МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К АУТОЛОГИЧНЫМ Т-КЛЕТОЧНЫМ ВАКЦИНАМ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/00 A61K39/38 C12N5/08 A61P25/28 

Предшествующий уровень техники

Все больше становится доказательств того, что аутоиммунные Т-клеточные ответы на миелиновые антигены, в том числе основной белок миелина (ОБМ), вовлечены в патогенез рассеянного склероза (PC) (Stinissen et al., Crit. Rev. Immunol. 1997; 17: 33-75). Обнаружено, что ОБМ-реактивные Т-клетки претерпевают активацию in vivo и появляются при высокой частоте предшественников в крови и цереброспинальной жидкости пациентов с PC (Zhang et al., J.Exp. Med., 1994, 179: 973-984; Chou et al., J. Neuroimmunol., 1992; 38: 105-114; Allegretta et al., Science, 1990; 247: 718-721). Эти ОБМ-реактивные Т-клетки продуцируют провоспалительные Тh1-цитокины (интерлейкин 2 (ИЛ-2), фактор некроза опухоли α (ФНО-α) и γ-интерферон), и считается, что они способствуют воспалению, разрушающему миелин, в центральной нервной системе (Sharief et at., N. Engl. J. Med., 1991; 325: 467-472; Selmaj et al., J. Clin. Invest., 1991; 87: 949-954). Было показано, что ОБМ-реактивные Т-клетки могут индуцировать экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), являющийся животной моделью PC (Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol., 1981; 11: 195-204). ЭАЭ можно также предотвращать или лечить многократной вакцинацией ОБМ-реактивными Т-клетками, которые были инактивированы химической обработкой или облучением, причем такую лечебную процедуру назвали Т-клеточной вакцинацией (Ben-Nun et al., Nature, 1981; 292: 60-61). Было продемонстрировано, что Т-клеточная вакцинация индуцирует регуляторные иммунные ответы, вовлекающие антиидиотипические Т-клетки и антиэрготипические (anti-ergotypic) Т-клетки, которые вносят вклад в лечебные эффекты в отношении ЭАЭ и других экспериментальных моделей аутоиммунных болезней (Lider et al., Science, 1988; 239: 820-822; Lohse et al., Science, 1989; 244: 820-822).

Недавно Т-клеточная вакцинация успешно прошла клинические испытания на пациентах с PC на основании гипотезы, что истощение ОБМ-реактивных Т-клеток может улучшать клиническое течение этой болезни. В экспериментальном клиническом испытании авторы изобретения продемонстрировали, что вакцинация облученными аутологичными ОБМ-реактивными Т-клеточными клонами вызывала ответы CD8+ цитолитических Т-клеток, которые специфично распознавали и лизировали ОБМ-реактивные Т-клетки, использованные для вакцинации (Zhang et al., Science, 1993; 261: 1451-1454, Medear et al., Lancet 1995: 346: 807-808). Три подкожные вакцинации облученными ОБМ-реактивными Т-клеточными клонами приводили к истощению циркулирующих ОБМ-реактивных Т-клеток у пациентов с PC. Оказалось, что истощение ОБМ-реактивных Т-клеток посредством Т-клеточной вакцинации коррелирует с клиническим улучшением, как свидетельствуют снижение частоты рецидивов, оценки по расширенной шкале нетрудоспособности (ОРШН) и активности поражения по данным магнитно-резонансной томографии (МРТ) у пациентов с рецидивирующим течением болезни (Medaer et at., 1995). Хотя из экспериментального испытания нельзя сделать вывод вследствие ограниченного числа исследованных пациентов с PC, превосходный профиль безопасности и потенциальная клиническая польза способствовали дальнейшим клиническим исследованиям. Это предварительное клиническое испытание было предпринято с целью исследования, может ли истощение циркулирующих ОБМ-реактивных Т-клеток быть клинически полезным для пациентов с PC.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение направлено на способы получения аутологичных Т-клеточных вакцин, на Т-клеточные вакцины, получаемые этими способами, и на способы лечения болезней, ассоциированных с Т-клетками, с использованием этих вакцин. Один аспект настоящего изобретения направлен на получение аутологичных Т-клеточных вакцин и на применение этих вакцин для лечения рассеянного склероза. Другой аспект этого изобретения относится к лечению ревматоидного артрита Т-клеточными вакцинами.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена аутологичная Т-клеточная вакцина.

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения включает в себя аутологичную Т-клеточную вакцину, полученную способом, названным способом прямой экспансии (СПЭ, direct expansion method), который обеспечивает более быстрый, более простой и более экономичный способ получения Т-клеточной вакцины. Способ прямой экспансии является предпочтительным способом получения вакцин, когда Т-клетки, которые были идентифицированы как реактивные к миелиновому белку или его фрагментам, имеют индекс стимуляции (ИС), равный 5 или более. При способе прямой экспансии получают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от подлежащего лечению пациента с PC или мононуклеарные клетки из цереброспинальной жидкости пациента (МКЦСЖ). Затем инкубируют МКПК или МКЦСЖ, полученные от пациента, в присутствии антигена, ассоциированного с рассеянным склерозом, такого как основной белок миелина (ОБМ) или один или более чем один иммуногенный фрагмент ОБМ. Другие полезные в практике настоящего изобретения антигены, ассоциированные с рассеянным склерозом, включают в себя миелин-протеолипидный липопротеин (myelin proteolipid lypoprotein), миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (myelin oligodendrocyte glycoprotein) и глатирамер или их фрагменты. В более предпочтительном воплощении иммуногенный(е) фрагмент или фрагменты ОБМ являются иммунодоминантными фрагментами. Наиболее предпочтительные фрагменты ОБМ включают в себя фрагмент, соответствующий аминокислотам 83-99 ОБМ, и фрагмент, соответствующий аминокислотам 151-170 ОБМ. В других воплощениях настоящего изобретения клетки можно инкубировать без учета антигенов, связанных с рассеянным склерозом, и/или их фрагментов. После инкубации с ОБМ или его фрагментами затем снова инкубируют МКПК или МКЦСЖ с ОБМ и/или его фрагментом в присутствии антиген-представляющих клеток (АПК). Предпочтительные антиген-представляющие клетки для использования в практике настоящего изобретения включают в себя облученные МКПК, полученные от пациента. Затем подвергают обработанные таким образом клетки чередующимся циклам стимуляции митогеном, предпочтительно фитогемагглютинином и интерлейкином-2. Другие митогенные молекулы, полезные в способе по настоящему изобретению, включают в себя конканавалин А и митоген лаконоса, но не ограничиваются ими. Другие митогенные молекулы, полезные в практике настоящего изобретения, включают в себя антитела к поверхностным рецепторам Т-клеток, такие как моноклинальное антитело к CD3. Чередующиеся циклы стимуляции можно повторять один или более чем один раз.

