СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИХ ДАТЧИКОВ Российский патент 2007 года по МПК G01N27/416 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к методам изготовления высокочувствительных потенцио-метрических датчиков, чувствительным элементом в которых является электропроводящая полимерная пленка. Данное изобретение может быть использовано в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве, экологии, а также при мониторинге окружающей среды и контроле качества пищевых продуктов, в частности в ходе лабораторного тестирования жидкостей, имеющих биологическое происхождение или отобранных из окружающей среды, проводимого в целях клинической диагностики, исследований протеинов, клеточного анализа, контроля и исследования состояния окружающей и промышленной сред.

Предпосылки создания изобретения

Использование датчиков, в которых функцию чувствительного элемента выполняет электропроводящая полимерная пленка, является одним из наиболее перспективных и привлекательных методов количественного электрохимического анализа [1]. В настоящее время имеется ряд описаний электрохимических датчиков, основу которых составляют электропроводящие полимеры. Эти датчики различаются между собой по принципу проведения измерений (амперметрические, вольт-амперметрические, хеморезистивные, потенциометрические), а также по способу получения аналитических сигналов (измерительные преобразователи прямого и непрямого действия).

Амперметрический сигнал возникает при приложении к датчику постоянного напряжения от внешнего источника и измерения величины тока, определяемой химической и/или биохимической реакцией, происходящей в чувствительном объеме датчика [2]. В принципе аналогичным образом работают вольт-амперметрические и хеморезистивные датчики с той только разницей, что прилагаемое к ним напряжение не является постоянным, а изменяется в соответствии с установленными для конкретного метода измерений параметрами [2, 3].

Как правило, амперметрические и вольт-амперметрические методы требуют использования дорогостоящего оборудования, включающего амперметр, внешний источник напряжения или стабилизатор напряжения, противоэлектрод и эталонный электрод [2].

Выходные сигналы потенциометрических устройств обусловлены изменением окислительно-восстановительного состава электропроводящего полимера, связанным с протеканием химической и/или биологической реакции, которая сопутствует изменениям в установившемся потенциале потенциометрического датчика [2, 4, 5]. Авторы данного изобретения обнаружили, что потенциометрические датчики обладают рядом преимуществ по сравнению с амперметрическими и вольт-амперметрическими измерительными преобразователями. Одним их таких преимуществ является то, что потенциометрические методы не требуют использования сложного оборудования. Обычно потенциометрический прибор состоит из самого датчика, эталонного электрода и высокоомного вольтметра [2, 6]. Во-вторых, сигнал не зависит от площади поверхности или от формы датчика [2]. В-третьих, в случае применения потенциометрического метода проблемы, связанные с процессами диффузии, протекающими внутри электрохимической ячейки и приводящими к необходимости использования для амперметрических и вольт-амперметрических методов измерений электродов сложной конструкции (например, вращающихся дисковых электродов), перестают играть сколь-либо существенную роль [2, 4].

Применение потенциометрического метода измерения может оказаться столь же простым, как и измерение рН, а потенциометрический прибор может быть схож с серийно выпускаемыми рН или ионоселективными электродами.

Все электрохимические датчики могут быть разделены на два типа действия: прямого и непрямого.

Электрохимический датчик прямого действия формирует сигнал непосредственно в момент взаимодействия между исследуемым веществом и рецепторами, зафиксированными внутри или адсорбированными на поверхности датчика. Примерами датчиков прямого действия являются амперметрические датчики ферментов [2, 7, 8], ионоселективные потенциометрические датчики [9, 10] и потенциометрические иммуносенсоры [11-13]. Как правило, контакт с анализируемым веществом и процедура измерения осуществляются одновременно.

Сигнал электрохимического датчика непрямого действия формируется благодаря присутствию дополнительных реагентов, определенных для исследуемого вещества, которые несут электрохимически активные метки. Примерами датчиков, относящихся к группе измерительных преобразователей непрямого действия, являются амперметрические и потенциометрические датчики ферментов [2], потенциометрические датчики, чувствительные к измерению поверхностного потенциала [14, 15], а также вольт-амперметрические и хеморезистивные датчики [16-18]. Контакт с анализируемым веществом и процедура измерения разделены как по времени, так и в пространстве.

Вольт-амперметрические датчики могут быть отнесены к типу, промежуточному между датчиками прямого и непрямого действия. В этом случае в системе отсутствуют меченые реагенты, однако этапы инкубации и измерения разделены во времени и пространстве и/или растворе.

Наиболее ответственным этапом в изготовлении высокочувствительного потенциометрического датчика, чувствительным элементом в котором является электропроводящая пленка, является формирование полимерной пленки на проводящей подложке. В качестве подложки обычно используют благородный металл, углерод или полупроводниковый материал [19]. Электрохимический синтез позволяет изготавливать электропроводящие полимерные пленки, обладающие заданными химическими, электрохимическими и механическими свойствами [19].

В процессе полимеризации используются следующие компоненты: мономер(ы), полярный растворитель и, как минимум, два электрода (вспомогательный и рабочий) [19]. Поддерживающий электролит обычно вводится в состав полимеризационного раствора для того, чтобы повысить электропроводность раствора, а также для легирования полимера на стадии полимеризации [19]. Существуют три типа электрохимического синтеза: гальваностатический, потенциостатический и потенциодинамический [19].

Гальваностатический метод характеризуется тем, что постоянный электрический ток, поступающий от внешнего источника, протекает между рабочим и вспомогательным электродами, погруженными в полимеризационный раствор, в течение некоторого промежутка времени. Для контроля электрохимического потенциала рабочего электрода может применяться эталонный электрод [19-21].

При использовании потенциостатического метода обычно необходимо применение трех электродов. Контроль за током, протекающим между рабочим и вспомогательным электродами, осуществляется при помощи амперметра, юстированного при постоянном напряжении, поступающем от внешнего источника (контроль за которым, в свою очередь, осуществляется эталонным электродом) и прилагаемом между рабочим и вспомогательным электродами в течение определенного промежутка времени [19-21].

При использовании потенциодинамического метода напряжение, прилагаемое между рабочим и вспомогательным электродами, не является постоянным, но изменяется в соответствии с установленными методиками [19-21].

Наиболее важным свойством потенциометрических энзимо- и иммунодатчиками является их окислительно-восстановительная чувствительность [4], поскольку большинство ферментных реакций являются окислительно-восстановительными процессами, сопровождающимися изменением окислительно-восстановительных свойств веществ, вступивших в реакцию. Окислительно-восстановительная чувствительность датчиков, основанных на применении полимерных материалов, полностью определяется окислительно-восстановительными свойствами полимерной пленки [22], причем эти свойства, в свою очередь, определяются условиями и параметрами протекания процесса полимеризации.

Большое количество публикаций посвящено изучению окислительно-восстановительных свойств электропроводящих полимеров, например полипиррола [5, 22-27]. В ряде указанных работ [22-23, 26] было показано, что формирование потенциометрического сигнала обусловлено двумя основными механизмами. Необратимое изменение собственных окислительно-восстановительных свойств электропроводящего полимера является следствием взаимодействия между слоем полимера и обладающими электрохимической активностью продуктами; оно относится к «коррозионному типу» формирования потенциометрического выходного сигнала (отклика). Этот процесс всегда сопровождается ионным обменом между полимером и близлежащим раствором. В основе другого механизма лежит обмен электронами между окислительно-восстановительными парами на поверхности полимера через полимерную пленку. Собственные окислительно-восстановительные свойства полимера в ходе этого процесса не изменяются, также не имеет места обмен ионами между полимером и раствором. В этом случае электропроводящий полимер ведет себя как металлический потенциометрический электрод, и его поведение может быть описано теорией электронного равновесия Фрумкина [22, 28]. Такой потенциометрический отклик относится к «металлическому» типу, и он является обратимым. В действительности оба механизма действуют одновременно, однако один из них может оказаться доминирующим [22-23, 26, 27]. «Металлический» тип отклика более предпочтителен для потенциометрических окислительно-восстановительных датчиков, поскольку он позволяет получать более быстрый и сильный выходной сигнал [2, 6]. Представляется возможным изменить свойства полимерной пленки на стадии полимеризации таким образом, чтобы «металлический» механизм стал доминирующим [22-23, 26].

До настоящего времени характер поддерживающего электролита и, соответственно, тип иона легирующей примеси считались единственными факторами, отвечающими за металлические свойства полимерной пленки [22-27, 29]. Было показано, что неподвижные анионы, внедренные в полимерную пленку, не принимают участия в ионообменных реакциях, обеспечивая стабильность собственных окислительно-восстановительных свойств [23, 26]. Примерами таких электролитов могут служить додецилсульфат [23], различные красители, например индигокармин и метиленовый синий [30, 31]. Однако во всех цитированных публикациях концентрация ионов легирующей примеси в полимеризационном растворе не рассматривается в качестве фактора, отвечающего за придание полимеру металлических свойств.

Авторы настоящего изобретения рассматривают концентрацию мономера, равно как и концентрацию поддерживающего электролита в растворе для электрохимической поляризации, как наиболее важные факторы, обуславливающие окислительно-восстановительные свойства и, соответственно, окислительно-восстановительную чувствительность полимера. Известно, что концентрация мономера также может оказать влияние на проводимости полимера [19]. В соответствии с данными, полученными авторами настоящего изобретения, наивысшая окислительно-восстановительная чувствительность может быть достигнута при использовании полимеризационного раствора, концентрация мономера в котором (<0,05 М) намного меньше той, которая применяется обычно (0,05-0,5 М). Авторами настоящего изобретения обнаружено, что соотношение между концентрациями мономера и поддерживающего электролита является важнейшим фактором, отвечающим, в частности, за окислительно-восстановительные свойства и толщину полимерной пленки. До того, как авторами данного изобретения были проведены соответствующие исследования, соотношение между мономером(ами) и поддерживающим(и) электролитом(ами), а также их концентрации ранее не рассматривались в качестве факторов, отвечающих за окислительно-восстановительные свойства полимерной пленки.

Несмотря на то, что существует достаточно большое число методов электрохимического синтеза электропроводящего полимера, которые описаны в специальной литературе, ни один из них не обеспечивает соблюдения условий и параметров изготовления высокочувствительных датчиков, пригодных для потенциометрического обнаружения биомолекул при их низкой концентрации.

Ниже приведены некоторые примеры ранее разработанных методов электрохимического синтеза.

Потенциостатические методы изготовления электрохимических датчиков на основе полипиррола из водных растворов в присутствии поддерживающего электролита описаны в работах [39, 42-45].

