ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ Т-КЛЕТОК Российский патент 2008 года по МПК A61K39/17 C07K7/08 C07K14/435 A61P25/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в основном к области диагностики и лечения аутоиммунного заболевания, такого как рассеянный склероз (PC). В частности, оно относится к выделению антигенспецифичных Т-клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию антигенспецифичных Т-клеток для лечения аутоиммунного заболевания, такого как PC.

Предпосылки создания изобретения

Межклеточные комплексы распознавания, образованные Т-клеточными рецепторами (ТкР) на цитотоксических Т-лимфоцитах или хелперных Т-клетках, и комплексы МНС/пептид на антигенпрезентирующих клетках (АПК), представляют собой распространенный компонент распознавания в многообразной группе взаимодействий типа клетка-клетка, которые активируют Т-клетки как в период развития спектра Т-клеток в индивидуальном организме (положительная селекция, отрицательная селекция, периферическое выживание), так и в период контрольной (Т-хелпер) и эффекторной (Т-киллер) стадий адаптивного иммунного ответа.

В адаптивном иммунном ответе антигены распознаются гипервариабельными молекулами, такими как антитела или ТкР, которые экспрессируются с достаточно разнообразными структурами для того, чтобы иметь возможность распознать любой антиген. Антитела могут связываться с любой частью поверхности антигена. Однако ТкР ограничены связыванием с короткими пептидами, связанными с молекулами класса I или класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности АПК. Распознавание ТкР комплексов пептид/МНС инициирует активацию (клональную экспансию) Т-клетки.

ТкР представляют собой гетеродимеры, состоящие из двух цепей, которые могут быть αβ (альфа-бета) или γδ (гамма-дельта). Структура ТкР очень близка структуре иммуноглобулинов (Ig). Каждая цепь имеет два экстрацеллюларных домена, которые имеют характерную для иммуноглобулинов укладку цепи. Аминоконцевой домен является высоковариабельным и называется вариабельным (V) доменом. Ближайший к мембране домен представляет собой константный (С) домен. Два данных домена аналогичны таковым доменам иммуноглобулинов и напоминают фрагменты Fab. V-домен каждой цепи имеет три участка, определяющих комплементарность (или гипервариабельных участка) (CDR). Проксимально к мембране каждая цепь ТкР содержит короткую связывающую последовательность с остатком цистеина, который образует дисульфидную связь между обеими цепями.

Гены, кодирующие гетеродимеры αβ и γδ, экспрессируются только в Т-клеточной линии. Четыре локуса ТкР (α, β, γ и δ) имеют организацию зародышевой линии, очень близкую их организации в Ig. α- и γ-цепи получают путем реаранжировки сегментов V и J, тогда как β- и δ-цепи получают путем реаранжировки D и J. Сегменты гена цепей ТкР находятся на разных хромосомах за исключением сегментов δ-цепи, которые находятся между сегментами гена V и J α-цепи. Положение сегментов гена δ-цепи имеет большое значение: продуктивная реаранжировка сегментов α-цепи приводит к делеции С-генов δ-цепи, вследствие чего в данной клетке αβ-гетеродимер не может коэкспрессироваться с γδ-рецептором.

У мышей имеется около 100 Vα- и 50 Jα-сегментов гена и только один Сα-сегмент. Семейство генов δ-цепи включает около 10 V-, 2 D-и 2 J-сегмента гена. Семейство генов β-цепи включает 20-30 V-сегментов и два идентичных повтора, содержащих 1 Dβ, 6 Jβ и 1 Сβ. Наконец, семейство генов γ-цепи включает 7 V- и 3 различных J-C-повтора. У человека организация аналогична организации у мышей, но число сегментов отличается.

Реаранжировка в сегментах гена в α- и β-цепях подобна реаранжировке Ig. α-цепь, подобно легкой цепи Ig, кодируется сегментами гена V, J и С. β-цепь, подобно тяжелой цепи Ig, кодируется сегментами гена V, D и J. Реаранжировки сегментов гена α-цепи приводят в результате к соединению VJ, и реаранжировки β-цепи приводят в результате к соединению VDJ. После транскрипции реаранжированных генов, процессинга РНК и трансляции α- и β-цепи экспрессируются связанными дисульфидной связью в мембране Т-клеток.

Сегменты гена ТкР фланкированы последовательностями распознавания сигнала (ПРС), содержащими гептамер и нонамер с промежуточной последовательностью либо из 12 нуклеотидов (один виток), либо 23 нуклеотидов (два витка). Как в Igs, ферменты, кодируемые генами активации рекомбинации (RAG-1 и RAG-2), отвечают за процессы рекомбинации. RAG1/2 распознает ПРС и соединяет сегменты V-J и V-D-J таким же образом, как при реаранжировках Ig. Вкратце, данные ферменты разрезают одну нить ДНК между сегментом гена и ПРС и катализируют образование шпильки в кодирующей последовательности. Впоследствии сигнальная последовательность вырезается.

Комбинаторное соединение сегментов V и J в α-цепях и сегментов V, D и J в β-цепи приводит к образованию большого числа возможных молекул, создавая, таким образом, разнообразие ТкР. Разнообразие в ТкР достигается также альтернативным соединением сегментов генов. В противоположность Ig, сегменты гена β и δ могут быть соединены альтернативными путями. Фланкирующие сегменты гена ПРС в сегментах гена β и δ могут генерировать VJ и VDJ в β-цепи и VJ, VDJ и VDDJ в δ-цепи. Как в случае с Ig, разнообразие получают также путем вариабельности соединения генных сегментов.

Гипервариабельные петли ТкР, известные как участки, определяющие комплементарность (CDRs), распознают сложную поверхность, образованную молекулой МНС и связанным пептидом. Петли CDR2 α и β контактируют только с молекулой МНС на поверхности АПК, тогда как петли CDR1 и CDR3 контактируют как с пептидом, так и с молекулой МНС. По сравнению с Ig ТкР имеют более ограниченное разнообразие в CDR1 и CDR2. Однако разнообразие петель CDR3 в ТкР выше, чем в таковое в Ig, поскольку ТкР могут присоединять больше одного сегмента D, что приводит к расширенному разнообразию присоединения.

Считают, что патогенез ряда аутоиммунных заболеваний вызывается ответами аутоиммунных Т-клеток на аутоантигены, присутствующие в организме. В нарушение принципов клональной селекции не все аутореактивные Т-клетки уничтожаются в тимусе. Данные Т-клетки с ТкР для широкого спектра аутоантигенов представляют часть Т-клеток нормального состава и обычно циркулируют в периферической крови. Неясно, почему допускается, чтобы аутореактивные Т-клетки в процессе их эволюции проходили дифференцировку в тимусе и находились на периферии. Хотя их физиологическая роль неясна, данные ауторективные Т-клетки, будучи активированными, представляют потенциальный риск в плане индукции аутоиммунных патологий. Аутореактивные Т-клетки могут быть также выделены у нормальных субъектов без последствий в отношении аутоиммуных заболеваний. Установлено, что антигенное распознавание аутореактивности само по себе недостаточно для опосредования аутодеструктивного процесса. Одним из предварительных условий, необходимых для того, чтобы аутореактивные Т-клетки стали патогенными, является то, что они должны быть активированы.

Аутореактивные Т-клетки участвуют в патогенезе аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз (PC) и ревматоидный артрит (РА). Патогенез аутореактивных Т-клеток при PC, как правило, поддерживается в результате ответов Т-клеток на миелиновые антигены, в частности миелиновый основной белок (МОЕ). Обнаружено, что МОБ-реактивные Т-клетки подвергаются активации in vivo, и их предшественники встречаются с повышенной частотой в крови и спинномозговой жидкости больных PC в противоположность субъектам контрольной группы. Данные МОБ-реактивные Т-клетки продуцируют цитокины Т_H1, например IL-2, TNFα - и γ-интерферон (IFN-γ), которые облегчают миграцию воспалительных клеток в центральную нервную систему и усиливают воспалительные ответы, связанные с деструкцией миелина при PC.

