективность способа доказана в экспериментах проведенных на взрослых нелинейных белых крысах - самцах. Животных делили на четыре группы: 1 - интактную, 2 - с ХФИ, которую моделировали пассивным запаиванием в течение 60 дней среднетоксичной дозой фторида натрия (ежедневно с питьевой водой в концентрации 10 мг/л, что соответствует суточной дозе 3,5 мг/кг массы тела), 3 - с ХФИ и назначением добавки "ALKA-Mine" в дозе 2 мг/кг и 4 группа - с ХФИ и назначением добавки "ALKA-Mine" в дозе 4 мг/кг.

Критерием развития хронического флюороза являлись клиническое состояние экспериментальных животных (утрата блеска шерсти, отставание в весе, "тигроидность" окраски зубной эмали) и динамика содержания фтора в моче, которую собирали в обменных клетках через каждые 7 дней.

Содержание фтора в моче определяли методом Голованова (Журнал Гигиена труда и профзаболеваний. - №4. - 1977. - С.55), фосфора, кальция и магния - колориметрическим методом с помощью наборов фирмы "Биоком" на фотометре ПМ - 750 (Германия). С-концевые телопептиды (фрагменты деградации коллагена 1-го типа) определяли иммуноферментным тестом наборами CrossLaps.

В конце эксперимента у выживших животных забирали кровь после декапитации для определения в ней биохимических показателей. Анализ плазмы производили фотоколориметрическим методом на анализаторе FP-901 М (Финляндия). Содержание сывороточного остеокальцина и гормонов (паратиреоидного и кальцитонина) - иммуноферментным тестом наборами Diagnostic System Laboratories и Nordicbioscience на Мультискане EX (Labsystems, Финляндия).

Статистический анализ результатов проводился на основе расчета средних арифметических (М) и их ошибок (±m) генеральных совокупностей (Лакин Г.Ф. Биометрия. - М. - Высшая школа. 1980. - с.97-104).

Компьютерная обработка данных осуществлялась программой "Multiscan Magic".

Полученные в ходе эксперимента данные показали корректность выбранной модели и ее адекватность некоторым звеньям патогенеза производственного флюороза.

Как можно видеть из таблицы, исходный уровень фтора в моче составил 1,8±0,2 ммоль/л. Через 14 дней с начала эксперимента его концентрация у животных с ХФИ увеличилась в 3 раза, затем к 3-4 неделе этот показатель снижался и достоверно не отличался от контроля. Начиная с 6-й недели, количество фтора в моче поступательно повышалось и к 9-й неделе достигло 17,5±1,4 ммоль/л, почти десятикратно превысив фоновые значения.

Содержание кальция в моче в контроле составило 1,4±0,1 ммоль/л, через 2 недели после ХФИ этот показатель снизился в 1,5 раза, а с 3 недели его уровень достоверно повышался. К 6-й неделе концентрация катиона стала ниже контрольных значений, начиная с 7-й поступательно увеличивалась и к концу эксперимента превысила фон в 2 раза.

Экскреция фосфора неорганического в контроле составила 31,3±1,6 ммоль/л и сохранялась таковой у животных с ХФИ в течение четырех недель после начала запаивания. Затем отмечалось его поступательное увеличение и к концу эксперимента наблюдался пик повышения уровня фосфора в моче до 75,8±3,4 ммоль/л.

Таким образом, в условиях экспериментального флюороза у животных на второй неделе запаивания уровень фтора в моче резко увеличивается, а кальция снижается. Начиная с 3-й и до 6-й недели содержание фтора в моче снижается до контрольных значений при значительном выбросе из организма кальция. К концу эксперимента содержание в моче обоих электролитов значительно увеличивается. Компенсаторные взаимоотношения фтора и кальция в организме, очевидные на ранних стадиях фтористой интоксикации, нарушаются в более поздние сроки ее развития.

Усиленное выведение кальция с мочой свидетельствует о вымывании его из организма, прежде всего, из костной ткани - отрицательно заряженный ион фтора атакует положительные ионы кальция, образуя слаборастворимую соль CaF₂, которая выводится из организма. Это положение согласуется с мнением ряда авторов, полагающих, что одним из инициальных факторов в патогенезе флюороза является нарушение фосфорно-кальциевого обмена.

Первопричиной гомеостатических сдвигов уровня F, Са и Р в условиях фтористой интоксикации является нарушение, прежде всего, состояния костной ткани. Фтор обладает тропностью к кальцию, а 99% всего кальция организма содержится в костной ткани. Кроме того, из виду упускается тот факт, что кость является сконцентрированной массой соединительной ткани, занимающей первое место по содержанию в ней коллагена (Разумов В.В. Флюороз как проявление преждевременного старения и атавистического остеогенеза. Монография. - Томск. - 2003. - 112 с.].