Танигучи и др. [33] привели описание метода выращивания полипирроловой пленки из органических растворов в присутствии поддерживающего электролита с использованием гальваностатического режима. Полученные полимерные пленки использовались для изготовления потенциометрического иммунодатчика прямого действия. Основным недостатком этого метода является то, что полученные таким образом датчики обладают весьма низкой чувствительностью (мг/мл иммуноглобулина G). Другой недостаток заключается в том, что используемые при такой технологии органические растворители весьма токсичны.

Другие гальваностатические методы, в которых в качестве растворителя применяется вода, описаны в работах [13, 16, 17, 34-41].

Потенциодинамический метод электрохимической полимеризации в целях синтеза электропроводящих полимеров из водных растворов в присутствии поддерживающего электролита, применяемый для изготовления электрохимических датчиков, описан в работах [9, 10, 27, 46-49].

Большинство датчиков, изготовленных в соответствии с методами, описанными в рассмотренных выше работах, не предназначались для использования при проведении потенциометрических измерений, они служили для других типов электрохимических измерений или для улавливания. Все эти методы не подходят для потенциометрических анализов, требующих высокой аналитической чувствительности, точности и стабильности показаний. Эти методы не могут быть непосредственно доработаны до метода, описываемого в настоящем изобретении, с тем, чтобы обеспечить необходимые свойства датчиков. Процедуры проведения измерений всегда более сложны и длительны по сравнению с той методикой, которая изложена в данном изобретении.

Авторы настоящего изобретения также представили описание потенциодинамического метода изготовления потенциометрических датчиков на основе полипиррола в работах [50, 51].

Несмотря на возможность использования полимеризационных растворов с низкими концентрациями мономера(ов) в потенциодинамическом и гальваностатическом режимах [19], в большинстве цитированных публикаций приводится описание применения концентраций от 0,05 М и выше. Как подчеркивалось авторами настоящего изобретения, полимерные пленки, выращенные из концентрированных растворов мономера, не обладают высокой окислительно-восстановительной чувствительностью и, следовательно, не могут использоваться в качестве высокочувствительного элемента потенциометрического датчика, изготовленного на основе полимера.

Низкие концентрации мономера упоминались только в одном единственном исследовании [48], однако авторами этой работы использовались высокие концентрации поддерживающих электролитов (0,5 М) и поддерживающие электролиты с высокоподвижными анионами (KCl, KNO₃, NaClO₄, Na₂HPO₄), которые активно задействованы в обмене ионами между полимером и близлежащим раствором. Потенциометрический отклик таких датчиков обусловлен, в основном, механизмом коррозионного типа. Датчик такого типа не обладает достаточной чувствительностью для проведения измерений в ходе биологических окислительно-восстановительных реакций, при которых клинически или экологически обусловленные концентрации анализируемого вещества обычно могут находиться в диапазоне наномолей, фемтомолей или аттомолей. В других исследованиях в качестве ионов легирующих примесей также использовались высокоподвижные анионы, что не позволило получить датчики, обладающие высокой чувствительностью. В качестве примера можно привести работу Халаники и др. [27], в которой авторами было применено легирование полимера ионами Cl^-. В этом случае окислительно-восстановительная чувствительность датчиков проявилась только в присутствии очень высоких концентраций окислительно-восстановительных пар (порядка 0,5 М).

В других исследованиях [9,49, 51] использовался подходящий легирующий ион-додецилсульфат натрия, однако применялись высокие концентрации полимера (0,05-0,3 М), которые вновь непригодны для изготовления высокочувствительных потенциометрических окислительно-восстановительных датчиков.

Авторы настоящего изобретения определили основные факторы, которые, в сочетании, отвечают за окислительно-восстановительные свойства полимерной пленки и, как следствие, способны позволить изготовить потенциометрические датчики на основе полимера, обладающие более высокой чувствительностью, чем описанные в предыдущих работах. Этими факторами являются: концентрация мономера(ов); характер и концентрация поддерживающего электролита; параметры процесса полимеризации; соотношение между концентрациями мономера и поддерживающего электролита. В предшествующих исследованиях говорится только об одном, или о двух параметрах, или условиях, а не об их взаимоусиливающих влияниях или взаимодействиях. Авторы настоящего изобретения выявили тот факт, что высокочувствительная полимерная пленка может быть изготовлена при совместном учете всех вышеперечисленных факторов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к производству высокочувствительных воспроизводимых и стабильных в течение длительного времени потенциометрических датчиков на основе полимера.

В первую очередь изобретение относится к методу электрохимического синтеза полимерной пленки, обладающей высокой окислительно-восстановительной чувствительностью, которая может использоваться в качестве чувствительного элемента высокочувствительных потенциометрических датчиков энзимов, химических и иммунных веществ. Существуют три основных вида электрохимического анализа: гальваностатический, потенциостатический и потенциодинамический [19]. Все эти виды могут применяться при электрохимическом выращивании полипирролловой подложки как по одиночке, так и в комбинации друг с другом.

Таким образом, изобретение дает возможность реализовать метод изготовления высокочувствительных потенциометрических датчиков путем нанесения на электропроводящие электроды покрытия из электропроводящего полимера, причем указанный метод включает следующие операции:

(a) приготовление водного раствора для электрохимической полимеризации, содержащего мономерные компоненты электропроводящего полимера в концентрациях от 0,002 до 0,05 М; а также поддерживающий электролит, который также служит легирующей добавкой, в концентрациях от 0,0001 до 0,005 М;

(b) сборка ванны для электрохимической полимеризации, в состав которой входит раствор для электрохимической полимеризации, вспомогательный электрод, один или несколько рабочих электродов, на которые предполагается нанести электропроводящий полимер, и, при необходимости, эталонный электрод; и

(c) нанесение на рабочий(е) электрод(ы) полимерной пленки при помощи электрохимического синтеза полимера из раствора для электрохимической полимеризации с использованием, по крайней мере, одного из нижеперечисленных режимов электрохимической обработки:

(i) приложение между рабочим(и) электродом(ами), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, и вспомогательным электродом циклически изменяющегося напряжения в диапазоне от -0,2 до +2,0 В по отношению к эталонному электроду Ag/AgCl;

(ii) одно- или многоступенчатая подача постоянного тока, имеющего заданную плотность тока в диапазоне от 0,01 до 1 мА/см², между рабочим(и) электродом(ами), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, и вспомогательным электродом в течение определенного временного интервала таким образом, чтобы суммарное количество электричества, прошедшее через рабочий(е) электрод(ы), находилось в пределах от 10 до 250 мКл/см²;

(iii) одно- или многоступенчатое приложение постоянного напряжения в диапазоне от 0 до 3 В между рабочим(и) электродом(ами), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, и эталонным электродом в течение определенного временного интервала таким образом, чтобы суммарное количество электричества, прошедшее через рабочий(е) электрод(ы), составляло от 10 до 250 мКл/см²;

(iv) любой другой режим электрохимической обработки, при котором соблюдаются все вышеперечисленные концентрации растворов и электрохимические параметры.

В основу данного метода положены проведенные авторами исследования, на основании которых могут быть сделаны следующие выводы:

• Окислительно-восстановительная чувствительность потенциометрических датчиков на основе полимера (например, полипиррола) существенно (резко) возрастает, когда электрохимический синтез осуществляется из растворов с низкой концентрацией мономеров (например, полипиррола) (<0,05 М).

• Увеличение окислительно-восстановительной чувствительности наблюдается для диапазона концентраций мономера (например, пиррола) от 0,002 до 0,05 М в присутствии поддерживающего электролита, который также служит легирующей добавкой, например додецилсульфата натрия.

• Максимальное увеличение окислительно-восстановительной чувствительности наблюдается тогда, когда соотношение между молярной концентрацией мономера (например, полипиррола) и поддерживающего электролита составляет приблизительно 25:1 (хотя в рамках данного изобретения возможно применение и других соотношений) и используется один или несколько из нижеперечисленных методов электрохимической полимеризации:

i) Потенциодинамический режим: Приложение между рабочим(и) электродом(ами), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, и вспомогательным электродом циклически изменяющегося напряжения в диапазоне от -0,2 до +2,0 В по отношению к эталонному электроду Ag/AgCl;

ii) Гальваностатический режим: Одно- или многоступенчатая подача (каскадом) тока таким образом, что суммарный электрический заряд, прошедший за время полимеризации, находился в пределах от 10 до 250 мКл/см^2;

iii) Потенциостатический режим: Одно- или многоступенчатое приложение (каскадом) уровней напряжения между рабочим электродом и эталонным электродом таким образом, что суммарный электрический заряд, прошедший за время полимеризации, находился в пределах от 10 до 250 мКл/см².

• Использование более чем одного уровня тока при гальваностатическом режиме и/или более чем одного уровня прилагаемого напряжения при потенциостатическом режиме позволяет осуществлять жесткий контроль за свойствами датчика и, следовательно, изготавливать датчики, обладающие более высокими рабочими характеристиками, например повышенной чувствительностью, по сравнению с данными, полученными при использовании в ходе электрополимеризации тока или напряжения одного уровня.

• Концентрации мономера(ов) и поддерживающего(их) элетролита(ов), соотношение между ними и применяемая методика полимеризации оказывают взаимно усиливающее (синергическое) воздействие на окислительно-восстановительную чувствительность датчиков, основанных на использовании полимера (например, полипиррола).

Результаты исследований, полученные авторами данного изобретения, не являются тривиальными, поскольку, как уже отмечалось ранее, соотношение между окислительно-восстановительной чувствительностью и такими параметрами, как концентрация мономера(ов), характер и концентрация поддерживающего электролита, а также соотношение между ними и параметры процесса полимеризации не рассматривались в предшествующих публикациях. Имеет место сильная корреляция между окислительно-восстановительной чувствительностью полимерной пленки и окончательной аналитической чувствительностью датчика. Весьма важным аспектом настоящего изобретения является результат, подтверждающий возможность регулировать окислительно-восстановительную чувствительность путем изменения состава раствора и параметров процесса полимеризации. Представляется возможным изготавливать датчики, предназначенные для определения некоторых вирусных заболеваний (например, ВИЧ, поверхностного антигена вируса гепатита В), когда требуется чувствительность на уровне нескольких фемтомолей. В ряде случаев интерес представляет определение более высоких концентраций анализируемого вещества, например дигоксина (0,05-5 нг/мл) или иммуноглобулина Е (20-1000 нг/мл).

Диапазон измерений может быть смещен в сторону более высоких концентраций или растянут за счет изменения набора параметров, определяющих процесс электрохимической полимеризации, или/и состава подложки, применяемой в новых методах измерений.

Подводя итог: аналитическая чувствительность и диапазон измерений могут подгоняться под конкретное анализируемое вещество. Этого можно достичь путем уникального комбинирования определенной концентрации мономеров(а), поддерживающего электролита в полимеризационном растворе, а также установленных режимов полимеризации в купе с последующей обработкой датчиков.