Это изобретение также направлено на способы лечения PC путем использования аутологичных Т-клеточных вакцин. При этом способе нуждающемуся в нем пациенту вводят эффективную дозу аутологичной Т-клеточной вакцины. Предпочтительные дозировки содержат от примерно 40×10⁶ до примерно 80×10⁶ клеток. Вакцину можно вводить любым из множества путей введения, в том числе внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно и подкожно, но не ограничиваясь ими. Подкожная инъекция является предпочтительным путем введения вакцины. Эффективной дозой в контексте настоящего изобретения является дозировка, необходимая для снижения числа или частоты предшественников миелин-реактивных Т-клеток в кровообращении пациента. Другие показатели эффективности включают в себя изменения клинического течения болезни при измерении по широко известным критериям, в том числе по снижению ОРШН, или предотвращению увеличения ОРШН, или замедлению развития ОРШН. Другие показатели эффективности включают в себя снижение частоты клинических обострений, либо стабилизацию или уменьшение размеров поражений головного мозга по данным МРТ, либо другие диагностические методики.

Аналогичным образом, согласно настоящему изобретению также предложены способы лечения ревматоидного артрита путем использования Т-клеточных вакцин, полученных, как описано здесь.

Согласно еще одному воплощению настоящего изобретения предложены аутологичная Т-клеточная вакцина и способ получения этой вакцины "методом клонирования". Этот метод клонирования предпочтителен, когда Т-клетки, которые были идентифицированы как реактивные к основному белку миелина или его фрагментам, имеют индекс стимуляции ниже 5.

При этом методе клонирования идентифицируют линии Т-клеток, реактивные к ОБМ или миелин-протеолипидному липопротеину, миелин-олигодендроцитарному гликопротеину, глатирамеру и/или фрагментам любого из упомянутых здесь. Линии Т-клеток, имеющие ИС менее 5, клонируют методом лимитирующего разведения. При этом способе получают Т-клетки, реактивные к ОБМ и/или его фрагментам, инкубацией МКПК или МКЦСЖ с ОБМ или его фрагментами (предпочтительно фрагментами, соответствующими аминокислотам 83-99 и 151-170) в течение семи дней без смены среды. Приблизительно 50% всех лунок делят поровну на две лунки (антигенная лунка и контрольная лунка). Инкубируют клетки в обеих совокупностях лунок с АПК (облученные свежие или размороженные МКПК) в среде, содержащей 5% (об./об.) человеческой сыворотки АВ⁺, причем в антигенные лунки добавляют ОБМ или его фрагменты, описанные выше. Индекс стимуляции (ИС) определяют с использованием анализа пролиферации по включению [³Н]-тимидина. Затем клонируют лунки, содержащие антиген и имеющие ИС менее 5, с использованием лимитирующего разведения, при котором клетки, каждая из которых реактивна к линии Т-клеток, объединяют в пул, разводят и высевают в лунки при плотности от примерно 0,3 до примерно 20 клеток на лунку в среде, содержащей 10%-ную человеческую сыворотку АВ⁺ и интерлейкин, предпочтительно интерлейкин-2, наряду с пектином, предпочтительно фитогемагглютинином (ФГА), и с АПК. Затем культуральную среду заменяют каждые три-четыре дня на среду, содержащую интерлейкин-2. Через примерно 14 дней снова тестируют ИС клеток, как описано выше. Затем клетки размножают чередующимися циклами стимуляции белком ОБМ (или его фрагментами) и фитогемагглютинином.

Настоящее изобретение также направлено на аутологичную Т-клеточную вакцину, полезную в лечении других расстройств, ассоциированных с Т-клетками, таких как ревматоидный артрит. Получение и применение таких Т-клеточных вакцин аналогично получению и применению аутологичных Т-клеточных вакцин для лечения PC, описанных выше. Однако первоначальным источником Т-клеток является синовиальная жидкость пациентов с ревматоидным артритом. Однако, в отличие от получения вакцины против PC, Т-клетки, имеющие происхождение от синовиальной жидкости, подвергают стимуляции фитогемагглютинином, моноклональным антителом к CD3 или другими митогенами, и не подвергают стимуляции антигенами, ассоциированными с PC.

Краткое описание чертежа

Чертеж иллюстрирует изменения рассчитанной частоты предшественников циркулирующих ОБМ-реактивных Т-клеток до и после вакцинации. Частоту предшественников рассчитывали для всех пациентов до вакцинации и через 2-3 месяца после завершения протоколов вакцинации.

Подробное описание изобретения

Хотя ОБМ-реактивные Т-клетки in vivo претерпевают активацию и клональную экспансию и у данного индивидуума проявляют ограниченное использование V-генов Т-клеточных рецепторов, Т-клеточные рецепторы ОБМ-реактивных Т-клеток у разных пациентов с PC очень разнообразны и варьируют (Vandevyver et at., Eur. J. Immunol., 1995; 25: 958-968, Wucherpfennig et al., J. Immunol., 1994; 152: 5581-5592, Hong et al., J. Immunol., 1999; 163: 3530-3538). Поэтому существующая в настоящее время стратегия эффективного истощения ОБМ-реактивных Т-клеток у пациентов с PC требует индивидуализированного лечения. Согласно настоящему изобретению предложено такое индивидуализированное лечение, и при этом лечении учитывается разнообразие Т-клеток у отдельного пациента, чтобы предложить более эффективную вакцину более длительного действия.