Коллаген составляет почти 90% органического матрикса кости. Коллагеновый состав кости фактически представлен коллагеном I типа.

Костная ткань постоянно ремоделируется на основе двух разнонаправленных метаболических процессов: образованием новой костной ткани остеобластами и разрушением (резорбцией) старой кости остеокластами. Соотношение этих процессов может оцениваться с помощью биохимических маркеров костеобразования и резорбции: сывороточного остеокальцина и С-концевых телопептидов мочи. Последние определяются с помощью твердофазного иммуноферментного анализа [ELISA] и являются чувствительными и специфичными маркерами костной резорбции.

С-концевые телопептиды - отделы молекулы коллагена, содержащие перекрестные связи (пиридиновые "сшивки") между пептидными цепями, стабилизирующие молекулу. Определение пиридиновых "сшивок" в моче имеет ряд преимуществ: относительно более высокая специфичность этих структур для обмена костной ткани, отсутствие их метаболических превращений in vivo до выведения с мочой (Риггз Б.Л., Мелтон Л.Дж. Остеопороз (этиология, диагностика, лечение). - М. - Бином. 2000. - с.61).

Во время обновления костной ткани коллаген деградирует и небольшие пептидные фрагменты (С-концевые телопептиды) экскретируются.

В наших экспериментах содержание коллагеновых фрагментов костной ткани увеличилось в 2,5 раза в моче животных с фтористой интоксикацией, что свидетельствует о токсичном действии фтора на костную ткань, сопровождающегося ее резорбцией (таблица, строка 6). В таблице приведены показатели, полученные в конце эксперимента.

Основным неколлагеновым белком костной ткани является остеокальцин, который рассматривается как наиболее специфичный белок костной ткани. Он способен связывать кальций с помощью расположенных по соседству карбоксильных групп. Остеокальцин, синтезируемый преимущественно остеобластами и включающийся во внеклеточный матрикс костной ткани, может считаться специфическим маркером костеобразования. При этом незначительная его часть попадает в систему циркуляции.

Как можно видеть в таблице, ХФИ сопровождается трехкратным повышением остеокальцина в сыворотке, что свидетельствует о неспособности его включаться в костную ткань, вероятно, из-за занятых фтором всех свободных для связывания электронных уровней.

Известна непосредственная "заинтересованность" паращитовидных желез и С-клеток щитовидной железы при самых различных состояниях, сопровождающихся нарушением фосфорно-кальциевого обмена (Авцын А.П., Жаворонков А.А. Патология флюороза. - Новосибирск. - Наука. 1981. - с.230, Meyer R.A., Meyer M.H. Thyrocalcitonin Injection to rats increases the Liver Inorganic Phosphate. - Endocrinology. - v.96. - №4. - 1975. - р.1048-1050.).

В наших экспериментах показатели паратиреоидного гормона (ПТГ) в сыворотке у животных, затравленных фтористым натрием, оказались в 5 раз выше контрольных значений (таблица, строка 1).

Известно, что ПТГ - потенциальный гормон резорбции костной ткани, который in vivo повышает количество и активность остеокластов, обладает кальциймобилизующими свойствами и повышает концентрацию кальция в сыворотке крови in vivo.

Несмотря на то, что паратгормон, стимулируя активность остеокластов, высвобождает ионы кальция и фосфора неорганического (на фоне активно протекающего процесса резорбции костной ткани и потери кальция), в то же время он усиливает реабсорбцию кальция в дистальных почечных канальцах, сохраняя его физиологический уровень в плазме крови. С точки зрения поддержания жесткого параметра гомеостаза ионизированного кальция в крови данный механизм целесообразен, хотя осуществляется не в пользу сохранения целостности костной ткани.

ХФИ сопровождается также повышением уровня кальцитонина, обладающего гипокальциемическим и гипофосфатемическим действием. На клеточном уровне кальцитонин является очень мощным прямым ингибитором остеокластной активности и образования остеокластов, в результате чего уменьшается мобилизация кальция из кости (Риггз Б.Л., Мелтон Л.Дж. Остеопороз (этиология, диагностика, лечение). - М. - Бином. 2000. - С.34-35).

Таким образом, фтор, обладая высокой реакционной способностью и тропностью к кальцию, при повышенном поступлении в организм вызывает кратковременную гипокальциемию, которая служит пусковым механизмом гиперактивности паращитовидных желез. В связи с этим происходит гиперпродукция паратгормона. Естественно, что увеличенное поступление гормона с кальциймобилизующими свойствами должно сопровождаться усилением активности С-клеток щитовидной железы, вырабатывающих гормон с кальций-пексическими свойствами и служащих естественным антагонистом паратгормона. Мы полагаем, что компенсаторно-приспособительные реакции гормональной системы связаны с адаптацией организма к повреждающему действию фтора и не имеют связи с развитием вторичного гиперпаратиреоза.

Анализ результатов экспериментальных исследований показал, что в патогенезе фтористой интоксикации важнейшую роль играет повреждение коллагена. Об этом свидетельствует значительное повышение уровня продуктов деградации коллагена в моче животных, получавших фтористый натрий, а также повышение уровня остеокальцина в сыворотке - неколлагенового белка костной ткани.

В результате воздействия фторидов происходит трехкратное увеличение секреции ПТГ, которое усиливает процессы дегенерации костной ткани, для сохранения концентрации ионизированного кальция плазмы крови на физиологическом уровне. На этом фоне отмечается повышение уровня кальцитонина, которое носит компенсаторный характер, предохраняя кость от избыточной резорбции.

Таким образом, экспериментальные исследования убедительно показывают, что с увеличением поступления фтора в организм возникает дезорганизация как механизмов регуляции метаболизма, так и различных видов обмена веществ, сопровождающаяся преобладанием процессов резорбции костной ткани и тяжелым состоянием организма, порой не совместимым с жизнью. Так, к концу эксперимента 26% животных с ХФИ погибли.

Среди животных, получавших коралловую воду, обнаружен более низкий уровень С-концевых телопептидов по сравнению с животными, подвергавшимися воздействию фторидов, что свидетельствует о менее выраженных процессах деградации соединительной ткани.

Исследование уровня остеокальцина в изучаемых группах животных показал сходные закономерности - значительное повышение уровня остеокальцина среди животных, затравленных фтористым натрием сравнительно с животными контрольной группы. Показатели уровня остеокальцина у животных, употреблявших коралловую воду, не отличаются от таковых показателей животных контрольной группы, следовательно, происходит восстановление остеобластической активности.

Показатели паратиреоидного гормона наиболее высокими оказались у животных, затравленных фтористым натрием, и более чем в три раза превышали уровень паратиреоидного гормона у интактных животных. Значительное повышение ПТГ под воздействием фтора можно объяснить тем, что фтор связывает кальций крови, следствием этого является усиленный выброс ПТГ для поддержания адекватного уровня кальция в крови. Вместе с тем образуется порочный круг, когда на фоне деградации коллагена усиливаются процессы резорбции костной ткани, а компенсаторное усиление секреции ПТГ, необходимое для поддержания кальциевого гомеостаза, также усиливает резорбцию кости. Добавление в рацион животных кораллового кальция приводит к достоверному снижению ПТГ по сравнению с уровнем этого гормона у животных, получавших только фтористый натрий.

Кальцитонин, ингибируя активность остеокластов, снижает резорбцию костной ткани, препятствуя тем самым мобилизации кальция. В данном эксперименте отмечается повышение уровня кальцитонина у крыс, подвергшихся воздействию фтора. Вероятно, это повышение является реакцией на усиление процессов ремоделирования кости и повышение уровня паратиреоидного гормона. Коралловый кальций приводит секрецию кальцитонина к физиологической норме. Что свидетельствует о прекращении резорбции кости и преобладании в ней остеобластической деятельности.

Экскреция фтора с мочой закономерно повышена у животных, получавших фтористый натрий. Дополнительное введение в питьевой режим кораллового кальция существенно усиливает выведение фтора из организма крыс. По-видимому, процесс усиления выведения фторидов обусловлен ощелачиванием мочи, а также связыванием фтора коралловым кальцием в виде слаборастворимой соли CaF₂. Подтверждением последнего является усиленное выведение с мочой кальция у животных, получавших коралловую воду.

Таким образом, коралловый кальций, содержащийся в добавке "ALKA-Mine", существенно модифицирует течение экспериментальной фтористой интоксикации. Эффект его действия проявляется снижением уровня концевых телопептидов и остеокальцина, что свидетельствует об уменьшении повреждающего действия фтора на коллаген и неколлагеновые белки кости. Еще более выражен эффект кораллового кальция на уровень гормонов, регулирующих кальциевый гомеостаз. Отмечено существенное снижение ПТГ и восстановление уровня кальцитонина до контроля у крыс, получавших вместе с фтористым натрием коралловый кальций, что в конечном итоге приводит к уменьшению процессов деградации костной ткани.