Данное изобретение определяет потенциодинамический, гальваностатический и потенциостатический методы изготовления высокочувствительных потенциометрических датчиков с нанесенным на них полимерным покрытием (например, покрытых полипирролом), полученным в результате электрохимической полимеризации мономеров (например, полипиррола). Любой из этих методов может применяться в комбинации с другими методами.

Параметры потенциостатического режима были определены (рассчитаны) на основании гальваностатических процессов и проверены экспериментально. При одинаковом маточном растворе и конструкции датчиков величины напряжения и токов зависят друг от друга. Напряжение, определенное при конкретной величине тока, которая может быть применена в потенциостатическом режиме, даст приблизительно такую же величину тока, что и при гальваностатическом процессе.

Точные значения параметров для каждого метода полимеризации могут слегка изменяться в зависимости от свойств электропроводящей или полупроводниковой подложки, однако, в общем случае, все методы приводят к сопоставимым результатам и могут быть с успехом применены к любому типу электропроводящей или полупроводниковой подложки.

Параметры процесса полимеризации могут быть рассчитаны исходя либо из геометрической площади поверхности, либо из электрохимической площади поверхности датчиков, на которые наносится полимер.

Авторами данного изобретения протестированы различные конструкции датчиков. Предпочтительная конструкция датчика представляет собой кольцевой электрод, полученный методом трафаретной печати, диаметр которого равен 1,5 мм² (?), а геометрическая площадь составляет 1,77 мм². Могут быть рассмотрены другие конструкции, и изобретение не должно истолковываться как ограниченное данной конкретной конструкцией. Для расчета электрохимической площади поверхности применялся метод, в соответствии с которым электрод помещался в раствор, содержащий окислительно-восстановительные препараты (например, 5 мМ ферроцианида) и поддерживающий электролит (например, 0,1 М NaNO₃). Напряжение на электрод подавалось ступенчато, начиная с потенциала, при котором ток отсутствовал, и до потенциала, при котором все восстановленные препараты окислялись, причем осуществлялась запись величины результирующего тока во времени (хроноамперометрия). Форма зависимости тока от времени определяется уравнением Коттрелла:

I=(nFACD^0,5)/(π^0,5t^0,5),

где n - число перенесенных электронов, равное 1; F - число Фарадея (96480 Кл моль); А - площадь поверхности электрода; D - коэффициент диффузии восстановленных препаратов; I - ток; t - время. Если построить график зависимости величины тока от t^-0,5, то данные должны лечь на одну прямую, по наклону которой может быть рассчитана площадь. Возможно применение альтернативных методов оценки электрохимической площади поверхности.

Предпочтительный потенциодинамический метод включает следующие операции:

(a) приготовление водного раствора для электрохимической полимеризации, содержащего мономеры (например, пиррол) в концентрациях от 0,002 до 0,05 М; а также поддерживающий электролит, который также служит легирующей добавкой, в концентрациях от 0,0001 до 0,005 М;

(b) сборка ванны для электрохимической полимеризации, в состав которой входит раствор для электрохимической полимеризации, вспомогательный электрод, эталонный электрод, а также один или несколько электродов, на которые предполагается нанести полимерную пленку, причем электроды, на которые наносится покрытие, имеют в своем составе проводящую или полупроводниковую подложку;

(c) приложение между электродом(ами), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, и эталонным электродом циклически изменяющегося напряжения в диапазоне от -0,2 до +2,0 В (по отношению к эталонному электроду Ag/AgCl) для нанесения на электрод(ы) полимерной пленки путем электрохимического синтеза полимера из раствора для электрохимической полимеризации.

Предпочтительный потенциостатический метод включает следующие операции:

(a) приготовление водного раствора для электрохимической полимеризации, содержащего мономеры (например, пиррол) в концентрациях от 0,002 до 0,05 М; а также поддерживающий электролит, который также служит легирующей добавкой, в концентрациях от 0,0001 до 0,005 М;

(b) сборка ванны для электрохимической полимеризации, в состав которой входит раствор для электрохимической полимеризации, вспомогательный электрод, эталонный электрод, а также один или несколько электродов, на которые предполагается нанести полимерную пленку, причем электроды, на которые наносится покрытие, имеют в своем составе проводящую или полупроводниковую подложку;

(с) одно- или многоступенчатое приложение в течение определенного времени постоянного напряжения в диапазоне от 0 до 3 В между рабочим(и) электродом(ами), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, и эталонным электродом таким образом, что суммарный электрический заряд, прошедший через рабочий(е) электрод(ы), составлял от 10 до 250 мКл/см².

Данное изобретение в качестве альтернативы потенциодинамическому режиму включает гальваностатический режим электрохимического синтеза. В этом случае количество электричества, проходящего через рабочий(е) электрод(ы), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, которое составляет от 10 до 250 мКл/см² (предпочтительный интервал 10-60 мКл/см²), является результатом пропускания в течение определенного(ных) промежутка(ов) времени между рабочим(и) электродом(ами) и вспомогательным электродом постоянного электрического тока заданной плотности. Допускается подавать ток в одно- или многоступенчатом режиме. Плотность тока может изменяться в пределах от 0,01 до 1 мА/см².

Данное изобретение определяет гальваностатический метод изготовления высокочувствительных потенциометрических датчиков с нанесенным на них полимерным покрытием, полученным в результате электрохимической полимеризации, включающий следующие операции:

(a) приготовление водного раствора для электрохимической полимеризации, содержащего мономеры (например, пиррол) в концентрациях от 0,002 до 0,05 М; а также поддерживающий электролит, который также служит легирующей добавкой, в концентрациях от 0,0001 до 0,005 М;

(b) сборка ванны для электрохимической полимеризации, в состав которой входит раствор для электрохимической полимеризации, вспомогательный электрод, а также один или несколько электродов, на которые предполагается нанести полимерную пленку, причем электроды, на которые наносится покрытие, имеют в своем составе проводящую или полупроводниковую подложку;

(c) одно- или многоступенчатая подача в течение определенного времени постоянного тока установленной в диапазоне от 0,01 до 1 мА/см² плотности между рабочим(и) электродом(ами), который(е) подлежит(ат) покрытию полимером, и вспомогательным электродом таким образом, что суммарное количество электричества, прошедшее через рабочий(е) электрод(ы), будет составлять от 10 до 250 мКл/см² (предпочтительный интервал 10-90 мКл/см²).

Для контроля за ходом гальваностатического процесса можно использовать эталонный электрод или, как вариант, двухэлектродную систему, в которой отдельный эталонный электрод не применяется. Кроме того, в ходе одного процесса полимеризации возможно использовать комбинацию различных режимов. Например, в одном варианте конструкции вначале можно нанести полимерную пленку на рабочий(е) электрод(ы) в гальваностатическом режиме, затем нанести дополнительный слой полимера с применением потенциометрического или потенциостатического режима. Возможна и обратная последовательность чередования режимов. Возможно также комбинировать два и более гальваностатических режима. Такие комбинации обеспечивают большую гибкость при контролировании окислительно-восстановительного состояния полимерной пленки.

Использование нескольких вариантов подачи тока в течение различных промежутков времени в ходе гальваностатического режима позволяет изготовить полимерную пленку с заданными окислительно-восстановительными свойствами.

Для того чтобы изготовить полимерную пленку с заданными окислительно-восстановительными свойствами, можно применить комбинацию потенциодинамического(их) цикла(ов) или потенциостатической(их) и гальваностатической(их) ступени(ей).

Возможность изготовления биодатчиков с заданными окислительно-восстановительными свойствами путем комбинирования нескольких режимов полимеризации и применения различных вариантов последовательной подачи тока в ходе гальваностатического режима ранее не описывалась и представляет собой новаторскую часть данного изобретения.

Метод, изложенный в изобретении, может использоваться для нанесения полимерной пленки на одиночный электрод или на несколько электродов одновременно. Возможность нанесения покрытия на несколько электродов в ходе одной реакции полимеризации повышает воспроизводимость и снижает стоимость производственного процесса. В отличие от ранее опубликованных работ, в которых описывается нанесение покрытия только на один электрод, авторы настоящего изобретения объединили несколько электропроводящих или полупроводниковых электродов в один блок с единственным электрическим контактом, который поместили в ванну, предназначенную для электрохимической полимеризации и содержащую вспомогательный электрод, а также - для потенциодинамического и потенциостатического режимов - эталонный электрод и раствор для электрохимической полимеризации. Все электроды, на которые наносится покрытие, ведут себя как единый рабочий электрод. Теоретически количество электродов, предназначенных для одновременного нанесения покрытия, неограниченно и может достигать десятков или даже сотен штук.

Помимо вышесказанного авторы изобретения обнаружили, что высокочувствительные датчики с нанесенным на них полимерным покрытием могут изготавливаться путем комбинирования режимов электрохимической полимеризации и/или применения различных вариантов подачи тока или ступенчатого приложения напряжения в ходе режима полимеризации без ограничения использования низких (0,05 М) концентраций мономера в растворе для электрохимической полимеризации.

Таким образом, изобретение также относится к многоступенчатым методам электрохимической полимеризации, в которых используется комбинация режимов электрохимической обработки и/или режимов электрохимической обработки с несколькими вариантами подачи тока или ступенчатого приложения напряжения.

В частности данное изобретение относится к следующему:

Метод получения высокочувствительных потенциометрических датчиков путем нанесения на электропроводящие электроды электропроводящего полимера, при котором в гальваностатическом режиме ток подается двумя или большим количеством ступеней.

Метод получения высокочувствительных потенциометрических датчиков путем нанесения на электропроводящие электроды электропроводящего полимера, при котором в потенциостатическом режиме напряжение подается двумя или большим количеством ступеней.

Метод получения высокочувствительных потенциометрических датчиков путем нанесения на электропроводящие электроды электропроводящего полимера, при котором используются два режима полимеризации и более, выбранных преимущественно из числа гальваностатических, потенциодинамических, потенциостатических или других режимов электрохимической обработки.

В качестве предпочтительных гальваностатических, потенциодинамических, потенциостатических режимов применяют режимы, описания которых приведены выше по тексту в связи с первым аспектом данного изобретения.

Как уже говорилось, в этих методах отсутствуют ограничения на концентрацию мономеров или поддерживающего электролита, используемых в растворе для электрохимической полимеризации. Таким образом, эти методы могут применяться при более высоких концентрациях мономеров, чем указано в WO 00/11473.

Область изобретения распространяется на потенциометрические датчики с полимерным покрытием, изготовленные в соответствии с методами, являющимися предметом данного изобретения, а также на способы применение этих датчиков. В частности, потенциометрические датчики могут применяться для электрохимического обнаружения анализируемых веществ (аналогично методам, описанным в WO 00/11473, WO 96/02001 и др.), для потенциометрического определения активности энзимов (например, методы измерения активности энзимов, расположенных в непосредственной близости к поверхности датчика), а также для потенциометрического анализа целых клеток (например, с применением методик, описанных в совместно рассматриваемой заявке на изобретение GB 0207116.5).