Миелинреактивные Т-клетки, как было также показано, участвуют в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у животных, который имеет сходство с PC. ЭАЭ можно индуцировать активно у восприимчивых животных путем инъекции белков миелина, эмульгированных в адъюванте, или пассивно путем инъекции миелинреактивных Т-клеточных линий и клонов, выделенных у сенсибилизированных миелином животных. При активации in vitro для индукции ЭАЭ требуются очень маленькие количества миелинреактивных Т-клеток, при этом в 100 раз превосходящее количество покоящихся Т-клеток с такой же реактивностью неспособно опосредовать ЭАЭ.

Было показано, что ЭАЭ можно предупредить, а также лечить посредством вакцинации инактивированными миелинреактивными Т-клетками, способом, названным Т-клеточной вакцинацией (см. статью Ben-Nun et al., Nature, 1981; 292: 60-61). Т-клеточная вакцинация индуцирует регуляторные иммунные ответы, состоящие из антиидиотипических Т-клеток и антиэрготипических Т-клеток, которые приводят к истощению миелинреактивных Т-клеток. При истощении миелинреактивных Т-клеток наблюдаются терапевтические эффекты на моделях ЭАЭ и других экспериментальных аутоиммунных заболеваний (см. статьи Lider et al., Science, 1988; 239:820-822; Lohse et al., Science, 1989; 244: 820-822).

Вследствие успеха на моделях аутоиммунных заболеваний Т-клеточная вакцина в последнее время передана на клинические испытания на пациентах с PC. Основываясь на результатах на экспериментальных моделях, таких как ЭАЭ, считают, что истощение аутореактивных Т-клеток может улучшить клиническое течение PC и других иммунных болезней.

В пилотном клиническом испытании вакцинация облученными аутологичными МОБ-реактивными Т-клеточными клонами вызывала ответы цитолитических Т-клеток CD8⁺, которые специфически распознавали и лизировали циркулирующие в крови МОБ-реактивные Т-клетки (см. статьи Zhang et al., Science, 1993; 261: 1451-1454, Medaer et al., Lancet 1995: 346: 807-808). Три подкожные инокуляции облученных МОБ-реактивных Т-клеточных клонов приводили к истощению циркулирующих в крови МОБ-реактивных Т-клеток у больных PC.

В предварительном клиническом испытании циркулирующие в крови МОБ-реактивные Т-клетки истощали у пациентов с рецидивирующим-ремиттирующим РС и пациентов с вторичным прогрессирующим PC (см. статью Zhang et al., J. Neurol., 2002; 249: 212-8) путем вакцинации пациентов тремя подкожными инъекциями облученных аутологичных МОБ-реактивных Т-клеток. Т-клеточная вакцинация оказывала положительное действие на каждую группу пациентов, как измеряют по уровню рецидивов, значению по расширенной шкале нетрудоспособности и активности поражения по данным ЯМР-томографии. Однако имелась тенденция к ускоренному прогрессированию через приблизительно двенадцать месяцев после последней инъекции. Значение явного ускоренного прогрессирования неизвестно, может быть оно связано с постепенным снижением иммунитета, вызванным Т-клеточной вакцинацией против МОБ-реактивных Т-клеток. У приблизительно 10-12% иммунизированных пациентов МОБ-реактивные Т-клетки вновь появлялись примерно в то же время, что ускоренное прогрессирование. В ряде случаев вновь появляющиеся МОБ-реактивные Т-клетки происходили из различных клональных популяций, которые не были выявлены до вакцинации, предполагая возможность того, что в МОБ-реактивных Т-клетках может проходить клональный сдвиг или распространение эпитопа. Клональный сдвиг МОБ-реактивных Т-клеток был отмечен в предшествующих исследованиях (см. статью Zhang et al. 1995) и может быть связан с текущим болезненным процессом.

Хотя было продемонстрировано, что Т-клеточная вакцинация эффективна в плане истощения миелинреактивных Т-клеток и потенциально положительно воздействует на больных PC, существует ряд проблем, связанных с лечением. Лечение Т-клеточной вакциной для каждого больного должно быть индивидуализировано, поскольку Т-клеточные рецепторы миелинреактивных Т-клеток очень разнообразны и отличаются у разных больных PC (см. статьи Vandevyver et al., Eur. J. Immunol, 1995; 25:958-968, Wucherpfennig et al., J. Immunol., 1994; 152: 5581-5592, Hong et al., J. Immunol., 1999; 163: 3530-3538).

В дополнение к индивидуализации для каждого больного для получения данной Т-клеточной вакцины с использованием имеющихся в настоящее время способов требуется 8 недель. Получение Т-клеточной вакцины начинается с выделения мононуклеарных клеток из спинномозговой жидкости (МКСМЖ) или периферической крови больного (МКПК). Затем выделенные мононуклеарные клетки культивируют с миелиновыми пептидами в течение 7-10 дней с целью активации миелинреактивных Т-клеток. Потом культуры тестируют на специфическую пролиферацию в отношении миелиновых пептидов посредством измерения включения [³Н]-тимидина в присутствии миелиновых пептидов в течение 3 дней. Тестируемые культуры, положительные в плане специфической пролиферации в отношении миелиновых пептидов, затем серийно разводят для получения клональных Т-клеточных линий или непосредственно размножают. Затем клетки культивируют до 6-8 недель для размножения Т-клеток. Когда конечный продукт Т-клеточной вакцины является клональным, Т-клетки гомогенны, имея один тип использования гена Vβ-Dβ-Jβ. Обычно комбинируют от трех до шести клональных клеточных линий для получения гетерогенного препарата с множеством типов использования гена Vβ-Dβ-Jβ. Когда конечный продукт Т-клеточной вакцины получают путем непосредственной экспансии, Т-клетки гетерогенны, имея более одного типа использования гена Vβ-Dβ-Jβ.

Индивидуализированная природа Т-клеточной вакцинации и продолжительное культивирование клеток, необходимые для получения каждой вакцины, делают лечение в рамках современных методик дорогим и трудоемким. Длительное время, требующееся для получения клеточной культуры, также создает значительный риск заражения. Наконец, вероятность клонального сдвига или распространения эпитопа миелинреактивных Т-клеток может потребовать последующего получения Т-клеточной вакцины для каждого больного с различным типом использования гена Vβ-Dβ-Jβ.

Вследствие этого существует необходимость разработки усовершенствованных способов выделения Т-клеток со специфичностью к антигенам, таким как МОБ, которые могут использоваться для получения Т-клеточных вакцин для лечения больных с заболеваниями, опосредованными Т-клетками, такими как PC. Имеется также необходимость разработки способов получения Т-клеточных вакцин с гетерогенным типом использования гена Vβ-Dβ-Jβ, чтобы принять во внимание клональный сдвиг аутореактивных Т-клеток.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение в основном направлено на способы выделения антигенспецифических Т-клеток и, в особенности, Т-клеток, специфичных в отношении собственных или аутоантигенов. Способы выделения одной или более Т-клеток, специфичных в отношении антигена, представляющего интерес, как правило, включают инкубирование образца, содержащего Т-клетки, полученные от больного, с данным антигеном или его модификацией; отбор одной или более Т-клеток, которые экспрессируют один или более первых маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD69, CD4, CD25, CD36 и HLADR, и один или более вторых маркеров, выбранных из группы, состоящей из IL-2, TNFα, IFN-γ, IL-5, IL-10 и IL-13.

Способы, соответствующие изобретению, особенно эффективны для выделения аутореактивных Т-клеток, которые играют роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Способы, соответствующие изобретению, кроме того, позволяют диагностировать аутоиммунное заболевание, а также контролировать развитие заболевания и контролировать эффективность лечения заболевания.

Способы, соответствующие изобретению, обеспечивают также получение аутологичных Т-клеточных вакцин для лечения связанных с Т-клетками аутоиммунных заболеваний.

