СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/12 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к иммунотропному лечению тяжелых заболеваний, в основе которых лежат антиген-индуцированные, патогенные Т-клеточные реакции, приводящие к повреждению собственных тканей организма (например, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, аллергические заболевания).

Стандартное лечение тяжелых аутоиммунных и аллергических заболеваний базируется на применении гормонов, цитостатиков и других препаратов, обладающих неспецифической иммуносупрессорной активностью. Такое лечение снижает иммунитет в целом и ассоциируется с высоким риском развития серьезных побочных эффектов. Очевидно то, что избирательная элиминация патогенных лимфоцитов из организма должна лежать в основе патогенетического лечения этих заболеваний. Один из способов достижения этой цели базируется на возможности стимуляции у больного антиидиотипического иммунного ответа, направленного на вариабельные фрагменты (идиотипы) антигенных рецепторов патогенных лимфоцитов [5]. В частности, показано, что вакцинация миелин-реактивными Т-клетками животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом может приводить к остановке развития демиелинизирующего процесса вследствие избирательной элиминации из организма именно тех лимфоцитов, которые ответственны за развитие аутоиммунного заболевания [3]. Представляется важным то, что этот метод лечения эксплуатирует механизм иммунной памяти и поэтому подразумевает возможность генерации длительного иммунного ответа, направленного против патогенных лимфоцитов.

В пилотных клинических исследованиях показано, что в ответ на иммунизацию аутологичными миелин-реактивнымими Т-клеточными клонами у больных рассеянным склерозом (PC) генерируются антиклонотипические CD8+ Т клетки, которые способны лизировать миелин-специфичные Т-лимфоциты [1, 2, 4, 6, 7]. Т-клеточная вакцинация также вызывает генерацию анти-клонотипических CD4+ Т клеток, которые в активированном состоянии продуцируют противовоспалительные цитокины IL-4 и IL-10 [1, 2, 4, 6, 7] и, таким образом, тормозят развитие демиелинизирующего процесса. Дополнительный вклад в инактивацию аутоиммунных Т-лимфоцитов могут вносить активируемые Т-клеточной вакцинацией антиэрготипические Т-клетки. Антиэриготипическая регуляция непосредственно не связана с идиотип-антиидиотипическим Т-клеточным взаимодействием и направлена на предотвращение чрезмерной суммарной активности Т-лимфоцитов.

Т-клеточная вакцинация имеет очевидные преимущества перед другими методами лечения заболеваний, обусловленных патогенной функциональной активностью Т-лимфоцитов. Известные методы получения Т-клеточной вакцины (WO 99/13904 С2, 25.03.1999; ЕР 0722738 А2, 24.07.1996; 1998; WO 90/11294 A1, 04.10.1990; WO 94/25063 A1, 10.11.1994; WO 95/24217 A1, 14.09.1995; WO 92/12990 А2, 06.08.1992) основаны на постоянной или периодической стимуляции лимфоцитов антигеном (например, миелином), поэтому процесс наработки вакцинальных клеток довольно длительный и дорогостоящий. Улучшение технологии получения Т-клеточных вакцин востребовано медициной и призвано обеспечить значимый прогресс в лечении целого ряда заболеваний, стандартное лечение которых, практикуемое в настоящее время, малоэффективно.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем: технология получения Т-клеточной вакцины состоит из двух последовательных этапов. Первый этап включает в себя культуральную антиген-специфическую селекцию Т-клеток больного, тогда как второй - их наращивание до необходимого количества посредством неспецифической стимуляции.