Кроме того, данное изобретение описывает метод обработки электропроводящих датчиков с полимерным покрытием после нанесения на них полимерной пленки, позволяющий повысить как долговременную стабильность, так и аналитическую чувствительность датчиков. Этот метод обработки может применяться не только к датчикам, изготовленным в соответствии с методом, являющимся предметом данного изобретения, но и к потенциометрическим датчикам с полимерным покрытием, изготовленным в соответствии с ранее описанными методами электрохимической полимеризации (см. WO 96/02001, WO 00/11473 и др.).

Метод обработки включает в себя две стадии. На первой стадии после электрохимической полимеризации производится тщательная промывка датчиков с полимерным покрытием деминерализованной водой. На этой стадии из полимерной пленки удаляются не внедрившиеся в нее легирующие анионы и следы мономера(ов). Удаление мономера(ов) обязательно, поскольку во время хранения мономеры могут подвергаться окислению, что приводит к изменению собственных окислительно-восстановительных свойств полимерной пленки. Удаление не внедрившихся легирующих ионов также необходимо, поскольку подвижный ион с противоположным знаком заряда может отрицательно повлиять на металлические свойства полимера [22, 23] и снизить окислительно-восстановительную чувствительность. В частности, избыток додецилсульфата натрия изменяет естественные свойства протеиновых молекул [16] и уменьшает адсорбцию биомолекул. Это может отрицательно повлиять на последующую иммобилизацию биомолекул внутри или на поверхности полимерной пленки.

На второй стадии из полимерной пленки удаляется несвязанная вода. Этот процесс очень важен, поскольку взаимодействие несвязанной воды с полимером приводит к изменению собственных окислительно-восстановительных свойств полимерной пленки в течение некоторого промежутка времени. Именно это является причиной появления множества публикаций, касающихся нестабильности полимерных (например, из полипиррола) пленок с течением времени, поскольку наиболее широко применяемый метод хранения (т.е. в мокром виде) [13, 16, 32, 35, 41] приводит к нестабильности электрохимических характеристик и плохой воспроизводимости результатов потенциометрических (или других электрохимических) измерений.

Две рассмотренные стадии обработки позволяют хранить датчики в течение длительного времени без изменения их рабочих характеристик, что весьма важно при коммерческом производстве датчиков.

Другой причиной длительной стабильности датчиков на полимерной основе, изготавливаемых по методу, изложенному в настоящем изобретении, является то обстоятельство, что толщина полимерных пленок оказывается намного меньше, чем толщина обычных ("полупрозрачных") пленок. В таких тонких пленках процессы, протекающие после завершения полимеризации, заканчиваются очень быстро и в последующем не оказывают влияния на свойства полимера.

Другой аспект данного изобретения связан с методом тестирования чувствительности датчиков на полимерной основе, изготовленных в соответствии с вышеописанным методом. Такой тест способен выявить очень небольшие различия в работе датчиков и повысить качество адаптации свойств датчиков к определенным требованиям. Эти различия не могут быть выявлены при помощи обычных электрохимических методов, например измерения потенциала с помощью определения потенциала разомкнутой цепи датчиков в растворе электролита.

Необходимо иметь универсальный, воспроизводимый и быстрый метод тестирования чувствительности изготовленных датчиков, что позволило бы дать достоверную оценку взаимосвязи между условиями изготовления датчиков (процедурой полимеризации и последующей обработкой) и их аналитической чувствительностью. Данный тест также может применяться для контроля качества всех типов датчиков, а также при последующем процессе производства датчиков.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что реакция между иммобилизированным стрептивидином и меченой биотином пероксидазой из хрена (HRP) является простым, оперативным и надежным тестом, пригодным для проверки аналитической чувствительности датчиков. Все компоненты, необходимые для этого теста, имеются в продаже и сертифицированы.

Таким образом, предметом изобретения является метод тестирования аналитической чувствительности потенциометрического датчика, имеющего полимерное покрытие, причем этот метод заключается в последовательном выполнении описанных ниже операций:

(a) нанесения на датчик стрептовидина путем пассивной адсорбции;

(b) нанесения на покрытый стрептовидином датчик защитной пленки из сахарозы;

(c) приведения датчика, полученного в соответствии с п.(b), в контакт с раствором, содержащим известную концентрацию меченной биотином пероксидазы из хрена, на определенный период времени;

(d) наблюдения за разностью электрических потенциалов между датчиком и эталонным электродом, когда и датчик, и электрод погружены в основной раствор электролита;

(e) замены раствора основного электролита на усиливающий раствор электролита, состав которого идентичен составу основного раствора электролита, за исключением того, что в него дополнительно входит носитель для пероксидазы из хрена, а также наблюдения за разностью электрических потенциалов между датчиком и эталонным электродом, когда они погружены в усиливающий раствор электролита;

(f) расчета разности между результатами измерений разностей потенциалов, определенных на этапах (d) и (е), и сравнения полученного результата с эталонными данными, полученными при использовании заранее определенного стандартного датчика или других датчиков, проходящих тестирование в это же время.

Операции (а) и (b) могут быть объединены в один этап: каплю стрептавидина в растворе сахарозы можно нанести на датчик и высушить. В раствор могут быть введены любые дополнительные компоненты, например блокирующие вещества или стабилизаторы. Перед проведением тестирования, возможно, потребуется выполнить промывочные операции.

В предпочтительном варианте изобретения основной раствор электролита, используемый на этапе (d), может содержать Н-донор.

Рассмотренный метод позволяет проводить оперативный, стандартизованный потенциометрический анализ, который может применяться для того, чтобы быстро оценить аналитическую чувствительность определенного потенциометрического датчика и выявить, например, эффект воздействия изменений в составе раствора для электрохимической полимеризации на окончательную аналитическую чувствительность этого датчика. Аналитическая чувствительность преимущественно оценивается по отношению к стандартному или эталонному датчику, выбранному пользователем. Стандартный или эталонный датчик выбирается только для того, чтобы определить базисную линию (или линию начала отсчета), относительно которой можно проводить сравнение других датчиков. Точные характеристики эталонного датчика не являются предметом данного изобретения.

Необходимо, чтобы параметры анализа, т.е. концентрации реагентов, время инкубации и т.п., были стандартизованы, что обеспечивало бы возможность значимого сравнения результатов, полученных при тестировании различных датчиков. Однако точные значения этих параметров не являются предметом обсуждения и могут выбираться самим пользователем. Опытный читатель оценит то обстоятельство, что подходящие параметры анализа могут быть получены в ходе обычного эксперимента. Один вариант модельного анализа приведен в сопутствующих примерах.

Стандартизованный анализ представляет собой развитие метода, описанного в международной заявке на изобретение WO 00/11473, и операции (а) и (с)-(е) могут осуществляться в соответствии с описанием, приведенным в WO 00/11473, содержание которой введено в данный документ по ссылке.

Операция (b) завершается нанесением на датчик защитного покрытия из сахарозы. Эта операция имеет важное значение, поскольку слой сахарозы препятствует потере активности адсорбированного стрептавидина и, кроме того, помогает предотвратить доступ кислорода и влаги к слою полимера. Как будет показано ниже, покрытие из сахарозы удобно наносить путем погружения датчика в раствор сахарозы (обычно содержащий 1-25%, но лучше 10% сахарозы), либо, если операции (а) и (b) объединены, путем нанесения капли раствора сахарозы, содержащего стрептавидин, и последующего высушивания датчика (желательно, при температуре 30-40°С в течение примерно 8-12 часов).

Польза от нанесения на датчик покрытия из сахарозы не ограничивается только системой анализов, проводимых по стандартной модели. Пожалуй, любой потенциометрический датчик, в состав которого входит электропроводящий электрод, покрытый слоем проводящего полимера, в частности полипиррола, следует покрывать защитным слоем сахарозы. Кроме того, аналогичный эффект может быть получен и при использовании вместо сахарозы других защитных веществ.

Таким образом, другим предметом данного изобретения является возможность получения потенциометрического датчика, в состав которого входит электропроводящий электрод, покрытый слоем электропроводящего полимера, отличительной особенностью которого является то, что покрытие защитного вещества наносится поверх электропроводящего полимера.

Подходящими защитными веществами могут быть те вещества, которые действуют как стабилизаторы протеина. К таким веществам в числе прочих относятся, например, трегалоза, инозитол, целлобиоза и лактитол, а также сахароза. Возможно также использовать смеси этих веществ с полимерами, такими как декстран или полигликоли. Обычно защитное покрытие наносится путем погружения датчика в раствор защитных веществ или при помощи любого другого подходящего метода, например, путем нанесения капли защитного раствора или нанесения его методом трафаретной печати (например, 1-25% раствор трегалозы, инозитола, целлобиозы, лактитола или сахарозы) с последующей сушкой датчика. На этом этапе в защитный раствор можно добавлять и наносить на датчики любые другие вещества, такие как биорецепторы, например, стрептавидин, антитела, пептиды и т.п., а также блокирующие агенты, стабилизаторы и т.п.

Еще одним предметом настоящего изобретения является возможность получения потенциометрического датчика, в состав которого входит электропроводящий полимер, отличительной особенностью которого является то, что этот датчик может применяться при проведении любого анализа, предусматривающего проведение потенциометрического обнаружения (детектирования), например энзимные или клеточные анализы, в которых имеет место измеримое изменение потенциала полимерного слоя, обусловленное изменением окислительно-восстановительных свойств, рН или ионного состава вследствие активности энзимов или метаболической активности клеток. Например, клетки могут быть помещены на поверхность датчика путем их непосредственного выращивания на этой поверхности или посредством сродственных взаимодействий, а изменение потенциала может быть определено путем проведения потенциометрических измерений, описанных в настоящем изобретении.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена зависимость потенциометрического выходного сигнала (отклика), полученного от потенциометрического датчика из полипиррола, покрытого стрептавидином, от концентрации биотинилированной пероксидазы из хрена (Bt-HRP) для потенциометрических датчиков, покрытых пленками из полипиррола, выращенными из полимеризационных растворов, содержащих пиролл в различных концентрациях.

На фиг.2 представлена зависимость потенциометрического выходного сигнала (отклика), полученного от потенциометрического датчика из полипиррола, покрытого стрептавидином, от концентрации пероксидазы из хрена (HRP) для потенциометрических датчиков, покрытых пленками из полипиррола, выращенными из полимеризационных растворов, содержащих различные концентрации додецилсульфата натрия (SDS).