Способы получения вакцин в основном включают выделение антигенспецифических Т-клеток, как описано выше, за которыми необязательно идут последующие стадии культивирования, которые дают возможность размножения популяции выделенных антигенспецифических Т-клеток.

В числе прочего изобретение направлено также на Т-клеточные вакцины и фармацевтические композиции, включающие антигенспецифические Т-клетки, выделенные при использовании способов, соответствующих изобретению.

Способы, соответствующие изобретению, используют также для изучения свойств Т-клеточных рецепторов и кодирующих их нуклеиновых кислот.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлена идентификация с помощью FACS (клеточного сортинга с возбуждением флуоресценции) клеток, экспрессирующих CD69 и γINF (сверху) и CD69 и TFNα (внизу) у больного рассеянным склерозом перед стимуляцией (слева), после стимуляции остатками 83-99 МОБ (середина) и после стимуляции остатками 83-99 МОБ (справа).

На фигуре 2 представлена идентификация с помощью FACS клеток, экспрессирующих CD69 и IFN-γ (сверху) и CD69 и TNFα (внизу) у здорового пациента контрольной группы перед стимуляцией (слева), после стимуляции остатками 83-99 МОБ (середина) и после стимуляции остатками 83-99 МОБ (справа).

Детальное описание изобретения

1. Определения

Для помощи в понимании настоящего изобретения ниже определен ряд терминов.

Термин "аутоантиген", как используют в данном контексте, относится к антигену или эпитопу, который является нативным для млекопитающего, который является иммуногенным при указанном заболевании млекопитающего и консервативным у данного вида млекопитающих и который может быть включен в патогенез аутоиммунного процесса.

Термин "CD", "кластер дифференцировки" или "общая детерминанта", как используют в данном контексте, относится к молекулам клеточной поверхности, распознаваемым антителами. Экспрессия некоторых CD является специфичной для клеток определенной линии или пути созревания, а экспрессия других отличается в соответствии со статусом активации, положения или дифференцировки одних и тех же клеток.

Термин "полученный (выделенный) из" или "его производное (модификация)" в контексте нуклеотидных последовательностей означает, что нуклеотидная последовательность не ограничена описанной специфичной последовательностью, но также включает изменения в данной последовательности, которые могут включать добавления, делеции, замены или модификации в той степени, в которой изменения в описанной последовательности сохраняют способность гибридизоваться в умеренных или очень жестких условиях с комплементом описанной последовательности. В контексте пептидных или полипептидных последовательностей термин "полученный из" или "его производное (модификация)" означает, что пептид или полипептид не ограничен описанной специфической последовательностью, но также включает изменения в данной последовательности, которые могут включать добавления, делеции, замены или модификации в той степени, в которой изменения в указанной последовательности сохраняют способность вызывать иммунный ответ на описанную последовательность.

Термин "иммуногенный" при использовании для описания пептида или полипептида означает, что пептид или полипептид способен индуцировать иммунный ответ, опосредованный как Т-клеткой, так и антителом или обоими.

Термин "иммунное заболевание" означает заболевание, при котором иммунная система участвует в патогенезе заболевания. Аутоиммунные заболевания представляют собой подгруппу иммунных заболеваний. Аутоиммунные заболевания включают, но без ограничения перечисленным, ревматоидный артрит, злокачественную миастению, рассеянный склероз, системную красную волчанку, аутоиммунный тиреоидит (тиреоидит Хашимото), болезнь Грейвса, воспалительную болезнь кишки, аутоиммунный увеоретинит, полимиозит и некоторые типы диабета. В свете настоящего описания компетентный специалист в данной области может легко представить другие аутоиммунные заболевания, поддающиеся лечению композициями и способами, соответствующими настоящему изобретению.

Термин "ПЦР" означает полимеразную цепную реакцию, например, как в основном описано в патенте США No. 4683202 (выданном 28 июля 1987 г. Mullis), который включен в данном контексте в виде ссылки. ПЦР представляет собой методику амплификации, в которой выбранные олигонуклеотиды или праймеры можно гибридизовать с нуклеиновыми кислотами-матрицами в присутствии полимеризационного агента (такого как ДНК-или РНК-полимераза) и нуклеотидтрифосфатов, причем продукты удлинения могут быть образованы из праймеров. Затем эти продукты можно денатурировать и использовать в качестве матриц в циклической реакции, которая амплифицирует число и количество имеющихся нуклеиновых кислот, что может облегчить их последующую детекцию. Множество методик ПЦР известно в области техники и может быть использовано в связи с приведенным в данном контексте описании.

"Пептид" или "полипептид" представляет собой связанную последовательность аминокислот и может быть природным, синтетическим или модификацией либо комбинацией природного и синтетического.

Термин "праймер" означает олигонуклеотид, природный ли, синтетический или его модификацию, способный действовать как точка инициации синтеза нуклеотида, достаточно комплементарного специфичной нуклеотидной последовательности на молекуле-матрице.

Термин "зонд" означает олигонуклеотид, природный ли, синтетический или его модификацию, способный к специфичному связыванию достаточно комплементарной нуклеотидной последовательности.

Термин "заболевание, опосредованное Т-клетками" означает заболевание, возникающее в результате распознавания Т-клетками собственных антигенов.

Термин "терапия" или "лечение", когда он относится к защите животного от заболевания, означает предупреждение, супрессию, подавление или полное устранение заболевания. Предупреждение заболевания включает введение композиции, соответствующей настоящему изобретению, до начала заболевания. Супрессия заболевания включает введение композиции, соответствующей настоящему изобретению, животному после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение композиции, соответствующей настоящему изобретению, животному после клинического проявления заболевания.

2. Выделение антигенспецифических Т-клеток

а. Выделение моноклональных антигенспецифических Т-клеток

Т-клетки могут быть активированы и размножены в культуре клеток посредством инкубирования с антигеном-мишенью и антиген-презентирующими клетками. После активации в Т-клетках происходит сложный каскад передачи клеточного сигнала, который приводит к транскрипции и экспрессии продуктов многих генов. Изобретение, описанное в данном контексте, обладает преимуществом продуктов генов, специфичных для активированных Т-клеток, в плане идентификации и выделения Т-клеток с требующейся антигенной специфичностью.

В первом аспекте настоящее изобретение направлено на способ выделения Т-клетки, специфичной в отношении представляющего интерес антигена. Образец, включающий Т-клетки, инкубируют с определенным антигеном, который вызывает активацию Т-клеток, специфичных в отношении представляющего интерес антигена. Образец можно инкубировать с антигеном в течение 1-7 дней. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 1 дня. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 16 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 12 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 8 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 4 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 2 часов.

Т-клетка, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, затем может быть выделена посредством селекции Т-клеток, которые экспрессируют продукты генов Т-клеток, активированных как описано выше.

Подгруппы активированных Т-клеток могут быть выделены посредством селекции Т-клеток с использованием специфичных для подгруппы продуктов генов или маркеров клеточной поверхности (например, CD4 относительно CD8).

Представляющий интерес антиген включает миелиновый основной белок (МОБ), белок протеолипида (ПЛБ), гликопротеин миелина олигодендроцитов (ГМО) или его фрагмент. Представляющий интерес антиген может также являться иммунодоминантным фрагментом, включающим, но не ограниченным остатками 83-99 или остатком 151-170 МОБ. Представляющий интерес антиген может также представлять собой комбинацию двух или более индивидуальных антигенов, представляющих интерес.

Антиген или его производное, используемые для активации Т-клеток, может быть любым иммуногеном, который способен вызывать иммунный ответ на антиген, представляющий интерес. Активирующий антиген может быть антигеном, представляющим интерес, или его производным. Активирующий антиген может быть МОБ, ПЛБ, ГМО или его фрагментом и/или производным. Активирующий антиген может также быть иммунодоминантным фрагментом, включающим, но не ограниченным остатками 83-99 или остатком 151-170 МОБ или их фрагментом и/или производным. Активирующий антиген может также быть комбинацией двух или более индивидуальных активирующих антигенов. Активирующий антиген может быть использован один или более раз для активации Т-клеток, специфичных в отношении антигена, представляющего интерес.