На первом этапе выделенные из периферической крови мононуклеарные клетки (МНК) больного (например, рассеянным склерозом) культивируются в концентрации 2×10⁶ в мл среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной аутологичной плазмы, 5 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 5×10^-5 М меркаптоэтанола в присутствии антигена(ов) (например, 50 мкг/мл свиного миелина) в течение 5-7 дней во влажной атмосфере с 5% СО₂. Затем антиген-реактивные бластные лимфоциты отделяются от других клеток посредством их центрифугирования на перколле (плотность 1.065 г/л). На втором этапе выделенные Т-клетки культивируются в присутствии неспецифических стимуляторов (например, 5 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) плюс 100 ед/мл рекомбинантного интерлейкина - 2) в течение 5 дней. По завершении культивирования клетки инактивируются (например, облучением в дозе 2000 рад), далее криоконсервируются стандартным путем в плазме с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и хранятся в жидком азоте до момента использования. Общее количество полученных от одного больного клеток варьирует в пределах 18-27×10⁸.

Разработанная двухэтапная технология получения Т-вакцины имеет очевидные преимущества перед методами, которые были описаны ранее. В частности, она не требует длительного культивирования клеток в присутствии антигена. Уже через 5-7 дней после культивирования с антигеном активированные, бластные, антиген-специфические Т-лимфоциты отделяются от непрореагировавших клеток с помощью градиентного центрифугирования на перколле и далее наращиваются до необходимого количества посредством их высокоэффективной неспецифической стимуляции. Важно, что такое интенсивное наращивание антиген-специфических клеток не требует добавления в культуру антигена и занимает всего 5 дней. В целом процедура получения Т-клеточной вакцины в количестве, достаточном для проведения полноценного курса иммунотерапевтического лечения, занимает 10-12 дней. Получение аналогичных количеств вакцинальных клеток методами, основанными на постоянной или периодической стимуляции Т-лимфоцитов антигеном (например, миелином), требует намного большего времени (28 дней и более). Важным представляется также то, что под удар индуцируемого поликлональной Т-клеточной вакциной антиидиотипического иммунного ответа должны попадать в первую очередь антиген-реактивные клетки, имеющие доминантное представительство в вакцине и в наибольшей степени вовлеченные в развитие патологического процесса.

Таким образом, разработанный способ получения Т-клеточной вакцины представляется наиболее эффективным и наименее дорогим, в сравнении с имеющимися аналогами.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения, представлены на примере вакцин, предназначенных для лечения рассеянного склероза, ревматоидного артрита, поллиноза, а также в экспериментах на животных, и изложены последовательно ниже.

Разработанная нами двухэтапная технология была использована для получения Т-клеточной вакцины, предназначенной для лечения рассеянного склероза (PC). Поверхностные маркеры миелин-реактивных вакцинальных клеток определяли с помощью моноклональных антител (МА) LT3 (CD3), LT4 (CD4), LT8 (CDS), LKN 16 (CD 16) («Сорбент», Москва), конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом, и МА ICO-180 (CD20) («МедБиоСпектр», Москва), CD45RO («Becton Dickinson», США), меченных фикоэритрином. Процент позитивных клеток определяли на иммуноцитометре «FACS Calibur» («Becton Dickinson») с использованием программы «CELLQuest» («Becton Dickinson»). Цитофлюориметрический маркерный анализ полученных лимфоидных популяций показал, что процентное содержание в них CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ клеток составляет 90-94%, 50-67%, 25-38%, 3-9% и 2-3% соответственно.

Содержание в них CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+ Т-клеток-памяти превышало не менее чем в 2 раза значения, исходно выявляемые в периферической крови больного.

Специфичность вакцинальных Т-лимфоцитов оценивали по их антиген-индуцированному пролиферативному ответу. Для этого 10⁵ миелин-реактивных Т клеток культивировали в течение 72 часов совместно с облученными (2000 рад) аутологичными МНК в присутствии 50 мкг/мл миелина или контрольного антигена (белок мышиной меланомы) в лунках 96-луночного круглодонного планшета (Costar, США). Клеточная пролиферация оценивалась стандарным методом по включению [³Н] тимидина. Согласно полученным данным пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на миелин превышал контрольные значения не менее чем в 2 раза.