На фиг.3 показан результат воздействия изменения верхнего граничного потенциала на аналитический отклик и на форму кривой (зависимости сигнала от концентрации HRP) для потенциометрического датчика с покрытием из полипиррола.

На фиг.4 показан результат воздействия изменения количества электричества, прошедшего через рабочий электрод, на аналитический отклик и форму калибровочной кривой для потенциометрического датчика с покрытием из полипиррола.

На фиг.5 показан результат воздействия различных гальваностатических режимов выращивания полипиррола на отклик биотинилированной пероксидазы из хрена (Bt-HRP). Каждый режим выращивания представлял собой последовательность гальваностатически контролируемого ступенчатого изменения подачи тока, при котором длительность каждой ступени составляла от 10 до 1000 с.

На фиг.6 показан результат воздействия конструкции электрода на отклик биотинилированной пероксидазы из хрена (Bt-HRP). "Линейная" конструкция электрода предполагает, что ширина электрода существенно меньше его длины. В "кольцевой" конструкции используется электрод кольцеобразной или дискообразной формы.

Подробное описание изобретения

Предлагаемый данным изобретением метод применяется для изготовления высокочувствительных потенциометрических датчиков путем нанесения на электропроводящие электроды слоя электропроводящего полимера.

В качестве электропроводящего электрода, на который предполагается наносить электропроводящий полимер, может, в сущности, использоваться любой подходящий электрод, имеющий проводящий или полупроводящий слой. К числу подходящих электродов относятся стандартные потенциометрические электроды, обладающие металлической или квазиметаллической проводимостью и сохраняющие стабильность в водной среде. Желательно, чтобы электрод имел пластиковую основу с адгезионным слоем (углерод или медь) и проводящей подложкой (желательно из золота), нанесенную на пластиковую основу электрохимическим способом или путем непосредственного применения метода трафаретной печати. Эталонный электрод, например эталонный электрод Ag/AgCl, который необходим на этапе проведения потенциометрического обнаружения, может быть нанесен на ту же основу, что и чувствительный электрод (зонд) с помощью любого метода, например нанесения по методу трафаретной печати. Так же может быть использован и внешний, покупной эталонный электрод.

Возможно применение любых планировочных схем для конечного варианта датчика, например схем типа "измерительный стержень", многолуночный планшет, которые содержат интегрированные электрохимические датчики, предназначенные для использования в различных методах электрохимического анализа.

Водный раствор, предназначенный для электрополимеризации, обычно состоит из мономерных компонент электропроводящего полимера, концентрация которых находится в диапазоне от 0,002 М до 0,05 М, предпочтительнее - от 0,002 М до 0,02 М, еще лучше, если в диапазоне от 0,0025 М до 0,15 М, и совсем хорошо, если в диапазоне от 0,005 М до 0,01 М для дистиллированной воды (например, MilliQ), и поддерживающего электролита в концентрациях от 0,0001 М до 0,005 М, предпочтительнее - от 0,0001 М до 0,002 М, еще лучше, если в диапазоне от 0,0001 М до 0,0015 М, и совсем хорошо, если в диапазоне от 0,0001 М до 0,001 М. Вместо дистиллированной воды могут применяться другие полярные растворители.

В число подходящих мономеров входят пиррол, фуран, тиофен или другие вещества, причем наибольшее предпочтение следует отдать пирролу. Для того чтобы изготовить электропроводящие сополимеры, можно также использовать комбинацию двух или большего числа этих мономеров.

Наиболее подходящим поддерживающим электролитом является додецилсульфат натрия, однако можно применять и другие электролиты, анионы которых иммобилизуются в полимерных пленках. Электролит также выполняет функцию легирующего вещества.

Наиболее предпочтительный вариант состава раствора для электрохимической полимеризации включает водный раствор мономеров и поддерживающий электролит. Тем не менее следует понимать, что в полимеризационный раствор допускается добавлять другие компоненты, такие как, например, компоненты, обеспечивающие образование особых функциональных групп, которые могут использоваться в качестве связывающих агентов для биорецепторов или для химической модификации поверхности датчика (см. WO 00/11473).

Желательно, чтобы соотношение между концентрациями мономеров и поддерживающего электролита в полимеризационном растворе находилось в пределах от 2:1 до 30:1, причем наиболее предпочтительным следует считать диапазон от 5:1 до 30:1. Самым оптимальным представляется соотношение, равное приблизительно 25:1.

Наиболее предпочтительными, но не ограничивающими всей области изобретения, являются следующие составы: 0,005-0,01 М мономеров (наибольшее предпочтение отдается пирролу) с 0,0002 М электролита (наибольшее предпочтение отдается додецилсульфату натрия) или 0,0075-0,01 М мономеров (наибольшее предпочтение отдается пирролу) с 0,0017 М электролита (наибольшее предпочтение отдается додецилсульфату натрия).

Процесс электрохимической полимеризации осуществляется с применением двух- или трехэлектродной системы, включающей электрод(ы), подлежащие нанесению покрытия (также определяемый в настоящем документе, как "рабочий электрод"), вспомогательный электрод и эталонный электрод. В случае использования системы из двух электродов (гальваностатический режим) не используется эталонный электрод. Наиболее приемлемые сборки были рассмотрены в предыдущих публикациях (см. WO 00/11473 и содержащиеся в данном документе ссылки). Несколько рабочих электродов могут быть объединены в блок, имеющий один электрический контакт.

Желательно, чтобы вспомогательный электрод был выполнен из платины, другого благородного металла или другого инертного электропроводящего материала, такого как графит или углерод. Площадь поверхности вспомогательного электрода должна быть больше, чем суммарная площадь поверхности всех рабочих электродов [53]. Для снижения некомпенсированного сопротивления в полимеризационном растворе эталонный электрод следует размещать как можно ближе к рабочим электродам [20, 21, 53]. Желательно выдерживать постоянное расстояние между рабочими электродами и эталонным электродом. В качестве эталонного электрода может использоваться обычный электрод Ag/AgCl или каломельный электрод.

При проведении электрохимического синтеза может быть использован регулятор напряжения. В случае применения потенциодинамического режима циклическое напряжение в диапазоне -0,2-+2,0 В (по отношению к эталонному электроду Ag/AgCl) при частоте сканирования, которая предпочтительно должна составлять 50-100 мВ/с, желательно, в течение 1-15 циклов, подается между эталонным электродом и рабочим(и) электродом(ами), на который(ые) должно быть нанесено покрытие. Величина тока регистрируется на вспомогательном электроде.

Форма вольтамперной кривой и суммарное количество электричества, прошедшее через рабочий(е) электрод(ы), являются параметрами, подлежащими контролю при образовании полимеров. Количество электричества, проходящее через электрод(ы), в течение каждого цикла не должно отличаться от количества электричества, прошедшего за первый цикл, более чем на 5%.

В случае применения гальваностатического режима на рабочий(е) электрод(ы), подлежащий(ие) покрытию, и вспомогательный электрод подача постоянного тока осуществляется по одно- или многоступенчатой схеме, причем величина тока в течение 100-1000 с находится в пределах 0,01-1 мА/см². Количество ступеней подачи тока не ограничено. Авторами данного изобретения использовалась до настоящего момента подача тока по схемам от одно- до пятиступенчатой. Предпочтительная общая продолжительность полимеризации составляет 150-600 с.

Более предпочтительно использование гальваностатического режима. По сравнению с другими режимами он более дешев, лучше поддается контролю, а используемое оборудование не столь сложно. Применение различных вариантов подачи тока позволяет очень точно подстраивать окислительно-восстановительные свойства полимерных пленок. Использование гальваностатического режима позволяет также точно контролировать степень окисления образующейся полимерной пленки.

В ряде конкретных случаев допускается последовательное применение гальваностатического и потенциодинамического или потенциостатического (либо в обратном порядке следования) режимов в ходе одного процесса полимеризации. Например, основная полимерная пленка формируется при низком напряжении с использованием в гальваностатическом режиме постоянного тока малой величины, после чего выращивается дополнительное количество полимера в потенциодинамическом режиме, при котором применяется высокий верхний потенциал. После этого возможны последующая доводка электропроводящего полимера путем приложения низкого напряжения, например 0 В (по отношению к Ag/AgCl), или подачи ступеньки тока в 0 А в течение периода времени 1-300 с.

После завершения электрохимического синтеза желательно провести промывку покрытых полимером датчиков деминерализованной водой до тех пор, пока не будут обнаруживаться следы мономера и додецилсульфата натрия.

После промывки следует удалить из полимерной пленки несвязанную воду. Эту операцию можно осуществить несколькими способами. Проще всего прогреть датчики в термостате в течение, как минимум, 8 часов. Температуру в пределах от 25 до 50°С можно устанавливать в зависимости от толщины полимерной пленки, причем наиболее предпочтительна температура в интервале 30-40°С. Соблюдение этого температурного диапазона весьма важно, поскольку, с одной стороны, несвязанная вода не может быть полностью удалена при температурах ниже 25°С, а с другой стороны, высокие температуры (превышающие 50°С) могут привести к повреждению полимерной пленки. Другим возможным способом удаления воды является лиофильная сушка.

Описанные выше операции промывки и сушки также могут применяться при обработке покрытых полимером электродов, изготовленных в соответствии с ранее опубликованными методами электрохимической полимеризации (см. WO 96/02001, WO 00/11473 и ссылки, приведенные в данном документе). Как указывалось ранее, такая обработка обеспечивает определенные преимущества при длительном хранении электродов.

Электроды с полимерным покрытием, полученные в соответствии с изложенными выше методами, используются в основном для изготовления высокочувствительных потенциометрических биодатчиков, например хемо-, энзимо- или иммуносенсоров. Применяя широко известные технологии нанесения твердофазных покрытий, можно осуществлять внедрение в поверхность датчика любого(ых) биологического(их) рецептора(ов). Эти датчики можно использовать при проведении любых анализов окислительно-восстановительных свойств, изменений рН или окисления, включая анализ клеток.

Для того чтобы иметь возможность оценивать и контролировать окислительно-восстановительную чувствительность датчиков, авторы настоящего изобретения предлагают использовать модельный анализ, в основу которого положено применение датчиков, изготовленных на базе полимеров и покрытых стрептавидином, который вступает в реакцию с биотинилированной пероксидазой из хрена. Ранее говорилось о том, что использование общепринятых процедур электрохимической обработки не годится для тестирования свойств датчиков, поскольку не позволяет выявлять различия в их свойствах на необходимом уровне. Иммунологический анализ помогает оценить окислительно-восстановительные свойства и, соответственно, аналитическую чувствительность датчиков, изготовленных с применением различных режимов полимеризации.