Т-клетки могут присутствовать в любом образце, содержащем мононуклеарные клетки. Образец может быть выделен из периферической крови или спинномозговой жидкости больного PC или из синовиальной жидкости больного РА. Т-клетки больных другими аутоиммунными заболеваниями можно аналогичным образом выделить из периферической крови и/или тканей, имеющих отношение к заболеванию. Можно обогатить образец мононуклеарными клетками путем использования методик с применением центрифугирования, известных специалистам в данной области, включая, но без ограничения перечисленным, градиенты Ficoll®. Образец может быть также обогащен Т-клетками при использовании положительной селекции, отрицательной селекции или их комбинации с целью экспрессии продуктов генов Т-клеток.

Продукт гена для идентификации или отрицательной селекции активированных Т-клеток может представлять собой клеточный поверхностный маркер или цитокин или их комбинацию. Клеточные поверхностные маркеры для идентификации активированных Т-клеток включают, но без ограничения перечисленным, CD69, CD4, CD8, CD25, HLA-DR, CD28 и CD134. CD69 представляет собой ранний маркер активации, обнаруженный на В- и Т-лимфоцитах, NK-клетках (натуральных киллерах) и гранулоцитах. CD25 представляет собой рецептор IL-2 и является маркером для активированных Т-клеток и В-клеток. CD4 представляет собой сорецептор ТкР и является маркером для тимоцитов, Т-клеток Т_H1- и Т_H2-типа, моноцитов и макрофагов. CD8 также представляет собой сорецептор ТкР и является маркером для цитотоксических Т-клеток. CD134 экспрессируется только в активированных Т-клетках CD4⁺.

Клеточные поверхностные маркеры для отрицательной селекции активированных Т-клеток включают, но без ограничения перечисленным, CD36, CD40 и CD44. CD28 действует как стимуляторный путь активации Т-клеток, независимый от пути Т-клеточного рецептора, и экспрессируется на клетках CD4⁺ и CD8⁺. CD36 представляет собой мембранный гликопротеин и является маркером для тромбоцитов, моноцитов и эндотелиальных клеток. CD40 является маркером для В-клеток, макрофагов и дендритных клеток. CD44 является маркером для макрофагов и других фагоцитирующих клеток. Подтипы Т-клеток могут быть выделены с использованием положительной селекции, отрицательной селекции или их комбинации для экспрессии продуктов клеточной поверхности генов хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток (например, CD4 относительно CD8).

Цитокины для идентификации активированных Т-клеток, соответствующих настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, цитокины, продуцируемые Т-клетками Т_H1-типа (ответ, опосредованный клетками) и Т-клетками Т_H2-типа (ответ антител). Цитокины для идентификации активированных Т-клеток Т_H1-типа включают, но без ограничения перечисленным IL-2, тканевой фактор некроза опухоли (TNFα), гамма-интерферон (IFN-γ). Цитокины для идентификации активированных Т-клеток Т_H2-типа включают, но без ограничения перечисленным, IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13. Подтипы Т-клеток также могут быть выделены при использовании положительной, селекции, отрицательной селекции или их комбинации для экспрессии продуктов цитокиновых генов хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток (например, γ-IFN относительно IL-4).

Активированная Т-клетка Т_H1-типа, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, может быть выделена посредством идентификации клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, CD25, IL-2, INF-γ TFNα или их комбинацию. Активированная Т-клетка Т_H1-типа, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, может быть также выделена путем идентификации клеток, которые экспрессируют CD69 и CD4 вместе с IFN-γ или TFNα. Активированная Т-клетка Т_H2-типа, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, может быть выделена путем идентификации клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или их комбинацию. Комбинация активированной Т-клетки Т_H1-типа и Т-клетки Т_H2-типа, специфичных в отношении представляющего интерес антигена, может быть выделена путем идентификации клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNγ, TFNα или их комбинацию, и клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или их комбинацию.

Продукты генов, используемые для положительной или отрицательной селекции активированных Т-клеток, соответствующих настоящему изобретению, можно идентифицировать с помощью методик иммуноселекции, известных специалистам в данной области, в которых используют антитела, включая, но без ограничения, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS), магнитный клеточный сортинг, пэннинг и хроматографию. Иммуноселекцию двух или более маркеров на активированных Т-клетках можно осуществить в одну или более стадий, причем на каждой стадии проводится положительная или отрицательная селекция по одному или более маркеров. Когда иммуноселекцию двух или более маркеров проводят в одну стадию при использовании FACS, два или больше различных антител могут быть помечены различными флуорофорами.

Магнитный клеточный сортинг осуществляют при использовании суперпарамагнитных микрочастиц, состоящих из оксида железа и полисахаридного покрытия. Предпочтительно микрочастицы могут быть приблизительно 50 нм в диаметре и иметь объем, составляющий примерно одну миллионную часть от типичной клетки млекопитающего. Предпочтительно, когда микрочастицы достаточно маленькие для того, чтобы оставаться в коллоидной суспензии, которая обеспечивает быстрое эффективное связывание с антигенами клеточной поверхности. Предпочтительно, когда микрочастицы не нарушают процесс проточной цитометрии и являются биоразрушаемыми, а также оказывают пренебрежимо маленький эффект на клеточные функции. Связывание антитела с микрочастицами может быть прямым и непрямым посредством второго антитела к лиганду, такому как флуоресцеин.

Антитело может быть антителом классов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE или их фрагментами и производными, включая Fab, F(ab')₂, Fd, и одноцепочечными антителами, диантителами, биспецифическими антителами, бифункциональными антителами и их производными. Антитело может быть моноклональным антителом, поликлональным антителом, аффинно-очищенным антителом или их смесями, которые проявляют достаточную специфичность связывания с эпитопом продукта гена, специфичного для активированных Т-клеток, или полученных из них последовательностей. Антитело может быть химерным антителом.

Антитело может быть дериватизировано путем присоединения одной или более химических, пептидных или полипептидных структур, известных в области техники, которые позволяют идентифицировать и/или отбирать активированную Т-клетку, с которой связано антитело. Антитело может быть конъюгировано с химической молекулой, такой как флуоресцентный краситель. Активированная Т-клетка, связанная с антителом с флуоресцентной метой, может быть выделена с использованием методик, включающих, но без ограничения перечисленным, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS). Антитело может быть также конъюгировано с магнитной частицей, такой как парамагнитная микрочастица (Miltenyi Biotec, Germany). Активированную Т-клетку, связанную с антителом с магнитной меткой, можно выделить при использовании методик, включающих, но без ограничения перечисленным, магнитный клеточный сортинг.

Для продуктов генов, экспрессирующихся на клеточной поверхности, антитело может непосредственно связываться с продуктом гена и может быть использовано для селекции клеток. Для продуктов генов, экспрессирующихся в низких концентрациях на клеточной поверхности, для селекции клеток можно использовать магнитофлуоресцентные липосомы (см. статью Scheffold, et al. Nature Med 6: 107-110, 2000). При низких уровнях экспрессии обычные антитела с флуоресцентной меткой могут быть недостаточно чувствительными для детекции присутствия продукта гена, экспрессирующегося на клеточной поверхности. Липосомы, содержащие флуорофор, могут быть конъюгированы с антителами с представляющей интерес специфичностью, обеспечивая таким образом возможность детекции продукта гена, экспрессирующегося на клеточной поверхности.