В соответствии с предыдущими исследованиями (Zhang et al., J. Immunol., 1993; 164: 4011-4017, Medaer et al., 1995), приведенные здесь данные подтверждают, что вакцинация реактивными к собственному ОБМ Т-клетками обеспечивает совместимое и мощное средство иммунизации пациентов для истощения циркулирующих ОБМ-реактивных Т-клеток. Хотя механизм, лежащий в основе иммунной регуляции, индуцируемой Т-клеточной вакцинацией, понятен не полностью, становится все более ясным, что Т-клеточная вакцинация может воздействовать на многие регуляторные сети, индуцируя ответы CD8+антиидиотипических Т-клеток (Zhang et al., 1993, Zhang et al., 1995) и Тh2-иммунное отклонение (Zhang et al., 2000). В частности, было показано, что эти антиидиотипические Т-клетки, индуцируемые Т-клеточной вакцинацией, лизируют иммунизирующие Т-клетки при распознавании вариабельных участков Т-клеток, при распознавании вариабельных участков Т-клеточных рецепторов, что представляет собой доминантную иммунную регуляцию, ответственную за истощение ОБМ-реактивных Т-клеток (Zhang et al., 2000). Можно думать, что эти регуляторные ответы, индуцируемые Т-клеточной вакцинацией, потенциально вносят вклад в полезный эффект Т-клеточной вакцинации при PC.

Хотя существует косвенное доказательство потенциальной ассоциации миелин-реактивных Т-клеток с болезненными процессами при PC (Zhang et al.,1994, Chou et al., 1992, Allegretta et al., 1990), установить или отклонить роль миелин-реактивных Т-клеток в патогенезе PC было трудно. В этом отношении Т-клеточная вакцинация предоставляет уникальную возможность определить, оказывает ли истощение миелин-реактивных Т-клеток полезное действие на клиническое течение PC.

Раскрытые здесь примеры описывают использование аутологичной Т-клеточной вакцины, которую получают методом клональной селекции, для лечения PC и аутологичную Т-клеточную вакцину, которую получают способом прямой экспансии. Представленные здесь данные показывают благоприятную корреляцию Т-клеточной вакцинации с улучшенными клиническими переменными. Прежде всего, эти результаты указывают, что истощение ОБМ-реактивных Т-клеток совпадало с увеличенным временем к прогрессированию в когортах как с рецидивирующим, так и вторичным прогрессирующим PC при сравнении с естественной историей PC и аутологичной Т-клеточной вакциной, полученной желаемым способом экспансии. Однако следует отметить, что у некоторых пациентов через 12 месяцев после последней инъекции наблюдали тенденцию к ускоренному прогрессированию. Значение этого видимого ускоренного прогрессирования неизвестно, но оно может быть ассоциировано с постепенным снижением иммунитета, исходно индуцируемого Т-клеточной вакцинацией против ОБМ-реактивных Т-клеток. Действительно, к этому времени приблизительно у 10-12% иммунизированных пациентов вновь появились ОБМ-реактивные Т-клетки, что подтверждает эту возможность. В некоторых случаях эти вновь появляющиеся ОБМ-реактивные Т-клетки происходили из разных клональных популяций, которые не были выявлены перед вакцинацией, что также наблюдали в предыдущих исследованиях (Zhang et al., 1995). На основании этих данных предполагается, что ОБМ-реактивные Т-клетки могут претерпевать клональное изменение (clonal shift) или расширение эпитопов (epitope spreading) (Touhy et al., J.Exp. Med., 1999; 189: 1033), потенциально ассоциированные с текущими болезненными процессами. Из этого наблюдения следует, что для поддержания адекватного иммунитета могут быть необходимыми дополнительные бустер-инъекции тех же или вновь появляющихся Т-клеточных клонов. Из этого также следует, что может быть полезным предоставить Т-клеточную вакцину, которая является поликлональной по происхождению, такую как вакцина, полученная описанным здесь способом прямой экспансии, чтобы избежать проблем с клональным изменением или расширением эпитопов, поскольку патентуемый диапазон эпитопов, который может распознавать такая вакцина, более широкий, чем диапазон, который распознает клонированная популяция.

Ежегодные проводимые с помощью МРТ обследования пациентов, которых лечили Т-клеточной вакциной по настоящему изобретению, выявили незначительное снижение активностей поражений по данным МРТ в первый год и увеличение только на 3,3% во второй год. Из данных МРТ может следовать значительная стабилизация у пациентов, которых лечат Т-клеточной вакцинацией. Этот результат по данным МРТ согласуется с исходной задержкой времени к прогрессированию, которое затем на второй год, как видно, увеличилось, подкрепляя возможность того, что на второй год исходный эффект Т-клеточной вакцинации уменьшился.

Способы по настоящему изобретению также привели к благоприятным изменениям других клинических переменных, в том числе ежегодного числа рецидивов и ОРШН, у вакцинированных пациентов, из чего следует благоприятный эффект Т-клеточной вакцинации на клиническое течение PC. Результаты этого исследования в значительной степени согласуются с наблюдениями, о которых сообщают в экспериментальном клиническом испытании (Medaer et al., 1995). Однако влияние Т-клеточной вакцинации на клиническую нетрудоспособность по ОРШН, в отличие от других клинических переменных, было минимальным в обеих группах исследования. Это может отражать отсутствие чувствительности ОРШН для измерения изменений в течение относительно короткого периода времени (24 месяца). Также существует возможность, что даже после того, как Т-клеточная вакцинация ликвидировала или подавила аутоиммунный компонент, для рассасывания воспалительных поражений все же может требоваться много времени, а некоторые из имеющихся повреждений ткани останутся постоянными. С учетом этих результатов, согласно настоящему изобретению предложены аутологичные Т-клеточные вакцины для лечения PC, а также способы использования этих вакцин для лечения PC.

Следует подчеркнуть, что представленные здесь клинические результаты были сопоставлены с собственным статусом пациентов до лечения, а также с оценкой естественной истории PC, как подтверждено в предыдущих испытаниях на PC, а не с контрольными группами, получавшими плацебо. Это исследование также ограничено потенциальным эффектом плацебо, ассоциированным с открытой клинической схемой исследования. Поэтому, хотя это исследование дало важные клинические указания в пользу роли Т-клеточной вакцинации в PC, лечебную эффективность Т-клеточной вакцинации лучше всего оценивать в двойных слепых клинических испытаниях и плацебо-контролируемых клинических испытаниях.