Методика нанесения стрептавидина на слой полипиррола подробно изложена в международной заявке авторов изобретения WO 00/11473. Концентрация стрептавидина в растворе, применяемом для нанесения покрытия, может составлять от 2 до 100 мг/мл, что зависит от метода нанесения покрытия. Кроме того, в настоящем изобретении защитный слой сахарозы наносится на покрытые стрептавидином датчики, после чего они подвергаются просушиванию.

Операции по нанесению покрытия из стрептавидина и формированию защитного слоя могут быть объединены в одну операцию. В этом случае на поверхность датчика наносится капля (0,1-10 мкл) защитного раствора, содержащего стрептавидин, после чего датчик подвергается просушиванию. Допускается использование и других методов, например трафаретной печати.

В заявке WO 00/11473 приведено описание методик инкубирования в присутствии анализируемого вещества. Для приготовления раствора HRP можно использовать широкий спектр водных буферных растворов, имеющих различный показатель рН. Концентрация биотинилированной пероксидазой из хрена варьируется в диапазоне 0-100 нг/мл. Обычно используется следующий ряд концентраций: 0; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 50,0; 100,0 нг/мл. Время инкубации может составлять 2-60 мин.

Методика проведения потенциометрических измерений, а также расчета аналитического результата подробно изложена в WO 00/11473.

Хорошо известно, что HRP требует применения Н-донора для ускорения ферментативной реакции. Однако в WO 00/11473 упоминались только Н-доноры, которые обычно используются при повседневных иммунологических анализах с использованием оптического детектирования. Все указанные Н-доноры изменяют окраску в результате ферментативной реакции. При проведении потенциометрического измерения нет необходимости в таком изменении окраски. В этом случае главной является только величина изменения окислительно-восстановительного состояния чувствительного элемента, например, полимерной пленки, проявляющегося как результат взаимодействия с HRP. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в качестве Н-доноров для HRP могут применяться некоторые бесцветные вещества, которые обеспечат заметное изменение окислительно-восстановительного состояния, позволяющее провести его потенциометрическое измерение. Подходящими Н-донорами могут служить вещества, которые способны в результате взаимодействия с пероксидазой из хрена вызвать изменения в окислительно-восстановительном состоянии, характеризующиеся большой магнитудой. Наиболее предпочтительно использовать Н-донор, который обеспечит в результате взаимодействия с пероксидазой из хрена при определенных условиях модельного анализа получение выходного сигнала потенциометрического датчика, равного, как минимум, 10 мВ. Примерами подходящих бесцветных Н-доноров являются кониферол, гваякол, МВТН. Концентрация Н-доноров, используемых при потенциометрических измерениях, может в зависимости от конкретного Н-донора изменяться в пределах 0,1-100 мМ. Имеется возможность растянуть или сдвинуть диапазон измерений для конкретного анализируемого вещества просто путем замены Н-донора и/или изменения его концентрации в субстратной системе.

В заявке WO 00/11473 роль субстрата HRP выполняла перекись водорода. Поскольку перекись водорода является сильным окислителем, она может повлиять на результаты измерений вследствие взаимодействия с полимерным слоем или с находящимся под ним электродом. В настоящем изобретении перекись водорода может быть заменена субстратом, который является органической или неорганической перекисью. К числу подходящих субстратов относятся: метилгидропероксид, этилгидропероксид или р-нитропероксибензойная кислота и перборат натрия. Концентрация субстрата изменяется в зависимости от свойств субстрата в пределах 0,0005-0,1%. Для пербората натрия предпочтительная концентрация составляет 0,03%.

Очевидно, что практическая ценность этих Н-доноров и пероксидных субстратов не ограничивается системой модельных анализов, служащих для рассматриваемой здесь оценки окислительно-восстановительной чувствительности и контроля качества. В действительности данные Н-доноры и субстраты могут также использоваться при проведении потенциометрических анализов различных исследуемых веществ, например, с применением методов, аналогичных методам многослойного ("сэндвич") и сравнительного анализов, описанных в WO 00/11473.

Указанные потенциометрические методы анализа аналогичны системе модельных анализов за исключением того, что поверхность датчика модифицирована с помощью биомолекулы, обладающей специфическим связующим сродством к анализируемому веществу в отличие от стрептавидина (NB: обладающая специфическим связующим сродством к анализируемому веществу молекула может быть прикреплена к датчику посредством взаимодействия между биотином и стрептавитином, когда стрептавитин адсорбируется на датчике или закрепляется (иммобилизируется) в полимерном покрытии так, как это описано в WO 00/11473). Особенности потенциометрических анализов, основанных на применении энзимной метки (например, пероксидазы) можно пояснить ссылкой на WO 00/11473. Допускается использование других энзимных меток, кроме энзима HRP (например, других пероксидаз, глюкооксидазы или каталазы), поскольку любой энзимный процесс предполагает перенос электронов, что, в свою очередь, приводит к изменению потенциала датчика.

Стандартные многослойные потенциометрические методы электрохимического обнаружения, использующие энзимную метку (такие, как методы, описанные в WO 00/11473), включают в себя следующие операции:

(a) подготовку потенциометрического датчика с электропроводящим полимерным покрытием, в котором иммобилизированы или к которому адсорбированы рецепторы, обладающие способностью связываться с определенным анализируемым веществом, которое должно быть обнаружено в образце;

(b) приведение датчика в соприкосновение с эталонным раствором, содержащим образец, таким образом, что вышеупомянутое анализируемое вещество связывается с вышеупомянутыми иммобилизированными или адсорбированными рецепторами;

(c) приведение датчика в соприкосновение с раствором, содержащим вторичные рецепторы, обладающие способностью связываться с вышеупомянутым анализируемым веществом в месте, пространственно отделенном от места связывания с иммобилизированными или адсорбированными рецепторами, причем вышеупомянутые вторичные рецепторы оказываются связанными, как минимум, с одним энзимом;

(d) регистрацию разности электрических потенциалов между датчиком и эталонным электродом, когда они оба погружены в основной раствор электролита;

(e) перенос датчика и эталонного электрода в усиливающий раствор электролита, состав которого идентичен составу основного раствора электролита за исключением того, что он дополнительно содержит субстрат для энзима(ов), и регистрацию разности электрических потенциалов между датчиком и эталонным электродом, когда они оба погружены в усиливающий раствор электролита;

(f) расчет разности между результатами измерения разности потенциалов, полученных в ходе операций (d) и (е), и установление зависимости полученных результатов от концентрации анализируемого вещества в образце.

Между тем, стандартные "сравнительные" потенциометрические методы электрохимического обнаружения, использующие энзимную метку (такие, как методы, описанные в WO 00/11473), включают в себя следующие операции:

(a) подготовку потенциометрического датчика с электропроводящим полимерным покрытием, в котором иммобилизированы или к которому адсорбированы рецепторы, обладающие способностью связываться с определенным анализируемым веществом, которое должно быть обнаружено в образце;

(b) приведение датчика в соприкосновение с эталонным раствором, содержащим образец таким образом, что вышеупомянутое определенное анализируемое вещество связывается с вышеупомянутыми иммобилизированными или адсорбированными рецепторами;

(c) приведение датчика в соприкосновение с раствором, содержащим молекулы, обладающие способностью связываться с вышеупомянутыми иммобилизированными или адсорбированными рецепторами, причем вышеупомянутые молекулы оказываются связанными, как минимум, с одним энзимом;

(d) регистрацию разности электрических потенциалов между датчиком и эталонным электродом, когда они оба погружены в основной раствор электролита;

(e) перенос датчика и эталонного электрода в усиливающий раствор электролита, состав которого идентичен составу основного раствора электролита за исключением того, что он дополнительно содержит субстрат для энзима(ов), и регистрацию разности электрических потенциалов между датчиком и эталонным электродом, когда они оба погружены в усиливающий раствор электролита;

(f) расчет разности между результатами измерения разности потенциалов, полученных в ходе операций (d) и (е), и установление зависимости полученных результатов от концентрации анализируемого вещества в образце.

Предметом данного изобретения являются методы, обладающие всеми признаками стандартных анализов, перечисленных выше, которые характеризуются тем, что (i) используется энзимная метка из пероксидазы, возможно, в сочетании с другими энзимными метками, выбранными среди пероксидаз (например, пероксидазы из хрена), глюкооксидазы и каталазы, и (ii) основной и усиливающий растворы электролитов содержат Н-донор, демонстрирующий большую магнитуду изменения своего окислительно-восстановительного состояния, что является результатом взаимодействия с пероксидазой, и, следовательно, обеспечивающий большой выходной сигнал (отклик) потенциометрического датчика.

Преимущественно Н-донор должен, как следствие взаимодействия с пероксидазой, обеспечить величину отклика потенциометрического датчика для представляющих интерес концентраций анализируемого вещества, равную, как минимум, 10 мВ.

Перечень наиболее предпочтительных Н-доноров включает следующие вещества: кониферол, гваякол и МВТН, но не ограничивается ими.

Анализы могут проводиться с использованием глюкооксидазы или каталазы, выполняющих роль энзимной метки без пероксидазы, однако, в этом случае нет необходимости в добавлении к электролиту Н-донора.

Предметом данного изобретения также являются методы, обладающие всеми признаками стандартных анализов, перечисленных выше, которые характеризуются тем, что (i) в качестве энзима используется пероксидаза (например, пероксидаза из хрена), и (ii) субстратом энзима служат перборат натрия, перекись водорода или органическая перекись. В соответствии с данными методами основной и усиливающий растворы электролита содержат Н-донор, однако ограничения на точные характеристики Н-донора не накладываются.

Возможность применения альтернативных Н-доноров (с энзимной меткой из пероксидазы) и различных комбинаций энзимов (например, комбинаций пероксидаз, каталазы, глюкооксидазы и т.д.) обеспечивает всей системе еще большую гибкость, расширяя область возможного применения настоящего изобретения.

Изобретение поясняется ссылками на следующие, не носящие ограничительного характера примеры экспериментов:

Примеры

Все реагенты, если иное не оговорено специально, закупались у компании Сигма (Sigma). Пиррол, который закупался у компании Мерк (Merck), подвергался очистке путем дистилляции и хранился в аликвотных количествах при температуре -20°С.

Пример 1

Первый пример иллюстрирует взаимосвязь между концентрацией пиррола в растворе, используемом для электрохимической поляризации, и аналитической чувствительностью потенциометрических датчиков на основе полипиррола.