Для внутриклеточных продуктов гена, таких как цитокины, антитело может быть использовано после нарушения проницаемости клеток. Альтернативно, чтобы избежать гибели клеток при нарушении проницаемости, внутриклеточный продукт гена, если он конечном счете секретируется клеткой, может быть определен, поскольку он секретируется через клеточную мембрану, с помощью "захватывающего" антитела на клеточной поверхности. Захватывающее антитело может быть двойным антителом, которое является специфичным в отношении двух различных антигенов: (i) секретируемого продукта гена, представляющего интерес, и (ii) белка клеточной поверхности. Белок клеточной поверхности может быть любым поверхностным маркером, находящемся на Т-клетках, в частности, и лимфоцитах, в общем (например, CD45). Захватывающее антитело может сначала связываться с белком клеточной поверхности, а затем с внутриклеточным продуктом гена, представляющим интерес, поскольку он секретируется через клеточную мембрану, оставляя при этом продукт гена на поверхности клетки. Меченое антитело, специфичное в отношении захваченного продукта гена, затем можно использовать для связывания с захваченным продуктом гена, который дает возможность проведения селекции активированной Т-клетки (см. статью Manz, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1921-1925, 1995, которая включена в данном контексте в виде ссылки).

Обнаружено, что некоторые формы цитокинов экспрессируются в низкой концентрации на клеточной поверхности. Например γIFN представлен в низкой концентрации на клеточной поверхности с кинетикой, подобной кинетике экспрессии внутриклеточного γIFN (см. статью Assenmacher, et al. Eur J. Immunol, 1996, 26: 263-267). Для форм цитокинов, экспрессирующихся на клеточной поверхности, можно использовать обычные антитела с флуоресцентной меткой или липосомы, содержащие флуорофоры, для детекции цитокина, представляющего интерес. Обычному специалисту в данной области будут известны другие методики обнаружения и селекции внеклеточных и внутриклеточных продуктов генов, специфичных для активированных Т-клеток.

Т-клетки, выделенные посредством настоящего изобретения, могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 90%. Т-клетки могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 95%. Т-клетки могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 98%. Т-клетки могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 99,5%.

б. Выделенные моноклональные антигенспецифические Т-клетки

Во втором аспекте настоящее изобретение направлено на Т-клетку, специфичную в отношении представляющего интерес антигена, выделенного согласно способу, соответствующему первому аспекту настоящего изобретения.

в. Выделение поликлональных антигенспецифических Т-клеток

В третьем аспекте настоящее изобретение направлено на способ выделения Т-клеток, которые являются специфичными в отношении одного или более антигенов, представляющих интерес. Образец, включающий Т-клетки, инкубируют с одним или более антигенов, которые вызывают активацию Т-клеток, специфичных в отношении одного или более антигенов. Т-клетки, специфичные в отношении одного или более антигенов, можно выделить как в первом аспекте настоящего изобретения.

Т-клетки могут иметь гетерогенный тип использования гена Vγ-Dγ-Jγ, который экспрессирует различные ТкР, каждый из которых обладает специфичностью в отношении представляющего интерес антигена. Т-клетки могут также иметь гетерогенный тип использования гена Vγ-Dγ-Jγ, который экспрессирует различные ТкР, каждый из которых обладает специфичностью в отношении больше чем одного представляющего интерес антигена. Как описано ниже, Т-клетки, включающие гетерогенный тип использования гена Vγ-Dγ-Jγ, можно использовать для получения поликлональной Т-клеточной вакцины, которая может предупреждать распространение эпитопа у вакцинированных пациентов.

г. Выделенные поликлональные антигенспецифические Т-клетки

В четвертом аспекте настоящее изобретение направлено на Т-клетки, специфичные в отношении одного или более представляющих интерес антигенов, выделенных способом, соответствующим третьему аспекту настоящего изобретения.

3. Измерение числа антигенспецифических Т-клеток

В пятом аспекте настоящее изобретение направлено на способ определения относительной частоты Т-клеток, специфичных в отношении одного или более антигенов, представляющих интерес, в образце посредством определения числа Т-клеток, выделенных способом, соответствующим первому и третьему аспектам настоящего изобретения.

4. Диагностика аутоиммунного заболевания

В шестом аспекте настоящего изобретения пациенту с аутоиммунным заболеванием может быть поставлен диагноз путем получения образца от пациента и выделения аутореактивных Т-клеток способом, соответствующим первому и третьему аспектам настоящего изобретения. Аутоиммунное заболевание можно диагностировать на основании сравнения уровня аутореактивных Т-клеток у пациента с данными для контрольной группы. Уровень аутореактивных Т-клеток можно определить согласно способу, соответствующему пятому аспекту настоящего изобретения.

5. Контроль развития аутоиммунного заболевания

В седьмом аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание можно контролировать посредством определения частоты аутореактивных Т-клетки в образце, полученном от пациента с аутоиммунным заболеванием, согласно пятому аспекту настоящего изобретения. Тяжесть симптомов аутоиммунного заболевания может коррелировать с числом аутореактивных Т-клеток. Кроме того, увеличение числа аутореактивных Т-клеток в образце можно использовать как показатель для применения способов лечения, предназначенных для снижения до минимума тяжести симптомов и/или лечения заболевания до появления симптомов.

6. Получение вакцины для лечения аутоиммунного заболевания

В восьмом аспекте настоящего изобретения может быть получена композиция для лечения аутоиммунного заболевания посредством инактивации аутореактивных Т-клеток, которые были выделены (и необязательно размножены в культуре, как описано в данном контексте) способом, соответствующим первому и третьему аспектам настоящего изобретения. Аутореактивные Т-клетки можно инактивировать с помощью ряда методик, известных специалистам в области техники, включая, но без ограничения перечисленным, химическую инактивацию или облучение. Аутореактивные Т-клетки можно консервировать как до, так и после инактивации с использованием ряда методик, известных специалистам в области техники, включая, но без ограничения перечисленным, криоконсервацию. Как описано ниже, композиция может быть использована как вакцина для истощения аутореактивных Т-клеток у аутоиммунных пациентов.

Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, которую можно получить при использовании способов, хорошо известных в области техники. Фармацевтические композиции, используемые в качестве терапевтических препаратов для предклинического и клинического применения при лечении заболевания или нарушений, могут быть получены специалистами с использованием принятых принципов диагностики и терапии. Такие принципы известны в области техники и приведены, например, в монографии под ред. Braunwald et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 11 изд., издательство McGraw-Hill, Нью-Йорк, N.Y. (1987), которое введено в данном контексте в виде ссылки. Фармацевтическая композиция может быть введена животному, у которого могут проявляться положительные эффекты композиции. Животные, получающие фармацевтическую композицию, могут быть человеком или другими млекопитающими.

а. Вакцина

В девятом аспекте настоящее изобретение обращено на композицию, полученную способом, соответствующим восьмому аспекту настоящего изобретения. Композиция может представлять собой вакцину, которую можно использовать для истощения аутореактивных Т-клеток у аутоиммунных пациентов.

7. Лечение аутоиммунного заболевания

В десятом аспекте аутоиммунное заболевание можно лечить у пациентов, несущих аутореактивные Т-клетки, посредством введения композиция, соответствующей девятому аспекту настоящего изобретения. Композиция может быть представлена вакциной, которая может приводить к истощению аутореактивных Т-клеток у пациента.

Вакцина может включать аутореактивные Т-клетки, содержащие гомогенные ("моноклональные") или гетерогенные ("поликлональные") типы использования гена Vγ-Dγ-Jγ. Клинические исследования показывают, что аутоиммунные пациенты, получающие вакцинацию аутологичными моноклональными Т-клетками, могут демонстрировать постепенное снижение иммунитета против миелинреактивных Т-клеток. В ряде случаев вновь появляющиеся аутореактивные Т-клетки могут происходить из различных клональных популяций, предполагая возможность того, что в миелинреактивных Т-клетках может происходить клональный сдвиг или распространение эпитопа, потенциально ассоциированные с текущим болезненным процессом. Клональный сдвиг или распространение эпитопа могут представлять собой проблему при аутоиммунных заболеваниях, опосредованных аутореактивными Т-клетками. Вакцина, содержащая поликлональные аутореактивные Т-клетки, способная истощать множество популяций аутореактивных Т-клеток, может избежать проблем с клональным сдвигом или распространением эпитопа.

Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, которую вводят любым способом, который достигает назначенной цели. Например, введение можно осуществить парентеральным, подкожным, внутривенным, внутриартериальным, внутрикожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, чрескожным, через слизистую оболочку, интрацеребральным, интратекальным или интравентрикулярным путями. Альтернативно или одновременно ведение можно осуществить пероральным способом. Фармацевтические композиции можно ввести парентерально посредством болюсной инъекции или путем постепенной инфузии в течение времени.

Вводимая доза может зависеть от возраста, пола, состояния здоровья и массы тела реципиента, вида сопутствующего лечения, если таковое проводят, частоты лечения и природы требующегося эффекта. Интервалы доз для введения фармацевтических композиций могут быть достаточно большими, чтобы получить необходимый эффект, при котором, например, достигается истощение аутореактивных Т-клеток, что измеряют согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, и аутоиммунное заболевание в существенной мере предупреждается, супрессируется или лечится. Дозы не могут быть настолько большими, чтобы вызывать вредные побочные эффекты, такие как нежелательные перекрестные реакции, генерализованную иммуносупрессию, анафилактические реакции и т.п.

Фармацевтические композиции могут, кроме того, включать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие наполнители и вспомогательные компоненты, которые могут облегчать обработку активных композиций с получением препаратов, которые могут быть использованы фармацевтически. Дополнительные компоненты для фармацевтических композиций могут включать введение адъюванта, такого как квасцы, хитозан или другие адъюванты, известные в области техники (см., например, статьи Warren et al., Ann. Rev. Immunol. 4: 369-388 (1986); Chedid, L., Feder. Proc. 45: 2531-2560 (1986), которые включены в данном контексте в виде ссылки). Фармацевтические композиции могут также далее включать липосомы для улучшения доставки или биоактивности при использовании способов и соединений, известных в области техники.

Подходящие препараты для парентерального введения включают водные растворы инактивированных Т-клеток, например водорастворимые соли в водном растворе. Кроме того, могут применяться масляные суспензии, включающие инактивированные аутореактивные Т-клетки. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные кислоты, например кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные инъекционные суспензии могут включать субстанции, которые повышают вязкость суспензии, например натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также включать стабилизаторы.

Инактивированные аутореактивные Т-клетки получены с использованием принятых фармацевтически приемлемых парентеральных носителей для инъекционного введения. Данные носители могут быть нетоксичными и терапевтическими, и ряд препаратов приведен в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (supra). Неограничивающими примерами наполнителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и сбалансированный солевой раствор Хенка. Фармацевтические композиции могут также включать минорные количества дополнительных компонентов, таких как субстанции, которые поддерживают изотоничность, физиологическое значение рН и стабильность.

Инактивированные аутореактивные Т-клетки можно приготовить с общими клеточными концентрациями, включающими от приблизительно 5х10² клеток/мл до приблизительно 1×10⁹ клеток/мл. Предпочтительные дозы инактивированных аутореактивных Т-клеток для применения с целью предупреждения, супрессии или лечения аутоиммунного заболевания могут лежать в интервале от приблизительно 2×10⁶ клеток до приблизительно 9×10⁷ клеток.

8. Определение репертуара ТкР

В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение обращено на способ определения репертуара нуклеиновых кислот, кодирующих один или более Т-клеточных рецепторов, или их частей у аутоиммунного пациента посредством амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих один или более Т-клеточных рецепторов из Т-клеток, выделенных согласно первому и третьему аспектам настоящего изобретения, где указанную амплификацию проводят при использовании пары праймеров. Первый праймер из пары праймеров может представлять собой олигонуклеотид длиной приблизительно 15-30 нуклеотидов, который гибридизуется с нуклеиновой кислотой, включающей вариабельный участок гена ТкР. Второй праймер из пары праймеров может представлять собой олигонуклеотид длиной приблизительно 15-30 нуклеотидов, который гибридизуется с нуклеиновой кислотой, включающей константный участок гена ТкР. Пару праймеров можно использовать для амплификации нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с участком Vγ-Dγ-Jγ гена ТкР.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие один или более Т-клеточных рецепторов из Т-клеток (Последовательность-мишень), или их фрагменты можно амплифицировать из образца с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя любую конкретную методику ПЦР или оборудование, известное в области техники. Например, ПЦР-амплификация может соответствовать процедуре, в которой готовят реакционную смесь, включающую следующие ингредиенты: 5 мкл 10 × буфер для ПЦР II (100 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 500 мМ KCl), 3 мкл 25 мМ MgCl₂, 1 мкл 10 мМ смеси дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов), 0,3 мкл Taq-полимеразы (5 ед./мкл) (AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, Norwalk, Conn.), 30 пмоль первого праймера, 30 пмоль второго праймера и 1 мкл образца ДНК. Полимераза может быть стабильной при температурах по меньшей мере 95°С, обладать процессивностью 50-60 и иметь скорость удлинения больше, чем 50 нуклеотидов/минуту.

Реакцию ПЦР проводят при профиле амплификации 1 мин при 95°С (денатурация), 20 с. При 56°С (отжиг) и 40 с при 72°С (удлинение) в целом из 40 циклов. До начала первого цикла реакционную смесь можно подвергнуть исходной денатурации в течение приблизительно от 5 мин до 15 мин. Аналогично после завершения последнего цикла реакционную смесь можно подвергнуть конечному удлинению в течение приблизительно от 5 мин. до 10 мин. Некоторые реакции ПЦР могут работать только от 15 до 20 или так много, как 50 циклов. В зависимости от специфической реакции ПЦР на каждой стадии профиля амплификации могут быть использованы более длинные или более короткие периоды инкубирования и более высокие или более низкие температуры.

Образец, содержащий последовательность-мишень, может представлять собой нуклеиновую кислоту, такую как геномная ДНК, кДНК, ДНК, ранее амплифицированная посредством ПЦР, или любая другая форма ДНК. Образец может быть выделен, непосредственно или опосредованно, из любой ткани животного или человека, содержащей Т-клетки, такие как мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК). Геномная ДНК может быть выделена непосредственно из ткани, содержащей Т-клетки. кДНК может быть выделена опосредованно путем обратной транскрипции мРНК, непосредственно выделенной из ткани, содержащей Т-клетки.

Возможность детекции последовательности-мишени можно увеличить выделением образца ДНК опосредованно путем амплификации геномной ДНК, кДНК или любой другой формы ДНК с помощью двухстадийной реакции ПЦР. Например, первую реакцию ПЦР-амплификации можно провести для амплификации предварительного фрагмента, который больше чем и содержит фрагмент, с которым первый и второй праймеры способны селективно связываться на противоположных нитях. Затем можно провести вторую реакцию ПЦР-амплификации при использовании предварительного фрагмента в качестве матрицы с первым и вторым праймерами для амплификации фрагмента, включающего последовательность-мишень. Если либо первый, либо второй праймер используют в первой реакции ПЦР для амплификации предварительного фрагмента, вторая реакция ПЦР является полугнездовой. Если ни первый, ни второй праймер не используют в первой реакции ПЦР для амплификации предварительного фрагмента, вторая реакция ПЦР является "гнездовой".

В примере двухстадийной реакции ПЦР одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих один или более Т-клеточных рецепторов из Т-клеток, можно амплифицировать проведением первой реакции ПЦР с использованием первого предварительного праймера, который отжигают с участком Vβ гена ТкР, и второго предварительного праймера, который отжигают с участком Сβ гена ТкР, которая амплифицирует предварительный фрагмент, расположенный от участка Vβ через соединение Vβ-Dβ-Jβ до участка Сβ, с последующей второй реакций ПЦР, которая может быть гнездовой или полугнездовой. В свете настоящего описания компетентный специалист сможет выбрать соответствующие праймеры и условия реакции для ПЦР-амплификации последовательности-мишени.

После амплификации последовательности-мишени амплифицированный продукт можно определить с помощью ряда процедур. Например, аликвоту продукта амплификации можно нагрузить на гель для электрофореза, к которому подведено электрическое поле, для разделения молекул ДНК по размеру. В другом способе аликвоту продукта амплификации можно нагрузить на гель, окрашенный SYBR зеленым, бромидом этидия или другой молекулой, которая будет связывать ДНК и эмитировать определяемый сигнал. Высушенный гель может содержать меченый олигонуклеотид, гибридизующиеся с последовательностью-мишенью, с которого можно сделать авторадиограмму путем экспонирования геля на пленке.

Следующие примеры включены, чтобы продемонстрировать предпочтительные варианты осуществления изобретения. Специалистам в данной области следует принять во внимание, что способы, описанные в примерах, которые представляют способы, раскрытые автором изобретения, как хорошо работающие при практической реализации изобретения, таким образом, можно считать составляющими предпочтительные варианты его практической реализации. Однако компетентные специалисты в данной области в свете настоящего описания понимают, можно сделать много изменений в конкретных вариантах осуществления, которые описаны, и тем не менее получить подобный или аналогичный результат, не выходя за рамки сущности и объема изобретения.

Пример 1

Выделение миелинреактивных Т-клеток для Т-клеточной вакцинации

1. Получение МКПК и первичная стимуляция

Образцы свежей крови, полученные от больных PC и пациентов контрольной группы, обрабатывают в течение 2 часов после сбора. Альтернативно мононуклеарные клетки можно получить из спинномозговой жидкости (МКСМЖ) больных PC. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяют из цельной крови стандартным способом разделения в градиенте Фиколла. В частности, гепаринизированную кровь разводят сбалансированным солевым раствором Хенка (ССРХ) (1:1 кровь/ССРХ), а затем медленно наслаивают на раствор Ficoll-hypaque в пробирке для центрифугирования и центрифугируют в течение 20 мин со скоростью 1800 об/мин при температуре 18-25°С без перерыва. Затем МКПК промывают, добавляя избыток ССРХ, и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 10 мин при температуре 18-25°С. Очищенные МКПК промывают три раза в среде RPMI 1640 с помощью центрифугирования, а затем ресуспендируют в среде AIM V medium (Gibco, Grand Island, N.Y.). Подсчитывают число клеток и клетки помещают в 96-луночные планшеты для культивирования с U-формой дна с густотой 200000 клеток/лунку. Все планшеты метят номером пациента и инициалами пациента. Клетки инкубируют при температуре 37°С в присутствии перечисленных в таблице 1 синтетических пептидов, соответствующих известным иммунодоминантным участкам трех миелиновых белков, миелинового основного белка (МОБ), белка протеолипида (ПЛБ) и гликопротеина миелина олигодендроцитов (ГМО) в концентрации 20 мкг/мл. Планшеты помещают в термостат с СО₂ при 37°С и ежедневно визуально проверяют. Клетки культивируют в течение 7-10 суток без изменения среды для культивирования для селективного роста антигенспецифических Т-клеток.

2. Идентификация и селекция антигенспецифических Т-клеток

Затем вышеописанные клетки отбирают по экспрессии продуктов гена, указывающих на активированные Т-клетки. См. Раздел 2(а) выше. Реагент, захватывающий цитокин (Miltenyi® Biotec) (как описано выше), используют для детекции внутриклеточного цитокина γИФН или ФНТα, когда они в конечном счете выводятся из клетки. Вкратце, реагент, захватывающий цитокин (как правило, биспецифическое антитело, которое связывается как с активированной Т-клеткой, так и секретируемым цитокином), инкубируют сначала с клетками при температуре 4-8°С для связывания с молекулой CD45 на клеточных поверхностях или другими поверхностными маркерами активированных Т-клеток, такими как CD69. Затем клетки со связанным реагентом, захватывающим цитокин, инкубируют при 37°С в течение 45 мин, чтобы дать возможность γИФН или ФНТα в клетке также связаться с реагентом, захватывающим цитокин, поскольку цитокин секретируется из клетки во время инкубационного периода. γИФН или ФНТα теперь связаны с клеточной поверхностью посредством реагента, захватывающего цитокин, который затем определяют при использовании антитела, специфичного в отношении представляющего интерес цитокина, конъюгированного с флуорохромом РЕ.

Молекулы клеточной поверхности CD4 и CD69 определяют, используя антитела, конъюгированные с различными флуорохромами. Популяцию клеток CD4⁺ сначала отбирают с помощью дискриминационного окна в клеточном сортере, а затем внутри данной популяции "дважды положительно" (CD69 и ИФНγ или CD69 и ФНТα) окрашенные клетки отделяют с помощью FACS и асептически собирают.

Выделенные миелинреактивные Т-клетки затем непосредственно размножают посредством стимуляции с помощью rИЛ-2 (рекомбинантного ИЛ-2), ФГА (фитогемагглютинина), анти-CD3 или другого основного Т-клеточного митогена в присутствии облученных аутологичных МКПК в течение 7-10 дней. Миелинреактивные Т-клеточные линии размножают в культуре до тех пор, пока общее число клеток не достигнет приблизительно 20 миллионов.

Пример 2

Диагностика PC

У пациента берут от 2 до 100 мл крови и добавляют один или более синтетических пептидов непосредственно в цельную кровь для примирования или стимуляции Т-лимфоцитов. Пептиды соответствуют известным иммунодоминантным участкам трех миелиновых белков, миелинового основного белка (МОБ), белка протеолипида (ПЛБ) и гликопротеина миелина олигодендроцитов (ГМО). Кровь инкубируют с пептидами в течение 1-7 дней для активации миелинспецифических Т-клеток. В конце данного периода примирования антигеном клетки повторно обрабатывают антигенами в анализе быстрой повторной стимуляции.

Т-клетки, активированные миелиновым пептидом, определяют посредством нарушения клеточной мембраны раствором детергента, промывания клеток и последующего инкубирования с одним или более окрашивающих антител с целью детекции молекул CD4 или CD69 на клеточной поверхности или ИФНγ либо ФНТα внутриклеточно. Окрашивающие антитела конъюгированы с различными флуорохромами, поэтому они флуоресцируют при разных длинах волн при возбуждении лазером с длиной волны 488 нанометров при анализе с использованием FASC. Популяцию Т-клеток CD4⁺ отбирают сначала с использованием клеток CD4⁺ для анализа с помощью дискриминационного окна в клеточном сортере, а затем внутри данной популяции идентифицируют клетки, которые иммунореактивны с обоими антителами (CD69 и γИФН или CD69 и ФНТα). В аналогичном исследовании показано, что данная популяция "дважды положительных" миелинреактивных Т-клеток существенно увеличивается у пациентов с рассеянным склерозом (PC) по сравнению с контрольной группой здоровых субъектов (см. фигуру 1, пациент с PC, фигуру 2, контрольная группа здоровых субъектов). При использовании данного способа число миелинреактивных Т-клеток, циркулирующих в крови пациента, можно определить до, во время и после лечения с целью установления эффекта терапии PC на популяцию аутореактивных Т-клеток. Конечный результат можно определить либо как долю дважды положительных окрашенных клеток, либо как абсолютное число дважды положительных окрашенных клеток.

Пример 3

Диагноз PC с использованием липосом, конъюгированных с антителом

Цельную кровь получают от пациента и стимулируют одним или более синтетических пептидов, как описано в примере 2. Кровь инкубируют с пептидами в течение 3-16 ч для активации миелинспецифических Т-клеток. В конце данного периода примирования антигеном клетки можно повторно обработать антигенами в анализе быстрой повторной стимуляции перед окрашиванием магнитофлуоресцентыми липосомами, конъюгированными с антителами против ИФНγ, ФНТα или их комбинацией. Клетки окрашивают также антителом к CD4 и/или CD69. Окрашенные миелинреактивные Т-клетки определяют, как описано в примере 2.

Пример 4

Определение клонального репертуара ТкР

Клональный репертуар Т-клеточных рецепторов (ТкР), представленный в клеточной популяции, можно проанализировать путем выделения дважды положительно окрашенной популяции клеток посредством клеточного сортинга, как описано в примере 2 и примере 3. ДНК экстрагируют из выделенных клеток и используют для проведения количественных анализов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении 25 известных семейств генов вариабельной бета-цепи (Vβ). Данная процедура дает информацию о распространении использования гена Vβ ТкР и показывает клональность патогенных популяций Т-клеток. Данный способ может быть также использован для определения, имеется ли клональный или эпитопный сдвиг популяции миелинреактивных Т-клеток у больного PC.

Пример 5

Истощение миелинреактивных Т-клеток посредством Т-клеточной вакцинации

Пациентам с рецидивирующим-ремиттирующим (РР)-РС и вторичным прогрессирующим (ВП)-РС делают три подкожные инъекции облученных аутологичных клонов миелинреактивных Т-клеток, выделенных путем прямого размножения, с тремя дополнительными инъекциями через 4, 12 и 20 недель. У пациентов проводят мониторинг изменений предшествующей частоты миелинреактивных Т-клеток, уровня рецидивов, значения расширенного статуса нетрудоспособности (EDSS) и активностей поражения по данным ЯМР-томографии за период 24 месяца. Результаты сравнивают с величинами до вакцинации попарно. Кроме того, включают клинические данные, полученные в группе использования плацебо при РР-РС в клиническом испытании бета-интерферона-1a (см. статью Jacobs et al., 1996) и при ВП-РС в недавнем исследовании β-ИФН-1b (см. European Study Group, Lancet, 352: 1491-1497 (1998)) для представления данных по естественному течению PC для сравнения. Частота Т-клеток либо не определяется, либо существенно понижена после вакцинации к неделе 20. Результаты подтверждают истощение миелинреактивных Т-клеток путем Т-клеточной вакцинации больных PC.

Пример 6

Вакцинация больных PC с использованием аутологичных миелинреактивных Т-клеток

Протокол вакцинации близок к тому, который используют в предшествующих клинических исследованиях (см. статьи Zhang et al., 1993, Medaer et al., 1995). Вкратце, клоны миелинреактивных Т-клеток, полученные согласно примеру 1, активируют фитогемаглютинином (ФГА) (4 мкг/мл) в присутствии облученных МКПК как источника вспомогательных клеток. Затем клетки культивируют в течение 10 суток в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием сыворотки АВ человека и 100 ед./мл rИЛ-2. Активированные миелинреактивные Т-клетки затем трижды промывают стерильным солевым раствором для удаления остаточного ФГА, rИЛ-2 и клеточного дебриса и в заключение ресуспендируют в 2 мл солевого раствора. После облучения (10000 рад, источник ¹³⁷Се) клетки вводят подкожной инъекцией в две руки (1 мл/руку). Число Т-клеток, используемых для вакцинации, лежит в интервале от 40×10⁶ до 80×10⁶ клеток/инъекцию, и выбирается путем экстраполяции доз Т-клеток, эффективных для экспериментальных животных, на основе относительных площадей поверхности кожи (см. статью Ben-Nun et al., 1981). Каждому пациенту делают две подкожные инъекции с последующими повторными инъекциями на 4, 12 и 20 неделе.

Затем пациентов наблюдают в период до начала установленного прогрессирования нетрудоспособности, EDSS, уровня рецидивов и активностей поражения по данным ЯМР-томографии. Результаты сравнивают с курсом собственного предшествующего лечения пациента, а также с группами, получавшими плацебо, в двух недавних клинических испытаниях, проведенных на пациентах с РР-РС и ВП-РС, которые служат для оценки естественного течения PC (см. статьи Jacobs et al., 1996, European Study Group, 1998). Период до прогрессирования определяют по повышению по меньшей мере на 1,0 по EDSS (см. статью Poser et al., 1983), существующему по меньшей мере в течение 2 месяцев. Обострения во время исследования определяют по появлению новых неврологических симптомов или усугублению ранее существовавших неврологических симптомов в течение по меньшей мере 48 часов, сопровождающихся объективным изменением при неврологическом исследовании (ухудшение по меньшей мере на 0,5 пункта по EDSS). Пациенты получают инструкцию сообщать о событиях, происходящих между входящими в схему лечения регулярными посещениями, и проходят обследование у невропатолога, если предполагают обострение симптомов. Оценки безопасности включают неблагоприятные события, основные показатели состояния организма и исследования физического состояния при регулярных посещениях. Разницы в клинических изменениях при исследовании пациентов до и после Т-клеточной вакцинации анализируют с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона.

Пример 7

Изменение клинического течения PC после вакцинации

Пациентам делают Т-клеточные вакцинации, полученные согласно примеру 1 при отсутствии вредных эффектов. Среднее значение EDSS снижается у пациентов с РР-РС за период 24 месяца после вакцинации. Для сравнения имеется повышение среднего значения EDSS на 0,61 при естественном течении РР-РС (n=56) за такой же период наблюдения, как показано в исследовании, проведенном при использовании данных испытания β-ИФН-1a (см. статью Jacobs et al., 1996). Кроме того, доля больных как с неизмененным, так и с улучшенным значением EDSS выше, чем таковая при естественном течении PC. Показатели немногих, если такие имеются, больных в группе РР-РС, проходящей лечение, выходят за значение EDSS 2,0 в течение 24 месяцев по сравнению с 18% больных с естественным течением PC.

В группе ВП-РС среднее значение EDSS растет медленнее за период 24 месяца по сравнению с +0,6, зарегистрированным при естественном течении ВП-РС (см. European Study Group, Lancet 1998; 352:1491-1497). Более того, оценка времени установленного прогрессирования с использованием способа Каплана-Мейера показывает значительную задержку по сравнению с естественным течением болезни у пациентов с PC (прогрессирование 20% в течение 12 месяцев для РР-РС и 9 месяцев для ВП-РС) (см. статьи Jacobs et al., Ann. Neurol, 1996; 39:285-294, European Study Group, 1998).

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения аутологичных Т-клеточных вакцин. Аутологичная Т-клеточная вакцина для лечения пациентов с рассеянным склерозом включает ослабленные Т-клетки, которые являются реактивными в отношении одного или нескольких эпитопов, причем SEQ ID NOS: 1-6 содержат эти эпитопы. Изобретение предназначено для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз или ревматоидный артрит с использованием аутологичных Т-клеточных вакцин. Кроме того, изобретение позволяет диагностировать заболевания, ассоциированные с Т-клетками. Преимущество изобретения заключается в том, что его можно использовать для получения Т-клеточных вакцин с гетерогенным типом использования гена VR-Dp-JR, чтобы принять во внимание клональный сдвиг аутореактивных Т-клеток. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Аутологическая Т-клеточная вакцина для лечения пациентов с рассеянным склерозом, включающая ослабленные Т-клетки, которые являются реактивными в отношении одного или несколько эпитопов, причем SEQ ID NOS: 1-6 содержат эти эпитопы.2. Вакцина по п.1, где SEQ ID NOS: 1-6 содержит только эпитопы.3. Вакцина по п.1, где вакцина по существу содержит Т-клетки, которые являются реактивными по отношению к SEQ ID NOS: 1-6.4. Способ получения вакцины по п.1 для лечения рассеянного склероза, включающий:

а) получение образца, содержащего Т-клетки, выделенные из пациента, который нуждается в лечении вакциной;

(б) инкубирование образца, содержащего Т-клетки, в присутствии одного или нескольких антигенов, связанных с рассеянным склерозом, или их производных;

(в) стимулирование клеток (б) митогеном и

(г) инактивацию клеток (в),

где один или несколько антигенов, связанных с рассеянным склерозом, содержат SEQ ID NOS: 1-6.