Согласно настоящему изобретению также предложены новые способы получения аутологичных Т-клеточных вакцин, при этом получать эти вакцины легче, чем прежние Т-клеточные вакцины, и они предоставляют гетерогенную популяцию клеток (не клональную), которые могут действовать согласованно, чтобы обеспечивать улучшенный иммунологический ответ у пациентов и избегать потенциальных проблем с расширением эпитопов или клональным изменением, причем указанная популяция предназначена для того, чтобы лучше ликвидировать увеличенное разнообразие Т-клеток, являющихся причиной болезни.

Пример 1

Оценка частоты ОБМ-реактивных Т-клеток в крови пациентов с PC

Частоту ОБМ-реактивных Т-клеток в крови пациентов с PC оценивали с использованием способов, описанных Zhang et al., 1994, Zhang et al., 1993, Medaer at al., 1995 (каждый из которых включен сюда посредством ссылки). В каждом случае материал, который использовали для обработки клеток и клеточной культуры, был строго аутологичным. Из гепаринизированной венозной крови стандартным градиентным разделением Ficoll получали мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК). Высевали МКПК в количестве 200000 клеток на лунку (в сумме 96 лунок) на RPMI 1640 (Hyclone, Logan, Utah), обогащенную 10%-ой инактивированной нагреванием аутологичной сывороткой и рекомбинантным интерлейкином-2 (ИЛ-2) в концентрации 50 МЕ/мл в присутствии двух синтетических пептидов человеческого основного белка миелина (ОБМ), которые соответствуют двум иммунодоминантным участкам (аминокислотным остаткам 83-99 и 151-170, Tejada-Simon et al., Eur. J. Immunol., 2001 Mar; 31(3) 907-917), соответственно, в концентрации 20 мкг/мл. Проводили инкубации при 37°С. Спустя семь дней все культуры повторно стимулировали аутологичными МКПК (замороженными или свежими), подвергнутыми импульсному облучению. Импульсное облучение МКПК проводили инкубацией МКПК с каждым пептидом в концентрации 100 мкг/мл при 37°С в течение трех часов с последующим облучением перед использованием при 4000 рад (40 Гр) от источника, представляющего собой ⁶⁰Со. После еще одной недели инкубации каждую культуру проверяли на специфичную пролиферацию в ответ на пептиды ОБМ в анализе пролиферации, описанном ниже.

Вкратце, каждую лунку делили на 4 аликвоты (приблизительно 10⁴ клеток в аликвоте) и культивировали в двух параллелях с 10⁵ аутологичных МКПК, подвергнутых импульсному облучению, в присутствии и в отсутствие (контроли) вышеописанных пептидов ОБМ. Инкубировали культуры в течение трех дней и проводили импульсное облучение с использованием [³H]-тимидина (Amersham, Arlington Heights, IL) при 1 мкКи на лунку в течение последних 16 часов культивирования. Затем собирали клетки с использованием автоматического сборщика клеток и измеряли включение [³Н]-тимидина счетчиком Betaplate. Клетки определяли как реактивные в отношении пептидов ОБМ, когда число импульсов в минуту от включенного в клетки [³H]-тимидина было больше, чем 1500, и по меньшей мере в три раза больше, чем число импульсов в минуту в контроле (в отсутствие пептидов). Затем рассчитывали частоту ОБМ-реактивных Т-клеток делением числа лунок, показывающих реактивность, на общее число МКПК (19,2×10⁶ клеток), высеянных в исходной культуре (см., например, Zhang et al., 1994; Zhang et al., 1993, Medaer et al., 1995). Такой же способ вычисления неизменно использовали для сравнения изменений частоты ОБМ-реактивных Т-клеток на протяжении всего исследования.

Как показано на Фиг.1, частота циркулирующих ОБМ-реактивных Т-клеток, выявленных у этих пациентов с PC, была приблизительно 14×10^-5, что сравнимо с частотой примерно 10×10^-5, которую сообщили Zhang et al., (1994) и Ota et al., Nature, 346: 183-187 (1990) (см. также пример 5).

Пример 2

Получение миелин-реактивных Т-кпеток для Т-клеточной вакцинации, получение МКПК и первичная стимуляция

Обрабатывали свежие образцы крови в пределах двух часов после получения. Альтернативно мононуклеарные клетки можно получать из цереброспинальной жидкости (МКЦСЖ) пациентов с PC. Выделяли МКПК из цельной крови стандартным способом градиентного разделения Ficoll. Конкретно, гепаринизированную кровь разбавляли сбалансированным солевым раствором Хенкса (ССРХ) (1:1 кровь/ССРХ) и затем медленно наслаивали на раствор Ficoll-hypaque в центрифужной пробирке и центрифугировали в течение 20 мин при 1800 об/мин, от 18°С до 25°С, без применения тормоза. МКПК затем промывали путем добавления избытка ССРХ и центрифугировали при 1700 об/мин в течение 10 минут при температуре от 18°С до 25°С. Промывали очищенные МКПК три раза в среде RPMI 1640 центрифугированием и затем повторно суспендировали в среде AIM V (Gibco, Grand Island, N.Y.). Подсчитывали число клеток и высевали клетки в концентрации 200000 клеток в лунке на 96-луночные культуральные планшеты с U-образным дном. Все планшеты помечали номером пациента и инициалами пациента. К культуре добавляли миелиновые пептиды, рассмотренные в примере 1, в концентрации 20 мкг/мл, соответственно. Помещали планшеты в CO₂-инкубатор и ежедневно проверяли визуально. Для селективного выращивания пептид-специфичных Т-клеток культивировали клетки в течение семи (7) дней без смены культуральной среды.

Идентификация и селекция линий Т-клеток, специфичных к пептидам ОБМ

Приблизительно 50% клеток из всех лунок удаляли и делили поровну в две лунки (антигенные и контрольные лунки). Облучали либо свежие, либо размороженные МКПК при 8000 рад (80 Гр) (используя ⁶⁰Со в качестве источника) и использовали в концентрации 100000 клеток в лунке в качестве источника антиген-представляющих клеток (АПК). Культивировали клетки на RPM1 1640, содержащей 5% человеческой сыворотки АВ⁺. К антигенным лункам добавляли миелиновые пептиды, описанные в примере 1 выше, в концентрации 20 мкг/мл, соответственно. К спаренным контрольным лункам добавляли среду без миелиновых пептидов. Или же можно использовать другие антигены, связанные с рассеянным склерозом, то есть миелиновые антигены и/или их фрагменты, в том числе те, которые описаны Markovic-Plese et al., J. Immunol., (1995), 982-992 (эпитопы протеолипидного протеина); Genain et al., J. Clin. Invest., (1995) 2966-2974; Kerlero de Rosbo et al., J. Clin. Invest., (1993) 92: 2602-2608; Trotter et al., J. Neuroimmunol., (1998) 84: 172-178 и Trotter et at., J. Neuroimmunol. (1997) 75:95 (миелин-протеолипидный протеин); Under et al., Brain, (1999) 122:2089 (миелин-олигодендроцитарный гликопротеин); и Johnson et at., Neurol. (1995) 45: 1264 (глатирамер [сополимер 1]). Согласно настоящему изобретению также предусмотрено применение комбинации вышеуказанных антигенов и/или их фрагментов.

Затем собирали клетки с использованием автоматического сборщика клеток и измеряли включение [³H]-тимидина в счетчике Betaplate. Реактивность каждой Т-клеточной линии/лунки к соответствующему миелиновому пептиду определяли с помощью анализа пролиферации по включению [³H]-тимидина. Конкретно, делили клетки каждой лунки на четыре аликвоты (примерно 10⁴ клеток в аликвоте) и культивировали с 10⁵ облученных аутологичных МКПК в качестве источника АПК в присутствии и в отсутствие миелиновых пептидов в двух параллелях. Инкубировали культуры в течение 3 дней и подвергали импульсному облучению с использованием [³H]-тимидина при 1 мкКи на лунку в течение 16 последних часов культивирования. Т-Клеточную линию определяли как специфичную к миелиновому пептиду, когда и отношение числа импульсов в минуту (имп/мин) антигенной лунки к числу имп/мин контрольной лунки больше или равно трем, и общее число имп/мин антигенной лунки больше 1500. Частоту миелин-реактивных Т-клеток рассчитывали в соответствии со статистикой Пуассона. Остальные 50% клеток идентифицированных миелин-реактивных Т-клеточных линий повторно стимулировали облученными МКПК для экспансии.

Экспансия и установление отобранных Т-клеточных линий/клонов

После того как Т-клеточную линию идентифицировали как реактивную к миелиновому пептиду и затем повторно однократно стимулировали, ее размножали дальше, чтобы получить достаточно клеток для вакцинации с использованием одного из следующих способов: способ прямой экспансии и способ Т-клонирования. Выбор способа размножения зависит от специфичности и реактивности Т-клеточных линий к миелиновым пептидам. Измеряют эти свойства посредством индекса стимуляции (ИС), который вычисляют по результатам анализа пролиферации по включению [³Н]-тимидина, как описано выше. ИС представляет собой отношение числа импульсов в минуту (имп/мин) антигенных лунок к числу имп/мин контрольных лунок. Когда ИС равен 5 или выше 5, используют способ прямой экспансии. Когда ИС ниже 5, используют способ клонирования.

Способ прямой экспансии

Вкратце, миелин-реактивные Т-клетки, идентифицированные как имеющие ИС, равный 5 или выше 5, затем при способе прямой экспансии (СПЭ) размножали в чередующихся циклах стимуляции соответствующими миелиновыми пептидами и ФГА в присутствии облученных аутологичных МКПК. Каждый цикл стимуляции проводили в течение 7-10 дней. Более конкретно, высевали миелин-реактивные Т-клетки, идентифицированные как описано выше, в концентрации 20000-40000 клеток в лунке в присутствии облученных МКПК (АПК) (100000 клеток в лунке). Для цикла стимуляции антигеном добавляли соответствующие миелиновые пептиды в концентрации 20 мкг/мл, а для каждого цикла стимуляции фитогемагглютинином добавляли ФГА в концентрации 1 мкг/мл, соответственно. На второй день цикла стимуляции также добавляли рекомбинантный человеческий ИЛ-2 в концентрации 100 МЕ/мл. Каждые три-четыре дня культуры обновляли средой RPMI 1640, содержащей 10%-ную человеческую сыворотку АВ⁺ и 100 МЕ/мл рекомбинантного ИЛ-2. В чередующихся циклах стимуляции размножали миелин-реактивные Т-клетки до тех пор, пока общее число клеток не достигало приблизительно 20 миллионов.

Реактивность Т-клеточных линий, полученных способом прямой экспансииТ-клеточная линияАнтигенЦикл экспансииИмп/мин (антиген/контроль)ИСЧисло клеток (10⁶)3Е5ОБМ83-9902399/4105,80,2 ОБМ83-9916991/20213,43,4 ФГА25804/12664,523,5      2С9ОБМ83-9904421/312140,16 ОБМ83-9918220/18824,34,2 ФГА210221/31423,221,4

При способе клонирования Т-клеточные линии клонировали с использованием методов лимитирующего разбавления. Клетки Т-клеточной линии, реактивной к каждому миелиновому пептиду, объединяли в пулы и высевали в концентрации от примерно 0,3 до примерно 20 клеток в лунке на культуральную среду RPMI 1640, содержащую 10%-ную человеческую сыворотку АВ⁺ и рекомбинантный ИЛ-2 в концентрации 100 МЕ/мл. Добавляют ФГА в концентрации 1 мкг/мл и добавляли облученные аутологичные АПК в концентрации 100000 клеток в лунке. Культуральную среду RPMI 1640, содержащую рекомбинантный ИЛ-2 в концентрации 100 МЕ/мл, меняли каждые три-четыре дня. Через 14 дней культивирования анализировали лунки, положительные по росту, для определения их специфичной реактивности к соответствующим миелиновым пептидам, как описано выше. Дальнейшую экспансию этих пептид-специфических Т-клеточных линий проводили, следуя способу прямой экспансии, описанному выше, чередующимися циклами стимуляции соответствующими миелиновыми пептидами и фитогемагглютинином.

Пример 3

Истощение ОБМ-реактивных Т-клеток Т-клеточной вакцинацией

В это исследование по открытой схеме вовлекли пятьдесят четыре пациента с РРС (n=28) и ВПРС (n=26). Исходные клинические характеристики этих пациентов показаны в таблице 1. Каждый пациент получал через двухмесячные интервалы три курса подкожных инъекций облученных аутологичных ОБМ-реактивных Т-клеточных клонов (полученных способом клонирования), полученных, как описано выше. На протяжении периода в 24 месяца пациентов наблюдали в отношении изменения частоты предшественников ОБМ-реактивных Т-клеток, частоты рецидивов, ОРШН и активностей поражений по данным МРТ. Сравнивали результаты каждого пациента с его же результатами до вакцинации. В дополнение, с целью предоставить для сравнения данные по естественной истории PC учитывали клинические данные по плацебо при РРС в клиническом испытании бета-интерферона-1а (Jacobs et al., 1996) и при ВПРС в недавнем исследовании бета-интерферона-1b (European Study Group, Lancet, 352: 1491-1497 (1998)). Описанные в этих исследованиях исходные характеристики контрольных лиц, получавших плацебо, были сходными с таковыми для популяции пациентов, которых исследовали здесь, за исключением более низких средних значений ОРШН.

Как показано на Фиг.1 и кратко описано в примере 1, частота предшественников циркулирующих ОБМ-реактивных Т-клеток, исходно выявляемая у этих пациентов с PC (14×10^-5), была весьма сравнимой с частотой, описанной в предыдущих исследованиях (приблизительно 10×10^-5 в мононукларных клетках периферической крови) (Zhang et al., 1994, Ota et al., 1990). Между когортами с РРС и ВПРС не было найдено существенного различия в частоте предшественников ОБМ-реактивных Т-клеток. Через 2-3 месяца после завершения трех курсов вакцинации частота Т-клеток не выявлялась у 92% пациентов или существенно снижалась у остальных пациентов (14×10^-5 в сравнении с 1,9×10^-5, р<0,0001). Эти результаты подтвердили истощение ОБМ-реактивных Т-клеток Т-клеточной вакцинацией у пациентов с PC.

Пример 4

Вакцинация пациента с PC с использованием аутологичных ОБМ-реактивных Т-клеток

В это испытание включили 54 пациента с PC. Критериями включения были клинически определенный PC в течение по меньшей мере двух лет, исходная оценка по расширенной шкале нетрудоспособности (ОРШН) от 1,5 до 6,5 для РРС и от 4,0 до 8,0 для пациентов с вторичным прогрессирующим PC (ВПРС) и по меньшей мере одно обострение за последние два года перед вступлением в исследование для когорты с рецидивирующим PC (РРС). Приблизительно 25% пациентов ранее не отвечали на лечение бета-интерфероном или глатирамером или не переносили его, а остальных пациентов не лечили этими агентами по меньшей мере в течение месяца перед вступлением в исследование и на всем его протяжении. Пациенты не принимали какие-либо иммунодепрессивные лекарства, в том числе стероиды, по меньшей мере в течение трех месяцев до вступления в исследование. Стероиды были разрешены во время исследования, если происходило обострение. Симптоматические лечебные меры против слабости, спастичности и недугов мочевого пузыря запрещенными не были. После объяснения экспериментальных процедур от пациентов было получено информированное согласие. Протокол был одобрен Внутренним комитетом по людям, используемым для исследований, при Бэйлоровском медицинском колледже (Institutional Human Subject Committee at Baylor College of Medicine).

Протокол вакцинации был сходен с тем, который применяли в предыдущих клинических исследованиях (Zhang et al., 1993; Medaer et al., 1995). Вкратце, ОБМ-реактивные Т-клеточные клоны, полученные вышеописанным способом клонирования, предварительно активировали фитогемагглютинином (ФГА) (1 мкг/мл) в присутствии облученных МКПК в качестве источника А-клеток. Затем клетки культивировали в течение 5-6 дней на средах RPMI 1640, обогащенных 10%-ной инактизированной нагреванием аутологичной сывороткой и 50-ю единицами рекомбинантного ИЛ-2. Затем активированные ОБМ-реактивные Т-клетки трижды промывали стерильным физиологическим раствором для удаления оставшегося ФГА и клеточных остатков. После облучения (8000 рад (80 Гр), ⁶⁰Со в качестве источника) клетки вновь суспендировали в 2 мл физиологического раствора и вводили подкожно в две руки (1 мл в руку). Число Т-клеток, которое использовали для вакцинации, находилось в диапазоне от 40×10⁶ до 80×10⁶ клеток на инъекцию, и его выбирали экстраполяцией доз Т-клеток, эффективных у экспериментальных животных, исходя из относительных площадей кожной поверхности (Ben-Nun et al., 1981). Каждый пациент получал три подкожные инъекции с двухмесячными интервалами.

Затем пациентов наблюдали на время начала подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности, на ОРШН, на частоту рецидивов и на активности поражений по данным МРТ. Результаты сравнивали с собственной динамикой пациента до лечения, а также с результатами по плацебо в двух недавних клинических испытаниях на пациентах с РРС и ВПРС, которые служили в качестве оценки естественной истории PC (Jacobs et al., 1996, European Study Group, 1998). Время до прогрессирования определяли по увеличению ОРШН по меньшей мере на 1,0 (Poser et al., 1983), сохраняющемуся по меньшей мере 2 месяца. Определяли обострения во время исследования по появлению новых неврологических симптомов или ухудшению ранее существовавших неврологических симптомов, продолжающемуся по меньшей мере 48 часов, сопровождающихся объективным изменением при неврологическом обследовании (ухудшение ОРШН по меньшей мере на 0,5 пункта). Пациентов инструктировали докладывать о событиях между назначенными регулярными визитами, и, если их симптомы свидетельствовали об обострении, их обследовал невролог. Оценки безопасности включали в себя нежелательные события, показатели жизненно важных функций и физические обследования при регулярных визитах. Различия между клиническими переменными у исследуемых пациентов до и после Т-клеточной вакцинации анализировали с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона (Wilcoxon).

Пример 5

Изменение клинического течения PC после вакцинации

Осуществляли попытки обратиться к вопросу, будет ли истощение циркулирующих ОБМ-реактивных Т-клеток Т-клеточной вакцинацией изменять клиническое течение PC. Пациентов вакцинировали аутологичными Т-клеточными вакцинами, полученными как описано выше. С Т-клеточной вакцинацией не были ассоциированы нежелательные эффекты, кроме легкой и преходящей эритемы в месте инъекции, заметной у некоторых пациентов, и всех пациентов лечили в клинике для амбулаторных больных. Как показано в таблице 2, у пациентов с РРС средняя ОРШН слегка снижалась (3,21 при поступлении в сравнении с 3,1 при выходе) за период в 24 месяца после вакцинации. Для сравнения, в естественной истории РРС (n=56) за такой же период наблюдения имело место увеличение средней ОРШН на 0,61, как сообщали в испытании, проведенном с использованием бета-интерферона-1а (Jacobs et al., 1996). Вдобавок, доля пациентов, у которых ОРШН была либо неизменной, либо улучшенной, была значительно выше, чем в случае естественной истории PC (75% в сравнении с 50%). Только у одного пациента (3,5%) в группе лечения с РРС наблюдалось прогрессирование ОРШН больше двух в пределах 24 месяцев, в сравнении с 18% пациентов в случае естественной истории PC (Таблица 2).

В когорте с ВПРС средняя ОРШН за период в 24 месяца прогрессировала слегка (+0,12) в сравнении с +0,6, зарегистрированным в случае естественной истории ВПРС (European Study Group, Lancet 1998; 352: 1491-1497). Более того, оценка времени до подтвержденного прогрессирования с использованием метода Каплана-Мейера (Kaplan-Meier) показала значительную задержку (20%-ное прогрессирование за 18 месяцев в обеих группах лечения) в сравнении с естественной историей пациентов с PC (20%-ное прогрессирование за 12 месяцев для РРС и за 9 месяцев для ВПРС) (Jacobs et al., Ann. Neurol, 1996; 39: 285-294; European Study Group, 1998). Однако прогрессирование, по-видимому, увеличилось после 18 месяцев (12 месяцев после последней вакцинации) в обеих исследованных группах.

Пример 6

Изменения частоты клинических обострении

Как показано в таблице 3, у пациентов с РРС после Т-клеточной вакцинации частота рецидивов в год снизилась, составив 40%-ное снижение от исходной частоты рецидивов. Не удалось обнаружить существенного различия частоты рецидивов между первым годом и вторым годом испытания. Для сравнения, в случае естественной истории РРС наблюдали снижение частоты рецидивов в год на 25% (Jacobs et al., 1996). Более того, доля пациентов, демонстрирующих отсутствие приступов или меньшую частоту приступов, была значительно выше, чем в случае естественной истории PC (Таблица 3). Хотя в когорте с ВПРС частота рецидивов снизилась на 50%, лишь небольшое число обследованных здесь пациентов с ВПРС (6/26) имело рецидив в течение двух лет до вступления в это исследование.

Пример 7

Активности поражений головного мозга по данным обследования посредством МРТ

Магнитно-резонансную томографию (МРТ) выполняли в форме улучшенных гадолинием Т2-взвешенных изображений. Оценивали области повышенной интенсивности сигнала полуколичественным способом (Scheltens et al., Brain 1992; 115: 735-748, Truyen et al., J.Neurol. Sci., 1990; 96: 173-182). Этот количественный метод давал оценку, относящуюся как к размеру, так и к числу очагов повышенной гиперинтенсивности сигнала. Оценивали гиперинтенсивности сигнала в следующих областях: (1) околожелудочковая, в лобной и затылочной области и параллельно боковым желудочкам; (2) долевое белое вещество по отдельности в лобной, височной, теменной и затылочной области; (3) базальные ганглии, хвостатое ядро, скорлупа, бледное ядро и зрительный бугор и (4) субтенториальная область, мозжечок, средний мозг, мост и продолговатый мозг. Поражения оценивали следующим образом: поражению с диаметром меньше 0,5 см давали оценку "1", между 0,5 см и 1,0 см оценку "2", между 1,0 см и 1,5 см оценку "3", между 1,5 см и 2,0 см оценку "4", больше, чем 2 см, оценку "5". Сливающиеся поражения измеряли следующим образом: оценку "5" дают, когда менее 25% области, представляющей интерес, как определено выше, считали имеющими аномальную интенсивность сигнала, "10" и "15" для 25% и 50%, когда было затронуто более 50% визуализированной области. Затем прибавляли эти величины к "индивидуальным" оценкам поражений.

Для отслеживания служивших показателем прогрессирования болезни изменений активностей поражений головного мозга выполняли при поступлении (исходное значение), на сроке 12 месяцев и при выходе (24 месяца) три обследования улучшенной гадолинием Т2-взвешенной МРТ. Из-за технического несоответствия некоторых томограмм, выполненных в разных медицинских центрах, томограммы МРТ можно было анализировать только у 34 пациентов. Все томограммы МРТ оценивал сторонний нейрорадиолог, который не участвовал в этом клиническом испытании. Для оценки активности поражений использовали полуколичественный метод балльных оценок, который применяли ранее в экспериментальном клиническом испытании авторов изобретения и других имеющих отношение исследованиях (Medaer et al., 1995, Scheltens et al., 1992, Truyen et al., 1990). Этот метод балльных оценок дает оценку, относящуюся как к размеру, так и к числу очагов с повышенной гиперинтенсивностью сигнала Т2-взвешенных изображений. Как показано в таблице 4, результаты выявили, что у 70% обследованных пациентов оценки поражений по данным МРТ были либо неизменными, либо улучшенными, как определено снижением балльной оценки поражения по меньшей мере на один пункт, тогда как у остальных 30% пациентов балльные оценки поражений в ходе этого исследования были увеличенными. По группе, изменения средней оценки поражения по данным МРТ составили 1,2%-ное снижение в первый год и увеличение на 3,3% от исходной МРТ во второй год. Однако эти изменения не были достоверными (р>0,4). Эти результаты могут отражать стабилизацию или некоторое улучшение, которое можно приписать Т-клеточной вакцинации, поскольку у пациентов с РРС, которых не лечат, поражения по данным МРТ обычно прогрессируют приблизительно на 10% ежегодно, как документировано в предыдущих клинических испытаниях (European Study Group, 1998, IFNB Multiple Sclerosis Study Group, Neurot., 1993; 43: 655-661). Из всей совокупности этих результатов следует благоприятная корреляция между истощением ОБМ-реактивных Т-клеток Т-клеточной вакцинацией и клиническим улучшением обследованных пациентов с PC.