В качестве рабочих электродов использовались изготовленные по заказу плоские электроды, состоящие из полиэтилентерефталатной (ПЭТФ) подложки (толщиной ˜125 мкм) с нанесенным на нее способом электроосаждения слоем меди (толщиной ˜17 мкм), покрытым при помощи электрохимического плакирования слоем золота (толщиной ˜30 мкм). Рабочая поверхность составила приблизительно 1,0 мм². Водные растворы для электрохимической полимеризации включали 0,0002 М додецилсульфата натрия, выполнявшего функцию основного электролита, и следующие концентрации пиррола: 0,5 М; 0,3 М; 0,15 М; 0,05 М; 0,01 М; 0,005 М; 0,0025 М. Один из растворов помещался в ванну для электрохимической полимеризации, содержащую вспомогательный платиновый электрод и эталонный электрод (BAS). Восемь электродов, объединенные в один блок с одним общим электрическим контактом, помещались в ванну таким образом, чтобы их рабочие поверхности были погружены в раствор. Для обеспечения равномерного распределения плотности тока все электроды располагались параллельно вспомогательному электроду. Для сведения к минимуму омического падения напряжения эталонный электрод размещался на минимально возможном расстоянии от рабочих электродов. Процесс электрохимической полимеризации осуществлялся с помощью регулятора напряжения - гальваностата модели μAutolab II от фирмы EcoChemie путем четырехкратной подачи циклического напряжения в диапазоне -0,2-+1,7 В при частоте сканирования, равной 0,05 В/с.

После окончания процесса полимеризации датчики помещались в емкость с деминерализованной водой, которая периодически заменялась на свежую (каждые 15 минут в течение 3 часов). После промывки датчики просушивались в термостате при 37°С в течение 24 часов.

Окислительно-восстановительная чувствительность проверялась с помощью модельного анализа (датчики на базе полипиррола с покрытием из стрептавидина вступали в реакцию с биотинилированной пероксидазой из хрена).

Просушенные датчики помещали в раствор стрептавидина (40 мкг/мл стрептавидина в буферном растворе фосфата калия (0,05 М, рН 8,0) при +4°С на 24 часа. По завершении процесса адсорбции датчики помещали в 10% водный раствор сахарозы на 1-2 минуты и после этого высушивали. После этого датчики можно было помещать в фольгу и хранить в течение длительного времени. По оценкам время хранения составляет не менее 12 месяцев.

В данном примере защитная пленка из сахарозы удалялась перед переходом к следующему этапу анализа путем промывки в реакционном буферном растворе (0,1 М буферный раствор фосфата калия, рН 7,8). Однако на данном этапе удалять слой сахарозы необязательно. Покрытый сахарозой датчик может быть приведен в соприкосновение с раствором, содержащим анализируемое вещество (в данном случае - биотинилированную пероксидазу из хрена). Сахароза хорошо растворима в воде и очень быстро перейдет в раствор. Кроме того, присутствие сахарозы в реакционном сосуде не окажет влияния на сам анализ. В данном примере после смывания защитной пленки из сахарозы покрытые стрептавидином датчики выдерживались при различных концентрациях биотинилированной пероксидазой из хрена в реакционном буферном растворе, промывались и сохранялись в этом растворе до момента проведения потенциометрических измерений.

Метод проведения потенциометрических измерений, подробно рассмотренный в WO 00/11473, состоит из двух операций. Обычно первое потенциометрическое измерение проводится (по отношению к эталонному электроду Ag/AgCl) в первом растворе электролита (называемом также основным раствором), содержащем Н-донор. Второе потенциометрическое измерение проводится (по отношению к эталонному электроду Ag/AgCl) во втором растворе электролита (называемом также усиливающим раствором), химический состав которого идентичен основному раствору за исключением того, что в него добавлен субстрат энзима. Разница между двумя потенциалами, связанная с концентрацией анализируемого вещества в образце, измеряется в милливольтах. Присутствие Н-донора в основном растворе желательно, поскольку позволяет устранить вклад Н-донора в окончательный результат измерений.

Измерения проводились с помощью измерительного устройства, в состав которого входила измерительная ячейка (конструкция которой разработана в данных лабораториях). Датчик помещался в измерительную ячейку, туда же закачивался основной раствор, который впоследствии заменялся, в соответствии с установленными параметрами, на усиливающий раствор. При расчете результата применялось специально разработанное программное обеспечение.

В этом примере основной раствор представлял собой 100 мМ о-фенилендиамина (OPD) в буферном растворе, содержащем 0,05 М лимоннокислого натрия, рН 5,0. В качестве субстрата для пероксидазы из хрена в усиливающем растворе использовался перборат натрия (0,03%). Первое потенциометрическое измерение было проведено через 20 с; второе потенциометрическое измерение было проведено через 60 с.

Зависимость между потенциометрическим откликом и концентрацией пероксидазы из хрена (HRP) для датчиков с пленками из полипиррола, выращенными из растворов с различными концентрациями пиррола, представлена на фиг.1а.

Выходной сигнал датчика на базе полипиррола в значительной степени зависит от концентрации мономера в растворе, предназначенном для электрохимической полимеризации. Зависимость сигнала от концентрации пиррола в полимеризационном растворе для конкретной величины концентрации HRP приведена на фиг.1b (0,1 нг/мл HRP), фиг.1с (1,0 нг/мл HRP) и фиг.1d (10 нг/мл HRP).

Обычно сигнал возрастает при снижении концентрации пиррола в полимеризационном растворе. Максимальное нарастание сигнала наблюдается у датчиков, изготовленных при использовании растворов, содержащих 0,0025 М-0,015 М пиррола (0,005 М для 10 нг/мл, фиг.1d).

Как указывалось ранее, этот эффект наблюдается в некотором диапазоне концентраций пиррола, который не рассматривался другими исследователями в плане изготовления высокочувствительных датчиков на базе полимеров.

Приведенный пример показывает, что концентрация мономера в растворе, предназначенном для электрохимической полимеризации, является одним из важнейших факторов, который необходимо учитывать при изготовлении высокочувствительных потенциометрических датчиков.

Пример 2

Этот пример демонстрирует взаимосвязь между концентрацией поддерживающего электролита в растворе для электрохимической полимеризации и аналитической чувствительностью потенциометрических датчиков на основе полипиррола.

Изготовление потенциометрических датчиков осуществлялось также, как в Примере 1, с той разницей, что концентрация мономера в водных растворах для электрохимической полимеризации была неизменной (0,005 М). Додецилсульфат натрия (SDS) (поддерживающий электролит) применялся в следующих концентрациях: 0,0001 М; 0,00015 М; 0,0002 М; 0,0004 М; 0,001 М; 0,002 М. После полимеризации и определения аналитической чувствительности датчики подверглись такой же обработке, как и в Примере 1, причем биотинилированная пероксидаза из хрена применялась в концентрациях от 0 до 10 нг/мл.

Зависимость между потенциометрическим откликом и концентрацией биотинилированной пероксидазы из хрена для датчиков с пленками из полипиррола, выращенными из растворов с различными концентрациями додецилсульфата натрия, представлена на фиг.2а. Выходной сигнал датчика на базе полипиррола находится в сильной зависимости от концентрации поддерживающего электролита в растворе, предназначенном для электрохимической полимеризации.

Зависимость сигнала от концентрации додецилсульфата натрия в полимеризационном растворе для конкретной величины концентрации биотинилированной HRP приведена на фиг.2b (0,1 нг/мл биотинилированной HRP), фиг.2 с (1,0 нг/мл HRP) и фиг.2d (10 нг/мл биотинилированной HRP). На графиках зависимостей имеются максимумы при концентрациях додецилсульфата натрия 0,0002 М, наблюдается провал при концентрации 0,00015 М, за которым следует резкое возрастание выходного сигнала датчика при концентрации 0,0001 М для концентраций биотинилированной HRP≤1,0 нг/мл.

Зависимость между концентрацией додецилсульфата натрия в полимеризационном растворе и аналитической чувствительностью потенциометрических датчиков носит сложный характер. С одной стороны, додецилсульфат натрия служит в качестве легирующего иона, обеспечивающего определенные электрохимические свойства полимерных пленок, так что изменения в концентрации додецилсульфата натрия приводят к изменениям в аналитической чувствительности датчиков (см. фиг.2, а-d). С другой стороны, додецилсульфат натрия выполняет функцию поддерживающего электролита, обеспечивая тем самым установленную проводимость полимеризационного раствора и установленную плотность тока, определяющую толщину полимерных пленок. Полимерные пленки, выращенные из полимеризационных растворов с более высокой концентрацией додецилсульфата натрия, имеют большую толщину.

Полимерные пленки, выращенные из полимеризационных растворов с самыми низкими концентрациями додецилсульфата натрия (0,0001 М), отличаются неоднородностью. Потенциометрический отклик частично определяется полимером, что является следствием энзимной реакции, и частично незакрытым золотом, появляющимся на поверхности, как следствие присутствия субстрата. Вклад золота в выходной сигнал отчетливо просматривается при концентрации биотинилированной HRP, равной 0 нг/мл.

Оба примера подтверждают тот факт, что концентрации мономера и поддерживающего электролита, а также их соотношение являются одним из важнейших факторов, определяющих аналитическую чувствительность потенциометрических датчиков на основе полимеров. Эти примеры демонстрируют также возможность целенаправленного изменения аналитической чувствительности и диапазона измерений путем внесения корректив в параметры электрохимического синтеза.

Пример 3

Этот пример демонстрирует зависимость аналитической чувствительности потенциометрических датчиков на основе полимеров от параметров процесса полимеризации.

Сорок электродов были собраны в один блок с общим электрическим контактом. Электроды располагались по периметру круглой ванны. В центре ванны находился эталонный электрод Ag/AgCl. Вспомогательный электрод был изготовлен из тонкой платиновой сетки и крепился ко дну ванны на равном расстоянии от каждого из 40 рабочих электродов. Такое круговое расположение было выбрано с тем, чтобы обеспечить одинаковую плотность тока для всех рабочих электродов. Применялся полимеризационный раствор с концентрациями пиррола 0,005 М и додецилсульфата натрия 0,0002 М, который был признан оптимальным по результатам предыдущих экспериментов (см. примеры 1 и 2).

Процесс электрохимической полимеризации осуществлялся с помощью регулятора напряжения - гальваностата модели μAutolab II от фирмы EcoChemie путем четырехкратной подачи циклического напряжения при частоте сканирования, равной 0,05 В/с. Нижний граничный потенциал составлял -0,2 В (как и в Примере 1). Верхний граничный потенциал изменялся в пределах 1,4-2,0 В. Обработка датчиков после полимеризации проводилась так же, как в предыдущих примерах, а аналитическая чувствительность проверялась в соответствии с описанием, приведенным в Примере 1, причем использовалась биотинилированная HRP в концентрациях от 0 до 10 нг/мл.

В соответствии с полученными результатами на аналитический отклик датчика и на форму кривой (зависимость выходного сигнала от концентрации HRP) оказывает влияние верхний граничный потенциал (фиг.3).

Верхний граничный потенциал является еще одним важнейшим фактором, определяющим потенциометрическую чувствительность потенциометрического датчика. Он отвечает за окислительно-восстановительное состояние полимерной пленки и за ее толщину, которая зависит от количества электричества, прошедшего через поверхность единичной площади.