Пример 1

Проводился эксперимент по описанной выше методике

Рекомендуемая производителями оздоровительная доза для людей, не страдающих заболеваниями, 2 мг/кг биологической добавки "ALKA-Mine" вызывала незначительный положительный эффект, что при фтористой остеопатии вполне закономерно, так как фтор является одним из самых активных элементов и способен замещать в соединениях даже кислород. Как видно из таблицы (столбец 3), результаты при применении добавки при ХФИ в дозе 2 мг/кг достоверно не отличались от группы с ХФИ.

Пример 2

Проводился эксперимент по описанной выше методике.

Значительное вымывание кальция из костей при ХФИ ставит необходимость в увеличении профилактической дозы биологической добавки "ALKA-Mine" до 4 мг/кг. Увеличение дозы в 2 раза привело к значительному улучшению биохимических показателей крови и мочи, как видно из таблицы (столбец 4), и скорректировало гормональный дисбаланс, возникший при воздействии ХФИ на организм животных.

Коралловый кальций биологически активной добавки "ALKA-Mine" значительно усиливает экскрецию фтора с мочой, что является существенным компонентом детоксикации организма. Таким образом, коралловый кальций является препаратом, применение которого при фтористой интоксикации значительно снизит токсическое воздействие фтора на организм.

Полученные результаты позволяют обосновать применение кораллового кальция для профилактики фтористой остеопатии. Коралловый кальций в этой ситуации выступает не только как донор необходимого организму кальция, но также как регулятор обмена паратиреоидного гормона и кальцитонина, что чрезвычайно важно при лечении остеопатии. Достигнуто достоверное снижение ПТГ, уровень кальцитонина понижается до физиологической нормы.

Представляется вполне обоснованным применение кораллового кальция не только при развитии костной патологии, но и при заболеваниях, связанных с преимущественным поражением хрящевой ткани, поскольку применение кораллового кальция уменьшает процесс деградации коллагена, который лежит в основе поражения хряща.

Влияние ХФИ на биохимические показатели крови и мочи крыс (М±m).ПоказателиИнтактные крысы (n=30)Крысы с ХФИ (n=30)Крысы с ХФИ + корал. вода, 2 мг/кг (n=15)Крысы с ХФИ + корал. вода, 4 мг /кг (n=15)1. ПТГ сыворотки (пг/мл)1,2±0,25,2±1,1*4,9±1,1*3,6±1,3*2. Кальцитонин сыворотки (пг/мл)2,6±0,73,6±0,83,5±0,72,8±0,73. Кальций плазмы (ммоль/л)2,0±0,032,0±0,02  4. Фосфор плазмы (ммоль/л)2,3±0,042,4±0,06  5. Остеокальцин сыворотки (нг/мл)1,0±0,23,2±0,9*2,0±0,40,9±0,46. С-конц. телопепдиты мочи (мкг/л)1,5±0,33,7±0,8*3,1±0,52,5±0,57. Фтор мочи (ммоль/л)1,8±0,217,5±1,4***17,5±2,4***17,0±2,4***8. Кальций мочи (ммоль/л)1,4±0,12,9±0,4*3,2±0,2**4,2±0,2**9. Фосфор мочи (ммоль/л)31,3±1,675,8±3,4**  Обозначения: * - достоверные отличия показателей по сравнению с интактной группой животных, при р≤0,01.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной профпатологии, и может быть использовано для профилактики хронической фтористой остеопатии. Для этого при моделировании хронической фтористой остеопатии, создаваемой ежедневным введением с питьевой водой фторида натрия в дозе 3,5 мг/кг, одновременно вводят биологически активную добавку "ALKA-Mine" в дозе 2-4 мг/кг массы тела экспериментального животного. Способ обеспечивает уменьшение деградации костной ткани и выведение фтора из организма за счет оптимального минерального состава биологически активной добавки. 1 табл.

Способ профилактики хронической фтористой остеопатии при моделировании фтористой интоксикации в эксперименте, создаваемой ежедневным введением с питьевой водой фторида натрия в дозе 3,5 мг/кг, включающий одновременное введение в питание дополнительной добавки, содержащей минеральные компоненты, отличающийся тем, что в качестве дополнительной добавки вводят биологически активную добавку "ALKA-Mine" в количестве от 2 до 4 мг/кг массы тела экспериментального животного.