Это изобретение описано посредством неограничивающих примеров и предпочтительных воплощений, которые не предназначены для ограничения объема этого изобретения, который изложен в прилагаемой формуле изобретения.

ТАБЛИЦА 1Клинические характеристики пациентов до леченияГруппа пациентовЧисло случаевСредний возрастМужчины/женщиныДлительность (годы)ОРШН при вступленииЧастота рецидивовГруппы исследования      РРС2845±9,713/157,4±7,33,2±2,11,25ВПРС2649±8,110/1615,5±9,36,1±0,9        Естественная история PC      РРС^а14336,9±0,0540/1036,4±0,52,3±0,071,2ВПРС^б35840,9±7,2128/23013,4±7,55,2±1,1 ^а Контрольная группа, получавшая плацебо, в испытании бета-интерферона 1а [7]^б Контрольная группа, получавшая плацебо, в испытании бета-интерферона 1b [5]

ТАБЛИЦА 2Число устойчивых изменений ОРШН в срок до двух летГруппа пациентовИзменение ОРШНЧисло случаевПроцентильГруппа исследования     РРС (n=28)Нет изменений 0,01553,5 Улучшение ≥0,5621,4   >1,027,1 Ухудшение 0,5414,2   1,000   1,500   >2,013,5 Среднееизменение-0,11   ОРШН^a          ВПРС (n=26)Нет изменений 0,01246,1 Улучшение ≥0,5415,3   >1,013,8 Ухудшение 0,5519,2   1,013,8   1,513,8   >2,027,6 Среднееизменение+0,12   ОРШН          Естественная история           РРС^б (n=56)Нет изменений 0,01425 Улучшение ≥0,5916,1   >1,058,9 Ухудшение 0,51119,6   1,047,1   1,523,6   >2,01017,9 Среднееизменение+0,61   ОРШН          ВПРС^вСреднееизменение+0,60  (n=187)ОРШН          ^а Изменение ОРШН у пациента от исходного уровня к году 2^б Контрольная группа, получавшая плацебо, в испытании бета-интерферона 1а [7]^в Контрольная группа, получавшая плацебо, в испытании бета-интерферона 1b [5]

ТАБЛИЦА 3Частота клинических обостренийГруппа пациентовЧастота рецидивов в годЧисло рецидивовЧисло пациентовПроцентильГруппа исследования    РРС (n=28)1,25 (до исследования)    0,75 (24 месяца)01139,2  1414,2  2517,8  3517,8  ≥4310,7     Естественная история^а    РРС (n=87)1,2 (до исследования)    0,9 (24 месяца)02326  12630  21011  31214  ≥41617^а Контрольная группа, получавшая плацебо, в испытании бета-интерферона 1а [7]ТАБЛИЦА 4Средние балльные оценки поражения по данным МРТ в полуколичественном анализе и процент изменений от исходной МРТПациентыИсходный уровень12 месяцев24 месяца  (% изменения)(% изменения)В сумме 3414,944,76 (-1,2%)15,44 (+3,3%)19/34 (55%)Без изменений  10/34 (29%)Увеличение балльной оценки поре по данным МРТ по меньшей мере на один пункт через 24 месяца5/34 (14%)Уменьшение балльной оценки поражения по данным МРТ по меньшей мере на один пункт через 24 месяца

Настоящее изобретение относится к аутологичной Т-клеточной вакцине и способу ее получения. Сущность изобретения заключается в получении от пациента, подлежащего лечению множества мононуклеарных клеток, содержащих Т-клетки, инкубировании этих клеток с одним из антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, их стимулировании антиген-представляющими клетками и антигеном, ассоциированным с рассеянным склерозом и в повторном стимулировании Т-клеток антигеном, ассоциированным с рассеянным склерозом, стимулировании митогеном в присутствии интерлейкина-2 и повторении указанных стадий. Указанная вакцина может применяться для лечения рассеянного склероза. Преимущество изобретения заключается в снижении числа рецидивов у больных с рассеянным склерозом. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил.

1. Аутологичная Т-клеточная вакцина для лечения рассеянного склероза, которую получают способом, при котором

(а) получают от пациента, подлежащего лечению вакциной, множество мононуклеарных клеток, включающее в себя Т-клетки;

(б) инкубируют эти Т-клетки в присутствии одного или более чем одного из антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, либо одного или более чем одного их фрагмента;

(в) стимулируют Т-клетки, полученные на стадии (б), антиген-представляющими клетками (АПК) и антигеном(ами), ассоциированным(и) с рассеянным склерозом, или их фрагментами;

(г) стимулируют Т-клетки со стадии (в) антигеном(ами), ассоциированным(и) с рассеянным склерозом, или их фрагментами;

(д) стимулируют Т-клетки со стадии (г) митогеном в присутствии интерлейкина-2 (ИЛ-2);

(е) повторяют стадии (г) и (д) один или более чем один раз,

где один или более чем один антиген, связанный с рассеянным склерозом, представляет собой миелиновый антиген, выбранный из группы, состоящей из основного белка миелина, протеолипидного липопротеина, миелин-олигодендроцитарных гликопротеинов, либо их фрагмента или фрагментов.

(а) получают от пациента, подлежащего лечению вакциной, множество мононуклеарных клеток, включающих в себя Т-клетки;

(б) инкубируют эти Т-клетки в присутствии одного или более чем одного из антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, либо одного или более чем одного их фрагмента;

(в) стимулируют Т-клетки, полученные на стадии (б), антиген-представляющими клетками (АПК) и антигеном(ами), ассоциированным(и) с рассеянным склерозом, или их фрагментами;

(г) стимулируют Т-клетки со стадии (в) антигеном(ами), ассоциированным(и) с рассеянным склерозом, или их фрагментами;

(д) стимулируют Т-клетки со стадии (г) митогеном в присутствии интерлейкина-2 (ИЛ-2);

(е) повторяют стадии (г) и (д) один или более чем один раз,

где один или более чем один антиген, связанный с рассеянным склерозом, выбран из группы, состоящей из основного белка миелина, протеолипидного липопротеина, миелин-олигодендроцитарных гликопротеинов, либо их фрагмента или фрагментов.