Для оценки специфичности андиидитипического ответа 10⁵ МНК, выделенных из периферической крови вакцинированных больных рассеянным склерозом, культивировали в течение 72 часов совместно с облученными вакцинальными Т-лимфоцитами (10⁵) или с Т-клетками, специфичными к антигенам мышиной меланомы. Последние были получены по той же методике, что и миелин-реактивные Т-клетки. Было установлено, что после 4 вакцинаций пролиферативный ответ МНК больного на вакцинальные клетки в 6 раз превышал контрольные значения. Отсюда можно сделать вывод, что входящие в состав вакцины миелин-реактивные Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности рецепторные идиотипические детерминанты в количестве, достаточном для индукции эффективного антиидиотипического иммунного ответа.

Для получения антиидиотипической Т-клеточной линии МНК (2×10^-6 мл) культивировали с облученными миелин-реактивными Т-клетками (10⁶/мл). Через 7 дней в культуру вносили облученные аутологичные МНК и идиотип-несушие Т-лимфоциты и продолжали клеточное культивирование в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 (100 ед/мл) еще 7 суток. Далее прокультивированные клетки облучали (2000 рад) и оценивали их супрессорную активность в пролиферативном тесте. Для этого 10⁵ этих клеток культивировали в течение 72 ч совместно с аутологичными миелин-реактивными Т-клетками (10⁵) и с облученными МНК (10⁵) в присутствии миелина (50 мкг/мл). В результате было установлено, что антиидиотипические Т-клеточные линии, реактивные по отношению к миелин-специфичным Т-клеткам, способны на 49-52% избирательно подавлять пролиферацию последних.

Таким образом, полученная вышеописанным способом Т-клеточная вакцина по своим поверхностным характеристикам, специфичности и способности индуцировать антиидиотипический иммунный ответ полностью удовлетворяет предъявляемым требованиям.

Клинические исследования проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Ученым советом и Этическим комитетом Института клинической иммунологии СО РАМН. От каждого пациента, участвующего в исследовании, было получено информированное согласие. Иммунотерапевтическое лечение было проведено 18 больным церебро-спинальной формой PC в возрасте от 26 до 50 лет с давностью заболевания не менее 2 лет. У 4 больных имело место ремиттирующее, у 3 - прогредиентно-ремиттирующее, у 2 - первично-прогредиентное и у 9 - вторично-прогредиентное течение заболевания. Диагноз был установлен клинически и подтвержден магнитно-резонансным исследованием. Пациенты не получали иммуносупрессивную терапию, по крайней мере, в течение 6 месяцев до начала лечения. Схема иммунотерапии включала в себя 4 еженедельных подкожных Т-клеточных вакцинации и поддерживающие введения вакцины с интервалом в 2 месяца. Вакцинальная доза варьировала в пределах 2.0-4.0×10⁷ клеток.

Неврологический статус пациентов оценивался по функциональной шкале Куртцке с использованием расширенной шкалы инвалидизации (EDSS). Кроме того, проводилось электромиографическое исследование с оценкой времени центрального моторного проведения «кора - С7» и «кора - S1» в ответ на магнитную стимуляцию.

За время наблюдения (12 месяцев) у 2 из 4 больных с ремитирующим и у 2 из 3 с прогредиентно-ремиттирующим течением PC обострений заболевания зарегистрировано не было, их состояние, оцениваемое по шкале Куртцке, было стабильным. По данным электромиографического исследования у одного пациента из этой подгруппы отмечено значительное улучшение показателей центрального моторного проведения «кора - S1». У 2 пациентов с первично-прогредиентным течением заболевания состояние сохранялось стабильным на протяжении всего срока наблюдения. Только у 3 из 9 пациентов с вторично-прогредиентным течением заболевания имела место стабилизация клинических параметров, у остальных отмечено ухудшение в неврологическом статусе, связанное с прогрессией болезни. Ни одного случая осложнений применения Т-клеточной вакцинации зарегистрировано не было.

Таким образом есть основания полагать, что Т-клеточная вакцинация может быть наиболее эффективна на ранних стадиях заболевания. Вместе с тем, не исключено, что более продолжительное и интенсивное иммунотерапевтическое лечение больных PC позволит получить ощутимые результаты в лечении вторично-прогредиентной формы заболевания.

Двухэтапная технология была использована для получения Т-клеточной вакцины, предназначенной для лечения ревматоидного артрита (РА). Для получения такой вакцины МНК больного культивировали с коллагеновыми белками (10 нг/мл), полученными из суставных тканей человека (г.Москва), в течение 7 дней, после чего бластные лимфоциты отделяли от непрореагировавших клеток с помощью перколльного центрифугирования и далее наращивали их посредством неспецифической стимуляции. Полученные клетки имели поверхностные характеристики, сходные с характеристиками миелин-реактивных Т-клеток. А именно, процентное содержание в них CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ клеток составляло 93%, 62%, 30%, 5% и 2% соответственно. Содержание CD3+CD45RO+ Т-клеток памяти в 2 раза превысило исходный уровень, а содержание CD3+CD45RA+ активированных клеток в 1,2-1,3 раза. Пролиферативный ответ полученных вакцинальных клеток в присутствии коллагена превышал исходно регистрируемые значения в 2-3 раза. Анти-идиотипический пролиферативный ответ МНК больных РА, получивших 4 вакцинации в 2,4-3,7 раз, превышал контрольные показатели. В то же время пролиферативный ответ МНК вакцинированных больных на клетки, неспецифически активированные (ФГА, интерлейкином - 2) или активированные другими антигенами (меланома мыши), не претерпевал существенных изменений. Анти-идиотипические Т-клеточные линии подавляли антиген-индуцированную пролиферацию коллаген-специфических клеток на 40-53%.

Иммунотерапевтическое лечение было проведено 12 больным РА в возрасте 30-69 лет с давностью заболевания не менее 5 лет. 10 больных получали базисную терапию, включающую метатрексат (не более 10 мг/нед). Схема иммунотерапии включала 4 еженедельных вакцинации с интервалом в 1 мес. Вакцинальная доза составляла 3.0-4.0×10⁷ клеток. В процессе лечения у 3 из 12 пациентов отмечалась местная реакция на первое введение вакцины в виде очага гиперемии размером до 5 см в диаметре на месте инъекции. У 1 больной отмечалась общая реакция в виде повышения температуры тела. Все перечисленные явления были кратковременными и купировались самостоятельно.

За время наблюдения (6 месяцев) у 8 из 12 больных отмечено улучшение клинических параметров, характеризующих тяжесть заболевания. Достоверно снизились суставной индекс, счет боли, индекс припухлости и время утренней скованности. У остальных больных клиническое состояние существенно не изменилось. Заметной динамики лабораторных показателей за этот период времени отмечено не было.

Двухэтапная технология была использована для получения Т-клеточной вакцины, предназначенной для лечения такого аллергического заболевания, как поллиноз. МНК больных поллинозом культивировали с аллергеном (пыльца деревьев или пыльца сорных трав производства НИИ вакцин и сывороток, г.Ставрополь; конечная концентрация 100 PNU/мл) в течение 7 дней, после чего аллерген-активированные, бластные лимфоциты отделяли от непрореагировавших клеток с помощью перколльного центрифугирования и далее наращивали их посредством неспецифической стимуляции. Группа пролеченных пациентов состояла из 12 человек в возрастном диапазоне от 18 до 56 лет. Установлено, что после 4 еженедельных вакцинаций пролиферативный ответ МНК больного на вакцинальные клетки в 1,8-3 раза превышал контрольные значения. Поддерживающий курс лечения состоял из ежемесячных вакцинаций. В результате проведенного лечения отчетливый клинический эффект был достигнут у 7 из 12 пациентов.

Двухэтапная технология была использована для предотвращения (торможения) иммунных процессов, направленных на отторжение донорских органов и тканей. В экспериментах показано, что вакцинация мышей C57BL6 (H-2^b) активированными Т-клетками мышей (C57BL6×DBA)F1 (Н-2^b/Н-2^d) приводила к генерации супрессорных Т-лимфоцитов, ингибирующих более чем в 2 раза пролиферативный ответ интактных мышиных спленоцитов C57BL6 на аллоантигены DBA (H-2^d).

В целом, описанная технология получения Т-клеточной вакцины не ограничивается упомянутыми заболеваниями. Используя разные антигены для активации соответствующих антиген-реактивных клеток, можно получать Т-клеточные вакцины для лечения разных заболеваний, в основе которых лежат патологические антиген-индуцируемые иммунные процессы.

Источники информации

1. Correale J., Lund В., McMillan M et al. Т cell vaccination in secondary progressive multiple sclerosis. // J.Neuroimmunol. - 2000. - V.107, №2. - P.130-139.

2. Hermans G., Medaer R., Raus J., Stinissen P. Myelin reactive Т cells after Т cell vaccination in multiple scvlerosis: cytokine profile and depletion by additional immunizations. // J.Neuroimmunol. - 2000. - V.102, №1. - P.79-84.

3. Мог F., Cohen I.R. Experimental aspects of Т cell vaccination. // Clin. Exp. Rheumatol. - 1993. - Suppl.8. - P.55-57.

4. Stinissen P., Zhang J., Medaer R., et al. Vaccination with autoreactive Т cell clones in multiple sclerosis: overeiew of immunological and clinical data. // J. of Neuroscience Research. - 1996. - V.45. - P.500-511.

5. Stinissen P. and Raus J. Autoreactive Т lymphocytes in multiple sclerosis: pathogenic role and therapeutic targeting. // Acta neurol. Belg. - 1999. - V.99. - P.65-69.

6. Zang Y.C.Q., Hong J., Tejada-Simon M.V. et al. Th 2 immune regulation induced by Т cell vaccination in patients with multiple sclerosis. // Eur. J.Immunol. - 2000. - V.30. - P.908-913.

7. Zhang J., Stinissen P., Medaer R., et al. Т cell vaccination: clinical application in autoimmune diseases. // J. Mol. Med. - 1996. - V.74. - P.653-662.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в иммунологии. Мононуклеарные клетки больного культивируют в присутствии антигена, выбранного из группы миелинового белка, белков коллагена, аллергена, аллогенных клеток. Антиген-реактивные бластные Т-клетки отделяют с использованием градиентного центрифугирования на перколле. Выделенные Т-клетки наращивают посредством неспецифической митогенной стимуляции. Использование изобретения позволяет получать Т-клеточную вакцину для лечения иммунологических расстройств, обусловленных наличием антигена, выбранного из группы миелинового белка, белков коллагена, аллергена, аллогенных клеток за 10-12 дней. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ получения Т-клеточной вакцины, предназначенной для лечения иммунологического расстройства, отличающийся тем, что включает в себя два этапа: на первом этапе мононуклеарные клетки больного культивируют в присутствии антигена, выбранного из группы миелиновых белков, или белков коллагена, или аллергенов, или аллогенных клеток, после чего антиген-реактивные бластные Т-клетки отделяют от непрореагировавших клеток с помощью градиентного центрифугирования на переколле; на втором этапе выделенные Т-клетки наращивают посредством их неспецифической митогенной стимуляции, облучают, затем криоконсервируют.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на первом этапе для культивирования с Т-клетками используют миелиновые белки, и такая вакцина применима для лечения рассеянного склероза.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на первом этапе для культивирования с Т-клетками используют коллагеновые белки, и такая вакцина применима для лечения ревматоидного артрита.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что на первом этапе для культивирования с Т-клетками используют в качестве аллергена пыльцу растений, и такая вакцина применима для лечения аллергического заболевания, представленного поллинозом.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что на первом этапе для культивирования с Т-клетками используют аллогенные клетки, и такая вакцина применима для профилактики отторжения донорского органа или ткани.