Данный пример подтверждает одно из главных положений настоящего изобретения, заключающееся в том, что концентрации мономера(ов) и поддерживающего(их) электролита(ов), соотношение между ними, диапазон прилагаемого циклического напряжения оказывают взаимно усиливающее воздействие на аналитическую чувствительность датчиков на основе полипиррола.

Необходимо отметить то обстоятельство, что изготовленные в соответствии с вышеизложенным методом датчики обладают более высокой чувствительностью по сравнению с известными потенциометрическими датчиками и могут применяться для потенциометрического анализа широкого круга исследуемых веществ.

Пример 4

Это пример демонстрирует влияние количества электричества, прошедшего через рабочие электроды за время гальваностатического режима электрохимического синтеза, на аналитическую чувствительность.

Сорок электродов были собраны в один блок с общим электрическим контактом. Электроды располагались по периметру круглой ванны. В центре ванны находился эталонный электрод Ag/AgCl. Вспомогательный электрод был изготовлен из платиновой проволоки и крепился ко дну ванны на равном расстоянии от каждого из 40 рабочих электродов. Применялся полимеризационный раствор с концентрациями пиррола 0,005 М и додецилсульфата натрия 0,0002 М, который был признан оптимальным по результатам предыдущих экспериментов (см. примеры 1 и 2).

Процесс электрохимической полимеризации осуществлялся с помощью регулятора напряжения - гальваностата модели μAutolab II от фирмы EcoChemie путем подачи между электродами, на которые наносится покрытие, и вспомогательным электродом трех последовательных по времени и различных по величине уровней плотности тока. Для первого, второго и третьего уровней величина плотности тока составляла 0,1 мА/см²; 0,15 мА/см² и 0 мА/см², соответственно. Продолжительность подачи первого уровня плотности тока изменялась в пределах 300-900 с. Продолжительность подачи второго и последнего уровня плотности тока была постоянной и составляла 23 и 5 с, соответственно. Таким образом, суммарное количество электричества составило 33,5-93,5 мКл/см².

Изготовленные таким образом датчики подвергались после полимеризации обработке, аналогичной той, что описана в предыдущих примерах, а их аналитическая чувствительность определялась в соответствии с описанием, приведенным в Примере 1, причем использовалась биотинилированная HRP в концентрациях от 0 до 10 нг/мл.

На выходной сигнал и на форму кривой (зависимость выходного сигнала от концентрации HRP) оказывает влияние количество электричества, прошедшее через электроды за время полимеризации (фиг.4).

Данный пример подтверждает одно из главных положений настоящего изобретения, заключающееся в том, что концентрации мономера(ов) и поддерживающего(их) электролита(ов), соотношение между ними, количество электричества, прошедшее через электроды за время полимеризации, оказывают взаимно усиливающее воздействие на аналитическую чувствительность датчиков на основе полипиррола.

Пример 5

Это пример демонстрирует влияние применения более чем одного режима полимеризации на аналитическую чувствительность.

Были использованы два протокола полимеризации: обычная гальваностатическая процедура и комбинированная гальваностатическая-потенциодинамическая процедура. Суммарное количество электричества и, следовательно, толщина полимерных пленок были одинаковы в обоих случаях. Гальваностатическая и потенциодинамическая процедуры проводились последовательно одна за другой, причем использовались концентрации полимеризационного раствора и компоновка ванны для полимеризации, описанные в примере 4. Электрохимическая полимеризация осуществлялась с помощью регулятора напряжения - гальваностата модели μAutolab II от фирмы EcoChemie, причем гальваностатическая плотность тока поддерживалась на уровне 0,1 мА/см² в течение 150 с (15 мКл/см²), после чего была проведена однократная подача циклического напряжения при частоте сканирования, равной 0,05 В/с, и шагом потенциала, равным 2,44 В. Нижний граничный потенциал составлял -0,2 В (Процедура 1). Гальваностатическая процедура велась при плотности тока, составлявшей 0,1 мА/см² в течение 300 с (Процедура 2), что обеспечивало прохождение приблизительно того же количества электричества, что и при выполнении Процедуры 1 (15 мКл/см²). Другие параметры были аналогичны Процедуре 1.

Изготовленные таким образом датчики подвергались после полимеризации обработке, аналогичной той, что описана в предыдущих примерах, а их аналитическая чувствительность определялась в соответствии с описанием, приведенным в Примере 1, причем использовалась биотинилированная HRP в двух концентрациях (0 и 0,1 нг/мл). Полученные результаты приведены в последующей таблице.

 Сигнал, мВПрименявшаяся процедура0 нг/мл [биотинилированная HRP]0,1 нг/мл [биотинилированная HRP]Процедура 11451Процедура 21123

Данный пример демонстрирует влияние применения более чем одного режима полимеризации на аналитическую чувствительность. Возможна "имитация" потенциодинамического этапа путем использования в ходе гальваностатической процедуры более чем одного уровня тока (см. предыдущий и последующий примеры).

Применение двух режимов и более позволяет более жестко контролировать окислительно-восстановительные свойства полимерной пленки и, следовательно, целенаправленно изменять аналитическую чувствительность датчиков.

Пример 6

Это пример демонстрирует тот факт, что путем изменения параметров гальваностатического режима электрохимическое осаждение полимера может вестись в соответствии с требованиями конкретного анализа. На фиг.5 приведены данные, полученные для датчиков, изготовленных в соответствии с "Режимом 1", которые отличаются высокой "чувствительностью" (отклик при концентрациях от 0 до 0,1 нг/мл), но "низким" динамическим диапазоном (отклик при концентрациях от 0 до 10 нг/мл). Датчики, изготовленные в соответствии с "Режимом 3", обладают более широким динамическим диапазоном, но демонстрируют низкую чувствительность. Электрохимическая полимеризация осуществлялась с помощью управляемой компьютером электрохимической измерительной системы μAutolab II фирмы EcoChemie. Сорок электродов круглой конструкции (диаметр = 1,5 мм) размещались в узкой и длинной ванне параллельно вспомогательному платиновому электроду. Ванна была заполнена водным раствором, содержащим пиррол (7,5 мМ) и додецилсульфат натрия (0,17 мМ). Полимер наносился на электроды в гальваностатическом режиме, при котором серии ступенчатой подачи тока обеспечивали прохождение суммарного электрического заряда в количестве от 13 до 24 мКл/см². После завершения процесса электрохимического осаждения полимера датчики подвергались обработке, аналогичной той, что описана в предыдущих примерах, а для определения их аналитической чувствительности использовалась биотинилированная HRP в концентрациях от 0 до 10 нг/мл.

Пример 7

Это пример демонстрирует тот факт, что электроды различной формы позволяют получать датчики, которые несколько по-разному реагируют на одни и те же уровни биотинилированной HRP. На фиг.6 приводится сравнение данных, полученных для электродов круглой формы (диаметр = 1,5 мм²) и линейной формы (длина=1 мм, ширина=0,25 мм). Датчик круглой формы обладает более узким динамическим диапазоном и более низкой чувствительностью по сравнению с датчиком линейной формы.

Оба датчика были изготовлены с использованием гальваностатического режима в условиях, описанных в предыдущих примерах. Суммарное количество электричества, прошедшее за время осаждения полимера, составило 24 мКл/см² для круглого электрода и 210 мКл/см² для электрода линейной формы (прямая связь с переводчиком - один один три - два три - два пять).

Изобретение относится к методам изготовления высокочувствительных иономерных сенсоров с электропроводящей полимерной пленкой в качестве чувствительного элемента. Сущность изобретения: способ получения высокочувствительных потенциометрических датчиков включает следующие операции: (a) приготовление водного раствора для электрохимической полимеризации, содержащего мономерные звенья электропроводящего полимера в концентрации от 0,002 до 0,05 М и поддерживающий электролит, выполняющий также функции легирующей примеси, концентрация которого составляет от 0,0001 до 0,005 М; (b) сборка ванны для электрохимической полимеризации, содержащей раствор для электрохимической полимеризации, вспомогательный электрод, один или более рабочие электроды, на которые наносится покрытие из электропроводящего полимера; (c) нанесение на рабочий(е) электрод(ы) полимерной пленки путем электрохимического синтеза полимера из раствора для электрохимической полимеризации с применением по крайней мере одного из предложенных электрохимических режимов. Техническим результатом изобретения является создание высокочувствительных, воспроизводимых и стабильных в течение длительного времени потенциометрических датчиков на основе полимера. 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

1. Способ получения высокочувствительных потенциометрических датчиков путем нанесения на один или более рабочие электроды покрытия из электропроводящего полимера, включающий следующие операции:

(a) приготовление водного раствора для электрохимической полимеризации, содержащего мономерные звенья электропроводящего полимера в концентрации от 0,002 до 0,05 М и поддерживающий электролит, выполняющий также функции легирующей примеси, концентрация которого составляет от 0,0001 до 0,005 М;

(b) сборка ванны для электрохимической полимеризации, содержащей раствор для электрохимической полимеризации, вспомогательный электрод, один или более рабочие электроды, на которые наносится покрытие из электропроводящего полимера, и

(c) нанесение на рабочий(е) электрод(ы) полимерной пленки путем электрохимического синтеза полимера из раствора для электрохимической полимеризации с применением по крайней мере одного из следующих электрохимических режимов:

(i) приложение между рабочим(и) электродом(ами), на которые наносится покрытие, и вспомогательным электродом циклического напряжения в диапазоне (-0,2)÷(+2,0) В относительно дополнительно размещенного в ванне эталонного электрода Ag/AgCl;

(ii) одноступенчатая или многоступенчатая подача постоянного тока с заданной в диапазоне 0,01-1 мА/см² плотностью тока на рабочий(е) электрод(ы), подлежащие покрытию полимерной пленкой, и вспомогательный электрод в течение определенного периода времени таким образом, чтобы суммарное количество электричества, прошедшее через рабочий(е) электрод(ы), находилось в пределах от 10 до 250 мКл/см²;

(iii) одноступенчатое или многоступенчатое приложение постоянного потенциала в диапазоне 0-3 В между рабочим(и) электродом(ами), на которые наносится покрытие, и дополнительно размещенным в ванне эталонным электродом в течение определенного периода времени таким образом, чтобы суммарное количество электричества, прошедшее через рабочий(е) электрод(ы), находилось в пределах от 10 до 250 мКл/см²;

(iv) любого другого режима электрохимической обработки, при котором соблюдались бы все ранее установленные концентрации раствора и электрохимические параметры.

(d) промывка электрода(ов), покрытого(ых) электропроводящим полимером в результате выполнения операции (с), в деионизированной воде; и

(e) удаление несвязанной воды из слоя электропроводящего полимера.

Приоритет по пунктам и признакам: