Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к лечению, диагностике и/или предотвращению рассеянного склероза с использованием иммунодоминантного белка или пептида. В частности, настоящее изобретение относится к области антигенспецифичной иммунотерапии, такой как индукция толерантности.
Уровень техники изобретения
Рассеянный склероз (РС) представляет собой разрушительное аутоиммунное воспалительное заболевание, в основном поражающее молодых людей. РС является классическим примером органоспецифичного аутоиммунного заболевания (АИЗ), поскольку аутоиммунный ответ нацелен только на центральную нервную систему (ЦНС), состоящую из головного и спинного мозга. Органоспецифичное АИЗ означает, что иммунная система пациента повреждает конкретную ткань или тип клеток аутореактивными Т-клетками и/или антителами.
РС преимущественно поражает молодых людей в возрасте от 20 до 40 лет, но у детей и пожилых людей также может развиться РС. Заболевание у женщин встречается примерно в 2-3 раза чаще, чем у мужчин. Клинически РС обычно проявляется временными проблемами со зрением (острый неврит зрительного нерва), ощущениями, двигательными и автономными функциями, но может привести к широкому спектру неврологических симптомов.
Во время первого проявления, когда дифференциальный диагноз не был поставлен, заболевание называется клинически изолированным синдромом (КИС) при условии, что данные исследования спинномозговой жидкости (СМЖ) и результаты магнитно-резонансной томографии (МРТ) соответствуют диагнозу. МРТ выявляет поражения в местах, типичных для рассеянного склероза, то есть юкстакортикальном очаге, перивентрикулярном очаге, в стволе головного или спинного мозга. Если соблюдаются определенные критерии, которые можно обобщить как распространение в пространстве (более одного поражения или клинического симптома/признака) и во времени (более одного события), тогда можно поставить диагноз рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (РРРС). Особый сценарий представляет собой случайное обнаружение при помощи МРТ поражений, совместимых с РС без клинических симптомов. Это состояние получило название радиологически изолированный синдром (РИС) и может рассматриваться как предварительная стадия КИС и РРРС. Более 80% пациентов страдают от одного из них, и у большинства пациентов позже развивается так называемый вторично-прогрессирующий РС (ВПРС). В это время рецидивы/обострения становятся менее частыми или полностью прекращаются, а неврологическая инвалидность неуклонно увеличивается либо между рецидивами, либо без них.
Особой формой РС является первично-прогрессирующий рассеянный склероз (ППРС), который никогда не показывает рецидивов, а скорее начинается с устойчивого ухудшения неврологических симптомов, например способности ходить. ППРС с одинаковой частотой поражает примерно 10% пациентов с РС, мужчин и женщин. Его начало обычно позже, чем КИС или РРРС. Что касается причин и механизмов заболевания, то в случае ППРС считается, что они аналогичны вышеупомянутомуым РИС-КИС-РРРС-ВПРС.
Как правило, диагноз РС ставится в соответствии с пересмотренными критериями Макдональда или недавно принятыми критериями Люблина. Эти критерии также позволяют различать различные формы и активность заболевания РС (Thompson et al., 2018, Lancet Neurol, 17 (2):162-173).
РС представляет собой заболевание со сложным генетическим фоном. За последнее десятилетие было идентифицировано более 200 аллелей риска или количественных признаков РС (распространенные варианты генов, определяемые как однонуклеотидные полиморфизмы, ОНП), однако, безусловно, наиболее важным является гаплотип человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-DR15. Кроме того, было обнаружено несколько факторов риска, связанных с окружающей средой и образом жизни. К ним относятся инфицирование вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), курение, низкий уровень витамина D3 и ожирение как наиболее важные из таких факторов.
Все генетические и экологические факторы риска являются общими для многих людей в здоровой популяции. Точные причины, по которым болезнь начинается у людей с определенными генетическими и экологическими факторами риска, не ясны, но предполагается, что триггерами могут быть вирусные и бактериальные инфекции, например, изменения в микробиоте кишечника. Уровень конкордантности монозиготных близнецов 10-30% и риск родственников первой степени родства пациента с рассеянным склерозом примерно 2-4% по сравнению с риском 1/1000 в общей популяции, что позволяет оценить генетический риск по сравнению с экологическим, хотя взаимодействие между ними также сложно.
Чтобы идентифицировать компоненты ЦНС, против которых направлен аутоиммунный ответ при РС, ученые направили свои усилия на клетки и структуры, поражаемые при РС, в частности миелин и аксоны/нейроны, а также белки, специфичные для этих клеток/структур. В течение последних тридцати лет несколько миелиновых белков, такие как основной миелиновый белок (MBP), протеолипидный белок (PLP) и гликопротеин олигодендроглии миелина (MOG), были идентифицированы как энцефалитогенные у животных моделей (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; ЭАЭ), то есть их инъекция грызунам чувствительных линий приводила к заболеванию, сходному с РС, но также и при исследовании иммунных клеток пациентов с РС (Sospedra and Martin, 2005, Annu Rev Immunol, 23:683-747). Вышеуказанные аутоантигены специфичны для ЦНС и экспрессируются исключительно (PLP и MOG) или почти исключительно (MBP) в головном мозге. При РС некоторые аутоантигены, не специфичные для ЦНС, такие как альфа-B кристаллин и трансальдолаза-H, также были описаны как потенциальные мишени.
Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что CD4+ аутореактивные Т-клетки являются центральным фактором аутоиммунного патогенеза рассеянного склероза, и, вероятно, имеют значение не только для индукции и поддержания аутоиммунного ответа, но также и во время повреждения тканей (Sospedra and Martin, 2005). Частота высоко авидных CD4+ Т-клеток, реагирующих на основные составляющие миелиновой оболочки, такие как MBP, PLP и MOG, увеличивается у пациентов с РС (Bielekova et al., 2004, J Immunol, 172: 3893-3904). Так как CD4+ Т-клетки вовлечены в патогенез заболеваний, то они являются мишенью для терапевтических вмешательств.
Детальное исследование иммунного ответа против ЦНС-специфичных белков показало, что некоторые их пептиды распознаются у значительной части пациентов и в контексте связанных с заболеванием молекул HLA-DR. Такие пептиды называют иммуномодоминантными (Bielekova et al., 2004).
На то, что определенный пептид белка является иммунодоминантным в контексте РС указывают следующие характеристики:
a) частое распознавание этого пептида Т-клетками, т.е. примерно у 10% и более пациентов с РС, часто в контексте ассоциированного с заболеванием аллеля или гаплотипа HLA (Sospedra and Martin, 2005), и
b) распознавание этого пептида соответствующими заболеванию Т-клетками, такими как те, которые реагируют на пептиды в низких концентрациях (Т-клетки с высокой авидностью) (Bielekova et al., 2004) и поэтому считаются особенно опасными и/или имеют провоспалительный фенотип, и/или выделены из органа или компартмента-мишени (ЦНС), в случае рассеянного склероза, Т-клетки, инфильтрирующие головной мозг, спинной мозг или спинномозговую жидкость.
Однако высокая авидность распознавания не является обязательным условием, так как миелин-специфичные Т-клетки с низкой авидностью также являются патогенными в моделях гуманизированных трансгенных мышей (Quandt et al. 2012, J Immunol, 189 (6): 2897-2908).
Недавно было показано, что Т-клетки пациентов с РС демонстрируют повышенную пролиферацию in vitro в отсутствие экзогенного антигена (Mohme et al., 2013, Brain, 136: 1783-1798). Эти «автопролиферирующие» Т-клетки обогащены клетками, для которых мишенью является компартмент ЦНС пациентов с РС, и, таким образом, они могут рассматриваться как источник в периферической крови Т-клеток, инфильтрирующих головной мозг/спинномозговую жидкость (Jelcic et al., 2018, Cell, 175 (1): 85-100.e23).
В случае если данные тестирования Т-клеток in vitro недоступны или в дополнение к таким тестам, иммунное распознавание пептидов также можно предсказать/предположить на основе тех пептидов, которые будут хорошо связываться с аллелями HLA класса I или класса II индивидуума, и для CD8+ и CD4+ Т-клеток соответственно. Прогнозы связывания пептидов хорошо известны специалисту в данной области техники. Они могут выполняться с помощью хорошо зарекомендовавших себя алгоритмов прогнозирования (NetMHCII - www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/; IEDB - www.iedb.org/) и анализа мотивов связывания HLA (SYFPEITHI - www.syfpeithi.de/).
Иммунодоминантные пептиды можно использовать в антигенспецифичной иммунотерапии, такой как индукция толерантности. Одним из примеров является Европейский патент EP2205273B1, в котором раскрыты иммунодоминантные пептиды MBP, PLP и MOG и их применение для лечения РС. В раскрытом в этом патенте подходе пептиды связывают с лейкоцитами или эритроцитами.
Индукция толерантности является антигенспецифичной и делает аутореактивные Т-клетки нефункциональными или анергическими или индуцирует регуляторные Т-клетки (Treg), которые специфично подавляют нежелательный аутоиммунитет к указанным антигенам-мишеням. Индукция толерантности к аутоантигенам-мишеням является очень важной терапевтической целью при аутоиммунных заболеваниях. Она дает возможность эффективно ослабить патогенный аутоиммунный ответ с небольшими побочными эффектами. Индукции толерантности также можно достичь, применяя полноразмерный белок вместо или в дополнение к иммунодоминантному пептиду, являющемуся фрагментом белка (Kennedy MK et al., 1990, J Immunol, 144(3): 909-15).
Некоторые патологические характеристики РС отражены в модели ЭАЭ, хрестоматийной животной модели аутоиммунного заболевания, управляемого клетками Th1/Th17. Исследования рецидивирующего ЭАЭ (Р-ЭАЭ) у мышей линии SJL ясно показали, что хроническая демиелинизация включает активацию Т-клеточного ответа на иммунодоминантный миелиновый пептид, то есть PLP 139-154, на который направлено первое обострение заболевания. Затем иммунный ответ распространяется на другие миелиновые пептиды PLP, MBP и MOG, и этот процесс называется распространением эпитопа. Невосприимчивость Т-клеток, то есть толерантность, может быть, например, индуцирована, когда антигенпрезентирующие клетки (АПК), активированные антигенным пептидом, например, обрабатываются сшивающим линкером 1-этил-3- (3-диметиламинопропил)-карбодиимидом (ECDI; также сокращенно EDC).
Доклинические эксперименты показали, что однократная внутривенная инъекция наивных мышиных спленоцитов, обработанных смесью энцефалитогенных миелиновых пептидов и фиксированных сшивающим линкером EDC, является высокоэффективной для индукции пептид-специфичной толерантности in vivo. При ЭАЭ этот протокол не только предотвращал заболевание животных, но даже эффективно уменьшал начало и тяжесть всех последующих рецидивов при введении после индукции заболевания, указывая на то, что специфическая толерантность может подавлять продолжающийся аутоиммунный ответ (Miller et al., 1991, Acad Sci., 636: 79-94). Более актуальные для лечения РС исследования ЭАЭ показали, что толерантность может быть одновременно индуцирована к нескольким эпитопам с использованием смеси энцефалитогенных миелиновых пептидов, что обеспечивает способность избирательно воздействовать на аутореактивные Т-клетки с множественной специфичностью.
Толеризация человеческих Т-клеток аутологичными связанными с антигеном клетками, например АПК (Vandenbark et al., 2000, Int Immunol, 12: 57-66) или неядерными клетками, то есть эритроцитами (RBC), обработанными EDC, эффективна in vitro, о чем свидетельствует неспособность толеризованных Т-клеток пролиферировать или продуцировать цитокины Th1 и пониженная экспрессия костимулирующих молекул на этих клетках.
Имеются данные о том, что в индукцию антигенспецифичной толерантности этим способом вовлечены по меньшей мере два различных механизма:
1) Непосредственная толерантность, когда клоны Th1, встречающиеся с номинальными комплексами антиген/MHC на связанных с антигеном АПК, анергируются в результате неспособности получить адекватную CD28-опосредованную костимуляцию, и
2) Косвенные механизмы, такие как перекрестная толерантность, когда толерантность индуцируется репроцессингом и повторной презентацией антигенов толерогенными АПК хозяина и/или размножением Treg-клеток.
Последняя перекрестная толерантность, вероятно, связана с индукцией и/или размножением антигенспецифичных Treg-клеток, что также подтверждается данными, полученными в исследовании фазы Ib, как раскрыто здесь. Кроме того, обработка клеток EDC вызывает апоптоз у значительного процента обработанных клеток. Таким образом, вероятен косвенный механизм, который включает фиксированные АПК, подвергающиеся апоптозу, которые затем процессируются и представляются АПК хозяина. Это дополнительно подтверждается эффективной индукцией толерантности у MHC-дефицитных и аллогенных мышей. Дендритные клетки, полученные из костного мозга in vitro, эффективно фагоцитируют и процессируют антиген-активированные фиксированные АПК.
В настоящее время одобренные методы лечения РС включают различные антиген-неспецифичные иммуномодулирующие или иммуносупрессивные стратегии, которые обладают лишь частичной эффективностью. Все современные терапевтические средства необходимо принимать перорально ежедневно или инъецировать/вводить через различные промежутки времени и в течение длительных периодов времени. Кроме того, они связаны с многочисленными и иногда серьезными побочными эффектами.
Терапия, направленная на первопричину патогенеза РС, должна быть нацелена на специфичное удаление или функциональное подавление патогенных аутореактивных клеток без изменения «нормальной» иммунной системы. Это важно, потому что глобальная иммуномодуляция и/или иммуносупрессия происходят за счет ингибирования полезных регуляторных клеток и иммунных клеток, которые выполняют защитные функции против патогенов. В идеале, пептид-специфичная иммунная толерантность, то есть специфичная коррекция неправильно направленного аутоиммунного ответа на ткань головного/спинного мозга, должна достигаться на ранней стадии воспалительной фазы заболевания, когда блокада аутореактивного иммунного ответа может подавлять распространение и прогрессирование заболевания и можно предотвратить необратимую инвалидность. Таким образом, предпочтительной целевой группой пациентов являются пациенты с ремиттирующим рецидивирующим РС на ранних стадиях заболевания или даже пациенты с первым клиническим событием, указывающим на РС, т.е. КИС, или пациенты, у которых заболевание обнаружено еще раньше на стадии РИС. В этот момент пациенты с РС обычно имеют неврологическую инвалидность низкой степени, что позволяет им участвовать во всех видах повседневной жизни и работы без значительных компромиссов.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является идентификация значимых для РС антигенов, подходящих для использования в лечении, диагностике и/или предотвращении РС, в частности, в подходе толеризации. Еще одним аспектом настоящего изобретения является идентификация человека, который подходит для толеризации.
Настоящее изобретение основано на новом подходе к идентификации значимых для РС антигенов: изучении Т-клеток, клонально размножившихся в головном мозге пациента с РС (гомозиготные по гаплотипу HLA DR15, который, как известно, является основным генетическим фактором риска РС), который умер от очень агрессивной формы РС. Таким образом, впервые Т-клетки, происходящие из органа-мишени и клонально размноженные в нем, были проанализированы с целью идентификации антигена. Во всех предыдущих подходах для идентификации иммунодоминантных антигенов анализировали лимфоциты периферической крови.
Клональное размножение клона Т-клеток (TCC) в очагах поражения головного мозга при РС предполагает, что эти клетки значимы для РС. Здесь антигены-мишени конкретного TCC, которые ранее были описаны Planas et al. (Planas et al., 2015, Ann Clin Transl Neurol, 2 (9): 875-893), были идентифицированы как TCC21.1. Кроме того, у того же пациента были идентифицированы антигены-мишени другого TCC (TCC14). В случае TCC14 этот клон выделяли из популяции Т-клеток периферической крови, которая была идентифицирована как значимая для заболевания, демонстрируя повышенную спонтанную пролиферацию (автопролиферацию) и обогащение аутореактивными Т-клетками, мигрирующими в головной мозг. В частности, было обнаружено, что TCC14 клонально размножался в очагах поражения головного мозга при РС, даже несмотря на то, что он был выделен из периферической крови. Выделение и идентификация значимых для заболевания Т-клеток, таких как TCC21.1 и TCC14, схематически показано на Фигуре 1.
Затем можно идентифицировать целевые эпитопы, которые распознаются биологически релевантными (например, проникающими в ткань) Т-клетками (Фигура 2).
Этот новый подход выявил, что белки ГДФ-L-фукозосинтаза (сокращение гена: TSTA3; также известна как ГДФ-L-фукоза: НАДФ+ 4-оксидоредуктаза (3,5-эпимеризация) или ГДФ-4-кето-6-дезокси- D-манноза-3,5-эпимераза-4-редуктаза) и белки семейства RASGRP (гуанил-высвобождающий белок RAS), включая RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3 и RASGRP4, а также их варианты сплайсинга и изоформы, являются особенно значимыми для РС. RASGRP2 особенно предпочтителен. Таким образом, эти белки оказались иммунодоминантными при РС и являются аутоантигенами.
Значимость также была проверена на инфильтрирующих СМЖ CD4+ T-клетках от пациентов с КИС/РС для ГДФ-L-фукозосинтазы и в мононуклеарных клетках периферической крови для RASGRP2. В дополнительном анализе и ГДФ-L-фукозосинтаза, и RASGRP2 были протестированы на инфильтрирующих СМЖ CD4+ Т-клетках от пациентов с КИС/РС.
Таким образом, антигены, описанные здесь в примерах, являются первыми иммунодоминантными антигенами при РС, которые были обнаружены путем изучения специфичности Т-клеток, которые клонально размножаются в очагах поражения головного мозга при РС и, следовательно, можно предположить, что они участвуют в повреждающей аутоиммунной реакции в головном мозге. Методология, которая привела к их идентификации, комбинаторные пептидные библиотеки, не включает вышеупомянутого акцента на белки миелина/головного мозга, но является полностью несмещенной. Ранее эти антигены не были описаны как вовлеченные в РС. Кроме того, секвенирование РНК и протеомика показали, что как аутоантигены, ГДФ-L-фукозосинтаза и RASGRP2, так и родственные белки RASGRP1 и -3 экспрессируются в ткани головного мозга при РС.
Идентифицированные антигены можно использовать при лечении, диагностике и/или предотвращении РС, в частности, в подходе толеризации, а также для идентификации человека, который подходит для толеризации. Путем идентификации человека, который подходит для толеризации, у этого человека можно in vitro диагностировать рассеянный склероз. Другими словами, идентифицированные аутоантигены можно использовать в диагностике РС in vitro. Это тестирование in vitro может быть дополнено клиническими данными и результатами визуализации, т.е. можно диагностировать рассеянный склероз в соответствии с современным уровнем техники, в частности, в соответствии с пересмотренными критериями Макдональда. Таким образом, идентифицированные аутоантигены могут служить для диагностики РС у человека с дополнительными диагностическими тестами или без них.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Выделение Т-клеток, имеющих отношение к заболеванию.
Фигура 2. Обнаружение целевого эпитопа.
Фигура 3. Смеси позиционного сканирования с одним и двумя определениями декапептида в сочетании с биометрическим анализом для определения специфичности TCC21.1
Фигура 4. Краткая характеристика декапептидов человека, предсказанных с помощью биометрического подхода, синтезированных и испытанных на стимулирующую способность.
Фигура 5. Транскрипты и пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы, идентифицированные в ткани головного мозга.
Фигура 6. Пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы, миелина и CEF (контрольные пептиды цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр и вируса гриппа).
Фигура 7. Распознавание пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы инфильтрирующими СМЖ CD4+ Т-клетками от пациентов с КИС/РС
Фигура 8. Выделение автопролиферирующих Т-клеток и автопролиферирующих Т-клеток, обнаруженных в очагах поражений головного мозга при РС.
Фигура 9. Процедура скрининга для идентификации пептидного лиганда аутопролиферирующего, выделенного из периферической крови, мигрирующего в головной мозг TCC14 с использованием библиотеки позиционного сканирования.
Фигура 10. RASGRP2-реактивность Т-клеток памяти, полученных из периферической крови.
Фигура 11. Экспрессия RASGRP в В-клетках периферической крови и головном мозге.
Фигура 12. Пептидная идентификация белка RASGRP1, 2 и 3 в ткани головного мозга.
Фигура 13. Окрашивание биотин-PLP1-связанных клеток.
Фигура 14. Распознавание ГДФ-L-фукозосинтазы и миелиновых пептидов инфильтрирующими СМЖ CD4+ Т-клетками от 105 пациентов с РС.
Фигура 15. Распознавание RASGRP2 и миелиновых пептидов инфильтрирующими СМЖ CD4+ Т-клетками от 57 пациентов с РС.
Фигура 16. Индукция толерантности in vivo эритроцитами, связанными с миелиновыми пептидами.
Подробное описание изобретения
Т-клетки, используемые для идентификации иммунодоминантных пептидов и соответствующего белка, в идеале представляют собой те Т-клетки, которые являются значимыми для патогенеза заболевания. Что касается последней характеристики, те Т-клетки, которые клонально размножаются в ткани-мишени РС, головном мозге, спинном мозге и спинномозговой жидкости, представляют наибольший интерес для идентификации значимых для заболевания антигенов-мишеней. Согласно методу, описанному Planas et al. (2015) секвенирование следующего поколения последовательностей бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCR) комплементарной или геномной ДНК было использовано для идентификации клонально размножающихся Т-клеток в материале аутопсии из очагов поражения головного мозга у пациентов с РС и для выделения этих Т-клеток как TCC из аутологичной СМЖ и/или ткани (включая живые клетки и клетки полученные, например, путем биопсии или ранней аутопсии), и их характеристики с точки зрения функционального фенотипа и антигенной специфичности. Таким образом, были выделены значимые для заболевания TCC. В частности, был идентифицирован и охарактеризован TCC21.1: TCC21.1 проявлял фенотип Th2, высвобождая в основном цитокины Th2, и был способен оказывать помощь В-клеткам в продукции антител. Эта стратегия привела к идентификации значимости белка ГДФ-L-фукозосинтазы для патогенеза РС.
Вышеупомянутая стратегия, т.е. глубокое секвенирование TCR Т-клеток, инфильтрирующих головной мозг/спинной мозг/СМЖ, также использовалась для выделения значимых для заболевания Т-клеток из периферической крови и идентифицированных клона Т-клеток из автопролиферирующих мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Эта стратегия привела к идентификации значимости семейства белков RASGRP.
Таким образом, настоящие исследования Т-клеток, инфильтрирующих СМЖ (для ГДФ-L-фукозосинтазы и в дальнейшем анализе как ГДФ-L-фукозосинтазы, так и RASGRP2), и Т-клеток периферической крови (для RASGRP2), демонстрируют, что они являются иммунодоминантными мишенями аутоиммунного ответа при РС, и как ГДФ-L-фукозосинтаза, так и RASGRP2 (и другие члены семейства RASGRP) распознаются Т-клетками, инфильтрирующими головной мозг при РС, включая КИС, РРРС и ВПРС. Алгоритмы прогнозирования связывания пептида in silico NetMHCII и IEDB также использовались для идентификации иммунодоминантных областей в соответствующем белке (как описано в разделе «Примеры»).
Цитозольный фермент ГДФ-L-фукозосинтаза превращает ГДФ-4-кето-6-дезокси-D-маннозу в ГДФ-L-фукозу, которая затем используется фукозилтрансферазами для фукозилирования всех олигосахаридов. У млекопитающих фукозилированные гликаны играют важную роль во многих биологических процессах, включая реакции переливания крови, взаимодействия хозяина и микроорганизма, патогенез рака и поддержание невоспалительной среды в головном мозге.
Белки RASGR существуют по меньшей мере в четырех вариантах: RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3 и RASGRP4. В настоящее изобретение включены, в частности, RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3. Это семейство белков характеризуется наличием домена фактора обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) суперсемейства Ras, который функционирует как регулируемый диацилглицерином (DAG) фактор обмена нуклеотидов, специфично активирующий Ras посредством обмена связанного ГДФ на ГТФ. Белки этого семейства белков активируют Erk/MAP киназный каскад. Они участвуют в уменьшении апоптоза и туморогенеза В-клеток, инфицированных ВЭБ, передаче сигналов В- и Т-клеток, их адгезии, подвижности и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза В- и Т-клеток. Существует по меньшей мере четыре изоформы, т.е. варианта сплайсинга RASGRP2.
Ранее не предполагалось, что выявленные антигены ГДФ-L-фукозосинтаза и RASGRP2 (а также RASGRP1, RASGRP3 и RASGRP4) вовлечены в этиологию или патогенез РС или его животной модели ЭАЭ. Настоящее открытие, что оба белка или их фрагменты, производные или варианты сплайсинга являются иммунодоминантной мишенью аутоиммунного ответа при РС, позволяет использовать их в лечении, диагностике и/или предотвращении РС.
Под белком подразумеваются олигопептиды, полипептиды, а также белки как таковые. Последовательность белка может быть определена записью в базе данных GenBank. Последовательность белка также может быть определена записью в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot и/или записью в базе данных GenPept. Запись может быть обозначена числом, например, регистрационным номером. Там, где это применимо, записи в базе данных включают соответствующий регистрационный номер (т.е. номер записи) и номер версии. Белок также может быть определен в любой другой базе данных, известной специалисту в данной области техники. Могут существовать различные изоформы, производные и/или варианты сплайсинга, которые также охватываются настоящим изобретением. Таким образом, последовательность может отличаться от известной последовательности, например, от последовательности из записи в базах данных GenBank или UniProtKB/Swiss-Prot.
Термин «белок» или «данный белок» в соответствии с настоящим изобретением относится либо к белку ГДФ-L-фукозосинтазы, либо к белку семейства белков RASGRP, предпочтительно RASGRP2, или относится как к белку ГДФ-L-фукозосинтазы, так и к белку семейства белков RASGRP, предпочтительно RASGRP2, если не указано иное.
Вариант сплайсинга возникает в результате альтернативного сплайсинга во время экспрессии гена. Вариант сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является иммунодоминантным.
Фрагмент предпочтительно представляет собой любую часть белка, которая короче, т.е. содержит меньше аминокислот, чем исходный белок. Фрагмент может быть пептидом. В одном варианте осуществления изобретения фрагмент содержит от 5 до 50, предпочтительно от 5 до 20, более предпочтительно от 10 до 15 аминокислот, еще более предпочтительно, 15 аминокислот. В соответствии с настоящим изобретением фрагмент предпочтительно является иммунодоминантным.
Также в соответствии с настоящим изобретением возможно использовать более одного фрагмента. Предпочтительным является использование более трех, более пяти, более 10, более 15 или даже более 20 различных фрагментов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется от пяти до 20, предпочтительно от пяти до 15 различных фрагментов. Фрагмент отличается от другого фрагмента, если он не состоит из той же аминокислотной последовательности.
В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере один фрагмент каждого белка настоящего изобретения (белка ГДФ-L-фукозосинтазы или белка семейства белков RASGRP, предпочтительно RASGRP2) используется в комбинации. Особенно предпочтительно комбинировать по меньшей мере один фрагмент каждого белка настоящего изобретения по меньшей мере с одним известным пептидом из уровня техники, в частности, по меньшей мере с одним миелиновым пептидом, в частности, по меньшей мере с одним или всеми миелиновыми пептидами, определенными в SEQ ID NO: 261-267.
Производная последовательность предпочтительно определяется как аминокислотная последовательность, которая имеет гомологию или идентичность по всей своей длине с соответствующей частью эталонной аминокислотной последовательности по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или, по меньшей мере 99%. Термин «Соответствующая часть» в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к одной и той же группе аминокислот одной и той же исходной последовательности. Например, если производная последовательность длиной 100 аминокислот отличается от группы аминокислот SEQ ID NO: 1 (аминокислоты с 1 по 100 SEQ ID NO: 1) на 20 аминокислот, то эта конкретная производная последовательность имеет идентичность 80% по всей длине с соответствующей частью, т.е. аминокислотами с 1 по 100 эталонной аминокислотной последовательности, т.е. SEQ ID NO: 1. В соответствии с настоящим изобретением производная последовательность предпочтительно является иммунодоминантной.
В соответствии с настоящим изобретением «гомология» или «идентичность» аминокислотной последовательности предпочтительно определяется по всей длине эталонной аминокислотной последовательности или по всей длине соответствующей части эталонной аминокислотной последовательности, которая соответствует последовательности, гомологию или идентичность которой определяют.
«Идентичность» определяется как идентичные аминокислоты, «гомология» включает идентичные аминокислоты, а также консервативные замены. Специалисту в данной области техники известны консервативные замены, такие как
- ароматические и ароматические F и W/Y
- положительно заряженные и положительно заряженные R и K/H
- отрицательно заряженные E и D или
- алифатические V и L/M/I или A и S/T.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая любой из белков настоящего изобретения или его фрагмент, производное или вариант сплайсинга, относится к любой кодирующей нуклеотидной последовательности, например РНК или ДНК, в частности мРНК или кДНК. В одном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность представляет собой плазмиду или вектор любого типа, известный специалисту в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидные последовательности не содержат интронов, а последовательности генов содержат экзоны и интроны.
В одном аспекте настоящего изобретения белок для применения в лечении, диагностике и/или предотвращении рассеянного склероза (РС) представляет собой ГДФ-L-фукозосинтазу или ее фрагмент, производное или вариант сплайсинга. В другом аспекте настоящего изобретения белок является членом семейства RASGRP или его фрагментом, производным или вариантом сплайсинга. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из белков или их фрагментов, производных или вариантов сплайсинга, для применения в лечении, диагностике и/или предотвращении рассеянного склероза (РС).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения белки представляют собой человеческие белки и/или нуклеотидные последовательности и/или генные последовательности представляют собой человеческие последовательности.
В одном варианте осуществления изобретения ГДФ-L-фукозосинтаза проявляет ферментативную активность, которая превращает ГДФ-4-кето-6-дезокси-D-маннозу в ГДФ-L-фукозу.
В другом варианте осуществления изобретения член семейства RASGRP активирует Ras посредством обмена связанного ГДФ на ГТФ. Дополнительно или альтернативно белок активирует Erk/MAP киназный каскад.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок ГДФ-L-фукозосинтазы
a) имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или
b) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или
c) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или
d) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и белок, его фрагмент или вариант сплайсинга связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, или ее фрагментом, или распознает их или
e) кодируется геном TSTA3, в частности нуклеотидной последовательностью с 143612618 по 143618048 нуклеотид в последовательности NC_000008.11, или кодируется геном, который имеет по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности с нуклеотидной последовательностью гена с 143612618 по 143618048 нуклеотид в последовательности NC_000008.11.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения член семейства белков RASGRP
f) имеет аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или
g) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или
h) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или
i) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 и белок или его фрагмент или вариант сплайсинга связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с соответствующей аминокислотной последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, или ее фрагментом, или распознает их или
j) кодируется геном RASGRP, в частности, нуклеотидной последовательностью гена
- с 38488101 по 38565575 нуклеотид в последовательности NC_000015.10,
- с 64726911 по 64745456 нуклеотид в последовательности NC_000011.10,
- с 33436324 по 33564750 нуклеотид в последовательности NC_000002.12, или
- с 38409051 по 38426305 нуклеотид в последовательности NC_000019.10,
или кодируется геном, который по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидной последовательности гена
- с 38488101 по 38565575 нуклеотид в последовательности NC_000015.10,
- с 64726911 по 64745456 нуклеотид в последовательности NC_000011.10,
- с 33436324 по 33564750 нуклеотид в последовательности NC_000002.12, или
- с 38409051 по 38426305 нуклеотид в последовательности NC_000019.10.
Связывание с аутологичным аллелем HLA, распознавание Т-клеткой и/или распознавание антителом может указывать на иммунодоминантность белка или его фрагмента или варианта сплайсинга. Иммунодоминантность также можно проверить, как описано ниже.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется ГДФ-L-фукозосинтаза или белок RASGRP2 или его вариант сплайсинга, предпочтительно ГДФ-L-фукозосинтаза или белок RASGRP2. Белок ГДФ-L-фукозосинтазы имеет, например, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, белок RASGRP2 имеет, например, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
В одном варианте осуществления изобретения фрагмент содержит от 5 до 50, предпочтительно от 5 до 20, более предпочтительно от 10 до 15, еще более предпочтительно 15 аминокислот.
В другом варианте осуществления изобретения фрагмент
a) по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичен соответствующей аминокислотной последовательности или
b) по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологичен соответствующей аминокислотной последовательности или
c) по меньшей мере, на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологичен соответствующей аминокислотной последовательности и связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с соответствующей аминокислотной последовательностью или распознает ее.
Термин «соответствующая аминокислотная последовательность» относится к соответствующему фрагменту соответствующей аминокислотной последовательности (т.е. SEQ ID NO: 1) той же длины, что и гомологичный фрагмент (см. также определение «соответствующая часть», приведенное выше). Фрагмент с этой идентичностью и/или гомологией может содержать от 5 до 50, предпочтительно от 5 до 20, более предпочтительно от 10 до 15, еще более предпочтительно, 15 аминокислот. Идентичность и/или гомология определяется по всей длине соответствующего фрагмента. Другими словами, термин «соответствующая аминокислотная последовательность» относится к неизмененной последовательности, т.е. когда фрагмент последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, на 85% идентичен соответствующей аминокислотной последовательности, этот фрагмент на 85% идентичен (по всей длине фрагмента) неизмененному фрагменту как «вырезанному», т. е. непосредственно взятому или скопированному из SEQ ID NO: 1.
Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения белок (ГДФ-L-фукозосинтаза или член семейства белков RASGRP) имеет аминокислотную последовательность с определенной гомологией (по меньшей мере, 60%, предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%) соответствующей изображенной последовательности, приведенной в SEQ ID NOs, с дополнительным требованием, чтобы белок или его фрагмент или вариант сплайсинга связывался с аутологичным аллелем HLA, распознавался Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается или распознает аминокислотную последовательность, приведенную в соответствующей SEQ ID NO, или ее фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения белок, его фрагмент или вариант сплайсинга связывается с аутологичным аллелем HLA и распознается Т-клеткой, которая связывается или распознает аминокислотную последовательность, приведенную в соответствующей SEQ ID NO, или ее фрагмент.
Анализы для измерения и/или прогнозирования связывания с аутологичным аллелем HLA, распознавания Т-клеткой или распознавания антителом хорошо известны специалисту в данной области техники. Связывание пептида с аллелем HLA можно, например, предсказать с помощью общепринятых NetMHCII (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/) или IEDB (http: //www.iedb.org/) алгоритмов прогнозирования связывания пептида in silico. Распознавание Т-клеток можно, например, измерить с помощью анализа пролиферации Т-клеток, например, путем измерения включенной радиоактивности. Связывание пептида и/или белка с антителом можно измерить стандартными анализами, известными специалисту в данной области техники, например, с помощью ИФА. Связывание с аутологичным аллелем HLA, распознавание Т-клеткой или распознавание антителом может указывать на иммунодоминантность пептида или белка. Иммунодоминантность также можно проверить, как описано ниже.
В одном варианте осуществления изобретения фрагмент представляет собой группу последовательных аминокислот (например, от 20 до 30 аминокислот), которые по меньшей мере на 90% идентичны или гомологичны белками семейства RASGRP.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептиды, применяемые для лечения в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой фрагменты ГДФ-L-фукозосинтазы или белка семейства белков RASGRP и содержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10-98. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения пептиды состоят из аминокислотных последовательностей, приведенных в одной из SEQ ID NO: 10-98. Предпочтительными являются последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 10-35.
Последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 10-35, были идентифицированы как иммунодоминантные пептиды так как они распознаются связанными с заболеванием Т-клетками, и в результате последующей валидации распознавания основной массой инфильтрирующих СМЖ Т-клеток для ГДФ-L-фукозосинтазы и МКПК для RASGRP2, (см. раздел «Примеры»). Аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 36 и 37, представляют собой фрагменты идентичных последовательностей между RASGRP2 и RASGRP3 (выравнивание UniProtKB/Swiss-Prot Q7LDG7-1 и UniProtKB/Swiss-Prot Q8IV61). Аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NOs 38-98, содержатся в пулах пептидов, которые вызывают реакции Т-клеток памяти у пациентов с РС (см. п.9 в разделе «Примеры» и Фигуру 10). Последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 12, 21, 23, 28 и 32 (ГДФ-L-фукозосинтаза) и SEQ ID NO: 46 (RASGRP2), были валидированы в дополнительном анализе с CD4+ Т-клетками, инфильтрирующими СМЖ (см. п.13 в разделе «Примеры» и Фигуры 14 и 15).
Последовательности SEQ ID NO: 1-98 также приведены в следующей Таблице 1:
Таблица 1: Последовательности белков, положение и номер регистрации в базе данных. Последовательность Q7LDG7-1 представляет собой каноническую последовательность белка RASGRP2 и также относится к изоформе 1 RASGRP2. Белки и пептиды, изображенные ниже, являются особенно предпочтительными вариантами осуществления изобретения.
или
UniProtKB/Swiss-Prot: Q13630 (ГДФ-L-фукозосинтаза)
или
UniProtKB/Swiss-Prot: O95267 (RASGRP1)
или
UniProtKB/Swiss-Prot Q8IV61 (RASGRP3)
или
GenPept NP_733749.1 (RASGRP4)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
Или
GenPept AAF07219.1 (RASGRRP2 Изоформа 2)
или
GenPept XP_011543022.1 (RASGRRP2 Изоформа 4)
or
78-87
или
UniProtKB/Swiss-Prot Q7LDG7-1 (RASGRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
или
GenPept NP_722541.1 (RASGRRP2 Изоформа 1)
Следующие последовательности генов (Таблица 2) представляют собой последовательности генов белков ГДФ-L фукозосинтазы (ген: TSTA3), RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3 и RASGRP4 (Таблица 2). Белки или их производные или их варианты сплайсинга предпочтительно кодируются соответствующим геном.
Таблица 2: Последовательности генов и номер регистрации в базе данных
Область: 143612618..143618048
Область: 38488101..38565575
Область: 64726911..64745456
Область: 33436324..33564750
Область: 38409051..38426305
Следующие нуклеотидные последовательности (Таблица 3) представляют собой предпочтительные нуклеотидные последовательности, кодирующие любой из белков или их фрагментов, производных или вариантов сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением. Эта Таблица также содержит кодирующие последовательности (CDS), т.е. белки или пептиды, которые также можно применять для лечения, диагностики и/или профилактики рассеянного склероза (РС).
Таблица 3: Нуклеотидные последовательности и последовательности белков и соответствующие номер регистрации в базе данных (номера регистрации в Genbank)
XM_011517269.1
NM_003313.3
NM_001317783.1
XM_005251051.3
белок:
XP_011515571.1
NP_003304.1
NP_001304712.1
XP_005251108.2
NM_001306086.1
NM_001128602.1
NM_005739.3
XM_017021860
XM_005254114.3
XM_011521151.3
XR_001751485.2
XR_001751486.2
белок:
NP_001293015.1
NP_001122074.1
NP_005730.2
XP_016877349.1
XP_005254171.1
XP_011519453.1
XM_011544722.2
NM_153819
XM_011544723.3
XM_011544721.1
NM_001098670.1
XM_017017084.2
XM_011544720.2
XM_011544718.2
XM_017017082.2
XM_005273707.4
XM_017017083.2
NM_001318398.1
NM_001098671.1
XM_011544725.2
XM_017017085.2
XM_017017086.1
XR_001747720.2
XR_001747719.2
белок:
XP_011543024.1
NP_722541.1
XP_011543025.1
XP_011543023.1
NP_001092140.1
XP_016872573.1
XP_011543022.1
XP_011543020.1
XP_016872571.1
XP_005273764.3
XP_016872572.1
NP_001305327.1
NP_001092141.1
XP_011543027.1
XP_016872574.1
XP_016872575.1
NM_001349975.1
NM_170672.2
NM_001349978.1
XM_017003759.2
XM_011532746.3
XM_011532748.3
NM_001349979.1
NM_001349977.1
NM_001349980.1
NM_001139488.1
NM_001349981.1
NM_001349976.1
XM_017003761.2
NM_015376.2
XR_001738693.2
XR_001738692.2
XR_001738691.2
NR_146505.1
белок:
NP_001336904.1
NP_733772.1
NP_001336907.1
XP_016859248.1
XP_011531048.1
XP_011531050.2
NP_001336908.1
NP_001336906.1
NP_001336909.1
NP_001132960
NP_001336910.1
NP_001336905.1
XP_016859250.1
NP_056191.1
NM_001146202.1
NM_001146206.1
NM_001146207.1
NM_001146205.1
NM_001146203.1
NM_001146204.1
NM_170604.2
XR_935732.2
белок:
NP_001139674.1
NP_001139678.1
NP_001139679.1
NP_001139677.1
NP_001139675.1
NP_001139676.1
NP_733749.1
Все последовательности были получены из соответствующих онлайн баз данных 22 июня 2018 г.
В одном варианте осуществления изобретения белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением можно применять для идентификации человека, который подходит для толеризации к аутоантигенам при РС, предпочтительно на ранней стадии РС. Идентификация человека, который подходит для толеризации к аутоантигенам при РС, предпочтительно на ранней стадии РС, предпочтительно включает измерение положительной реактивности Т-клеток и/или антител к аутоантигенам у этого человека. Таким образом, у человека также может быть поставлен диагноз РС in vitro. Другими словами, идентифицированные аутоантигены также можно использовать для диагностики РС in vitro.
Диагностика РС in vitro предпочтительно включает следующие стадии: выделение Т-клеток, предпочтительно CD4+ Т-клеток и/или антител из крови, СМЖ или другой жидкости организма субъекта и измерение реактивности Т-клеток и/или антител против белка или его фрагмент, производного или варианта сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением. Специалисту в данной области техники известны способы выделения Т-клеток и/или антител из крови, СМЖ или другой жидкости организма субъекта и измерения реактивности Т-клеток и/или антител против белка, фрагмента, производного или варианта сплайсинга. Реактивность Т-клеток, предпочтительно CD4+ Т-клеток, и/или антител к тестируемому белку или его фрагменту, производному или варианту сплайсинга может указывать на то, что субъект страдает РС. Диагноз также можно комбинировать с клиническими данными и результатами визуализации, т.е. поставить диагноз РС в соответствии с современным уровнем техники, в частности, в соответствии с пересмотренными критериями Макдональда.
В другом варианте осуществления изобретения белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением можно применять для различения подгрупп РС. В частности, белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением можно применять для диагностики РС типа II у человека.
Следующие характеристики указывают на то, что определенный пептид белка является иммандоминантным в контексте РС:
a) частое распознавание этого пептида Т-клетками, т.е. примерно у 10% и более пациентов с РС, часто в контексте ассоциированного с заболеванием аллеля или гаплотипа HLA (Sospedra and Martin, 2005), и
b) распознавание этого пептида значимыми для заболевания Т-клетками, такими как те, которые реагируют на пептиды в низких концентрациях (Т-клетки с высокой авидностью) (Bielekova et al., 2004) и поэтому считаются особенно опасными и/или имеют провоспалительный фенотип, и/или выделены из органа или компартмента-мишени (ЦНС), в случае рассеянного склероза - Т-клетки, инфильтрирующие головной мозг, спинной мозг или СМЖ.
Однако высокая авидность распознавания не является обязательным условием, поскольку миелин-специфичные Т-клетки с низкой авидностью также являются патогенными в моделях гуманизированных трансгенных мышей (Quandt et al. 2012).
Таким образом, можно проверить, является ли белок или его фрагмент, производное или вариант сплайсинга иммунодоминантным в контексте РС. Такой тест предпочтительно является тестом in vitro. Особенно подходящим является тест in vitro, который позволяет измерять реактивность Т-клеток и/или антител, полученных из крови, СМЖ или другой жидкости организма человека, у которого был диагностирован РС, предпочтительно CD4+ Т-клеток, инфильтрирующих СМЖ, в отношении тестируемого белка или фрагмента, производного или варианта сплайсинга. Специалисту в данной области техники известны способа тестирования реактивности Т-клеток, предпочтительно CD4+ Т-клеток и/или антител. Например, можно оценить пролиферацию CD4+ Т-клеток и/или их секрецию ИФН-γ, или реактивность в анализе ELISPOT/FLUOROSPOT, или реактивность в отношении тетрамеров HLA-пептида. Если тестируемый белок или его фрагмент, производное или вариант сплайсинга индуцирует реактивность у человека, у которого был диагностирован РС, в случае реактивности Т-клеток, в частности, индекс стимуляции (ИС) выше 2 и/или секреция ИФН-γ выше 20 пг/мл, то тестируемый белок или фрагмент, производное или вариант сплайсинга можно назвать иммунодоминантным. Также можно выбрать 10 пациентов, у которых был диагностирован РС для такого теста. Если реактивность индуцируется по меньшей мере у 2 пациентов, то тестируемый белок или фрагмент, производное или вариант сплайсинга можно назвать иммунодоминантным. Желательно, чтобы у 10 пациентов был диагностирован РРРС в соответствии с установленными пересмотренными критериями Макдональда.
Недавно было показано, что Т-клетки пациентов с РС демонстрируют повышенную пролиферацию in vitro в отсутствие экзогенного антигена (Mohme et al., 2013; Jelcic et al., 2018). Эти «автопролиферирующие» Т-клетки обогащены клетками, которые мигрируют в компартмент ЦНС пациентов с РС, и, таким образом, могут рассматриваться как источник Т-клеток периферической крови, инфильтрирующих головной мозг/СМЖ.
В случае, если данные тестирования Т-клеток in vitro недоступны или в дополнение к таким тестам, иммунное распознавание пептидов также можно предсказать/предположить на основе тех пептидов, которые будут хорошо связываться с аллелями HLA класса I или класса II индивидуума, и для CD8+ и CD4+ Т-клеток соответственно. Прогнозы связывания пептидов хорошо известны специалисту в данной области техники. Они могут выполняться с помощью хорошо зарекомендовавших себя алгоритмов прогнозирования (NetMHCII - www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/; IEDB - www.iedb.org/) и анализа мотивов связывания HLA (SYFPEITHI - www.syfpeithi.de/), см. п.11 в разделе «Примеры».
В соответствии с настоящим изобретением белки ГДФ-L-фукозосинтаза и член семейства белков RASGRP, в частности RASGRP2, были идентифицированы как иммунодоминантные при РС, таким образом, они были идентифицированы как аутоантигены.
Необязательно, чтобы связывание с аллелем HLA было особенно сильным. Фактически, иммунодоминантность также может иметь место для пептидов, которые плохо связываются с аллелем HLA (Muraro et al., 1997, J Clin Invest; 100 (2): 339-349).
Индукция толерантности является антигенспецифичной и делает аутореактивные Т-клетки нефункциональными или анергическими или индуцирует Treg-клетки, которые специфично подавляют нежелательный аутоиммунитет к указанным антигенам-мишеням. Индукция толерантности к аутоантигенам-мишеням является очень важной терапевтической целью при аутоиммунных заболеваниях. Это дает возможность эффективно ослабить патогенный аутоиммунный ответ с небольшими побочными эффектами. Индукции толерантности также можно достичь, применяя полноразмерный белок вместо или в дополнение к иммунодоминантному пептиду, являющемуся фрагментом белка (Kennedy MK et al., 1990). Здесь было показано, что иммунологические изменения, согласующиеся с толерантностью, могут быть индуцированы у пациентов людей при внутривенной инъекции иммунодоминантных пептидов, связанных с эритроцитами (см. п.14 в разделе «Примеры»). Следовательно, для индукции толерантности можно использовать иммунодоминантные пептиды.
Таким образом, иммунодоминирование белков и/или фрагментов позволяет использовать белок и/или его фрагмент, производное или вариант сплайсинга для антигенспецифичной иммунотерапии, такой как индукция толерантности.
В соответствии с настоящим изобретением антигенспецифичная толеризация может применяться при всех формах РС: во время первого проявления, когда дифференциальный диагноз был исключен, болезнь обозначается как КИС при условии, что результаты исследования СМЖ и МРТ согласуются с этим диагнозом. МРТ выявляет поражения в местах, типичных для рассеянного склероза, то есть юкстакортикальном очаге, перивентрикулярном очаге, в стволе головного или спинного мозга. Если соблюдаются определенные критерии, которые можно обобщить как распространение в пространстве (более одного поражения или клинического симптома/признака) и во времени (более одного события), тогда можно поставить диагноз РРРС. Особый сценарий представляет собой случайное обнаружение при помощи МРТ поражений, совместимых с РС без клинических симптомов. Это состояние получило название РИС и может рассматриваться как предварительная стадия КИС и РРРС. Более 80% пациентов страдают от одного из них, и у большинства пациентов позже развивается состояние, называемое ВПРС. В это время рецидивы/обострения становятся менее частыми или полностью прекращаются, а неврологическая инвалидность неуклонно увеличивается либо между рецидивами, либо без них.
Особой формой РС является ППРС, который никогда не показывает рецидивов, а скорее начинается с устойчивого ухудшения неврологических симптомов, например способности ходить. ППРС с одинаковой частотой поражает примерно 10% пациентов с РС, мужчин и женщин. Его начало обычно позже, чем КИС или РРРС. Что касается причин и механизмов заболевания, то в случае ППРС считается, что они аналогичны вышеупомянутомуым РИС-КИС-РРРС-ВПРС.
Как правило, диагноз РС ставится в соответствии с пересмотренными критериями Макдональда. Эти критерии также позволяют различать различные формы и активность заболевания РС (Thompson et al., 2018, Lancet Neurol, 17 (2):162-173).
Предпочтительно подход толеризации применяется на ранней стадии, то есть РИС, КИС и ранний РРРС, поскольку предполагается, что иммунные процессы на этой стадии в первую очередь опосредуются аутореактивными Т-лимфоцитами, в то время как повреждение тканей, так называемые дегенеративные изменения, становятся постепенно более важным, когда болезнь прогрессирует. Однако толеризация имеет значение, пока существует аутореактивный Т-клеточный ответ против антигенов, используемых для толеризации, что также может иметь место во время ВПРС и ППРС.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения ГДФ-L-фукозосинтаза или белок RASGRP2 или его вариант сплайсинга, предпочтительно ГДФ-L-фукозосинтаза или белок RASGRP2, используются в подходе толеризации на ранней стадии, т.е. РИС, КИС и ранний РРРС. Белок ГДФ-L-фукозосинтазы имеет, например, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, белок RASGRP2 имеет, например, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам у человека, страдающего или подверженного риску развития РС. Данный способ включает стадию применения к пациенту, который в этом нуждается, т.е. к человеку, по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ГДФ-L-фукозосинтазы и членов семейства белков RASGRP, его фрагмента (пептида), производного и/или варианта сплайсинга, нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из белков или его фрагмент, производное или вариант сплайсинга и/или последовательности гена, как описано здесь, или применение по меньшей мере одного носителя, содержащего по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена, как описано здесь.
В одном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность или последовательность гена применяется к пациенту через носитель, например клетку. Затем антиген может быть экспрессирован носителем, например клеткой. Перенос аутоантиген-кодирующей РНК/ДНК в носитель, например клетку и, таким образом, кодирование вышеуказанных аутоантигенов, также возможны аналогично подходам к вакцинации против опухолей, в которых используются антиген-кодирующие РНК.
Особенно предпочтительно для индукции антигенспецифичной толерантности использовать полноразмерный белок ГДФ-L-фукозосинтазы (SEQ ID NO: 1) или полноразмерный белок RASGRP2 (SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6, 7, 8 или 9). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения используется фрагмент любого из этих белков. Особенно предпочтительно использовать фрагмент, приведенный в любой из SEQ ID NO: 10-98. Еще более предпочтительным является пептид, приведенный в любой из SEQ ID NO: 10-35.
По меньшей мере, один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидная последовательность и/или последовательность гена могут применяться путем назального, ингаляционного, перорального, подкожного, внутрицеломического, внутримышечного, внутрикожного, чрезкожного или внутривенного введения, предпочтительно путями введения, которые считаются толерогенными, например, внутривенно, подкожно, внутрикожно, чрезкожно, перорально, ингаляционно, назально или в сочетании с толерогенным носителем, предпочтительно эритроцитами.
В частности, способ можно применять для индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам на ранних стадиях РС или даже на доклинических стадиях этого заболевания.
Протокол индукции антигенспецифичной толерантности, описанный в настоящем изобретении, может избирательно воздействовать как на активированные, так и на наивные аутореактивные Т-клетки, специфичные для множества потенциальных энцефалитогенных эпитопов, которые поддерживают течение заболевания.
Подход толеризации также можно применять для предотвращения РС. Этот подход может включать выявление тех индивидуумов (например, в семье с пациентом с РС), которые подвержены высокому риску развития РС. Например, можно толеризировать, например, детей матери с РС или однояйцевого близнеца пациента с РС, у которых риск развития РС будет особенно высоким.
Диагноз РС или одной из его форм ставится путем выявления неврологических нарушений и/или поражений, выявляемых при помощи на МРТ, совместимых с РС, которые распространяются в пространстве и времени. Положительный лабораторный тест на аутоиммунный ответ против новых белков-мишеней ГДФ-L-фукозосинтазы и семейства RASGRP и/или их фрагментов, производных и/или вариантов сплайсинга может быть использован для выявления пациентов, для которых индукция антигенспецифичной толерантности с большой вероятностью будет благоприятной, т.е. он позволяет персонализировать подходы к антигенспецифичной толерантности. Путем выявления пациентов, для которых индукция антигенспецифичной толерантности с большой вероятностью будет благоприятной, пациенту in vitro может быть поставлен диагноз РС. Другими словами, идентифицированные аутоантигены ГДФ-L-фукозосинтаза и семейство белков RASGRP (в частности, RASGRP2) и/или их фрагменты, и/или производные, и/или варианты сплайсинга могут применяться в диагностике РС in vitro. Таким образом, это тестирование in vitro может быть дополнено клиническими данными и результатами визуализации, т.е. диагнозом РС в соответствии с современным уровнем техники, в частности, в соответствии с пересмотренными критериями Макдональда.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации человека, подходящего для толеризации к аутоантигенам при РС, предпочтительно на ранней стадии РС. Таким образом, идентифицируется отдельный пациент, для которого лечение окажет благоприятное действие, или который может быть выбран для такого лечения. Этот способ также можно применять для диагностики РС in vitro. Пациенты с КИС, вероятно, также с РИС, и РРРС лучше всего подходят для толеризации, хотя толеризация представляется значимой при любой форме РС, включая ВПРС и ППРС, пока пациент отвечает по меньшей мере на один из антигенных пептидов, которые включены в лечение толеризацией. Стадии этого способа включают выделение Т-клеток, предпочтительно CD4+ Т-клеток и/или антител из крови, СМЖ или другой жидкости организма субъекта, и измерение реактивности Т-клеток и/или антител против белка или его фрагмента, производного или вариант сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением. Специалисту в данной области техники известны способы выделения Т-клеток и/или антител из крови, СМЖ или другой жидкости организма субъекта и измерения реактивности Т-клеток и/или антител против белка, фрагмента, производного или варианта сплайсинга.
Если индивидуум имеет ответ против одного из белков или фрагментов, то он/она может, таким образом, получить in vitro диагноз РС и быть подходящим и хорошим кандидатом на лечение. Следующей стадией отбора может быть типирование HLA класса II и наличие аллелей HLA-DR, связанных с РС.
Таким образом, белки, в частности белок ГДФ-L-фукоазасинтазы или белок семейства RASGRP, в частности RASGRP2, или их фрагменты, производные или варианты сплайсинга, полученные из значимых для заболевания антигенов, могут быть использованы для идентификации этих пациентов или подгрупп пациентов с существующим и/или особенно сильным провоспалительным (потенциально опасным) ответом Т-клеток или антител против соответствующего аутоантигена. Таким образом, выявляя этих пациентов или подгруппы пациентов с существующим и/или особенно сильным провоспалительным (потенциально опасным) ответом Т-клеток или антител против соответствующего аутоантигена, у пациента in vitro может быть диагностирован РС. В этой ситуации предварительное тестирование пациента подходящим тестом для оценки реактивности против аутоантигена также позволит адаптировать лечение толеризацией (например, состав пептидов/белков, используемых для толеризации) для отдельного пациента или подгруппы пациентов с целью обеспечения как можно более специфичной толеризации, а также во избежание возможных побочных эффектов. Однако антигенспецифичная толеризация также может быть проведена у пациентов, которые не проявляют Т-клеточный ответ на толеризирующий антиген. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в предварительном тестировании in vitro человека, у которого диагностирован РС, или человека, подверженного риску развития РС.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к носителю, который содержит по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена, как описано здесь. Носитель может быть связан по меньшей мере с одним белком, фрагментом, производным и/или вариантом сплайсинга, и/или носитель может содержать по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена. В одном варианте осуществления изобретения термин «содержит» означает, что белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидная последовательность и/или последовательность гена находится внутри носителя, а не на его поверхности. Белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга также могут быть связаны с носителем и содержаться в нем, что означает, что одна часть белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга связана с носителем, а другая часть белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга содержится в носителе.
Специалисту в данной области техники известны возможные носители. Например, носитель может быть любой клеткой, белком, липидом, гликолипидом, гранулой, наночастицей, вирусоподобной частицей (ВПЧ) или молекулой, такой как молекула сахара, или любой их комбинацией, которая подходит для применения у людей, и который может быть связан с белком/белками и/или фрагментом/фрагментами в процессе связывания, например, путем химического связывания, предпочтительно с помощью EDC. Носитель может быть производным от носителя, существующего в природе, или быть синтетическим. Предпочтительно, клетка, молекула, гранула, наночастица или ВПЧ являются биоразлагаемыми in vivo или по меньшей мере применимы к живым людям и разрушаются in vivo или удаляются из организма, в который вводится носитель. Термин «клетка» также включает предшественников клеток, например предшественников эритроцитов. Предпочтительно носителем является клетка крови, еще более предпочтительно эритроцит или лейкоцит. Лейкоцит может быть спленоцитом, МКПК или, как правило, АПК.
В одном варианте осуществления изобретения белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга экспрессируется клеткой, предпочтительно клеткой крови. Таким образом, генетическая информация, кодирующая белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга, вводится в клетку до того, как клетка экспрессирует белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга.
Можно использовать любой связывающий агент или способ связывания белка и/или его фрагмента с носителем. Например, для связывания можно использовать синтетический или природный линкер. Одним из примеров такого линкера является гликофорин A, присутствующий на поверхности эритроцитов. В одном варианте осуществления изобретения проводят химическое сшивание. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется химический сшивающий агент EDC, катализирующий образование пептидных связей между свободными амино- и карбоксильными группами. В частности, в присутствии EDC несколько пептидов могут быть связаны с поверхностью носителя, что позволяет одновременно нацеливаться на множество специфичностей Т-клеток. Предпочтительно, более трех, более пяти, более 10, более 15 или даже более 20 различных пептидов связаны с поверхностью носителя. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используют от пяти до 20, предпочтительно от пяти до 15 различных пептидов. Пептид отличается от другого пептида, если он не состоит из той же аминокислотной последовательности. Носителем предпочтительно, но не обязательно, является клетка. EDC можно использовать для связывания с любым носителем, пока присутствует свободная аминогруппа.
В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере один пептид каждого белка настоящего изобретения (белок ГДФ-L-фукозосинтазы или белок семейства белков RASGRP, предпочтительно RASGRP2) используют в комбинации и связывают с носителем. Особенно предпочтительно комбинировать по меньшей мере один пептид каждого белка настоящего изобретения с по меньшей мере одним пептидом, известным из уровня техники, в частности, по меньшей мере с одним миелиновым пептидом, в частности, по меньшей мере с одним или всеми миелиновыми пептидами, определенные в SEQ ID NO: 261-267.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения носитель представляет собой клетку крови, и клетка крови химически связана с помощью связывающего агента, предпочтительно с помощью EDC, по меньшей мере с одним белком, фрагментом, производным и/или вариантом сплайсинга. Способ получения такой химически связанной, т.е. связанной с антигеном, клетка крови также описан, и он включает выделение клетки крови у человека, добавление по меньшей мере одного белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга, т.е. антигена, и затем добавление связывающего агента, предпочтительно EDC.
Механизм действия клеток, связанных с пептидом посредством EDC, полностью не изучен, но включает ковалентное связывание амино- и карбоксильных групп пептида и молекул клеточной поверхности с последующей запрограммированной гибелью клеток (апоптоз в случае ядерных клеток; эриптоз в случае эритроцитов) связанных с пептидом, т.е. связанных с антигеном клетки, а затем толерогенное презентирование погибших клеток in vivo.
Доза EDC, используемая для реакции связывания, может быть титрована для достижения максимальной безопасности с наилучшей эффективностью. В высоких концентрациях EDC может привести к лизису клеток, в частности эритроцитов. Для оптимальной стабильности эритроцитов можно использовать конечную концентрацию EDC менее 15 мг/мл, предпочтительно менее 10 мг/мл, еще более предпочтительно менее 5 мг/мл, еще более предпочтительно примерно 3 мг/мл. Оптимальная доза также может варьироваться. Специалисту в данной области техники известно, как определить оптимальную стабильность эритроцитов и оптимальную дозу EDC.
Связываемый белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга может быть добавлен в количестве, которое может легко определить специалист в данной области техники. Специалисту в данной области техники известно как определить оптимальное количество для взаимодействия с оптимальным количеством EDC.
Время инкубации можно варьировать и подбирать для каждой конкретной реакции связывания (например, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 120 мин). Эффективность связывания может быть выше при более продолжительном времени инкубации. В одном варианте осуществления изобретения максимум достигается через 60 мин.
Температура инкубации также может варьироваться. Например, можно использовать 15-25°C или 2-8°C. В одном варианте осуществления изобретения эффективность связывания была выше, когда реакцию связывания проводили при температуре 15-25°C.
Можно использовать любое вспомогательное вещество, которое позволяет проводить реакцию связывания. В одном варианте осуществления изобретения вспомогательное вещество является стерильным и не содержит эндотоксинов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вспомогательное вещество представляет собой стерильный физиологический раствор, не содержащий эндотоксинов (NaCl 0,9%). Физиологический раствор одобрен для применения в отношении людей и обеспечивает максимальную безопасность.
Специалисту в данной области техники известно, как определить оптимальное время и температуру инкубации и как определить возможные вспомогательные вещества.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена, как описано здесь, и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения, предотвращения или диагностики РС у субъекта человека, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества белка, фрагмента, производного, варианта сплайсинга, нуклеотидной последовательности и/или последовательность гена, как описано здесь, и/или носителя, как описано здесь. Таким образом, носитель, содержащий по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена в соответствии с настоящим изобретением, в частности, носитель, связанный по меньшей мере с одним белком, фрагментом, производным и/или вариантом сплайсинга в соответствии с настоящим изобретением и/или носитель, содержащий по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена в соответствии с настоящим изобретением, может применяться в лечении, диагностике и/или предотвращении РС.
В дополнительном аспекте изобретения пептид настоящего изобретения, предпочтительно пептид, который содержит от 5 до 50, предпочтительно от 5 до 20, более предпочтительно от 10 до 15, еще более предпочтительно, 15 аминокислот, применяется в качестве лекарственного средства.
Предпочтительным пептидом для применения в качестве лекарственного средства является пептид, имеющий
a) по меньшей мере, 85%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности с соответствующей аминокислотной последовательностью или
b) по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90% гомологии с соответствующей аминокислотной последовательностью или
c) по меньшей мере, 60%, предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90% гомологии с соответствующей аминокислотной последовательностью, и связывающийся с аутологичным аллелем HLA, распознающийся Т-клеткой и/или распознающийся антителом, которое связывается с соответствующей аминокислотной последовательностью или распознает ее.
Еще более предпочтительным для применения в качестве лекарственного средства является пептид с последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 10-98, предпочтительно SEQ ID NO: 10-35, еще более предпочтительно пептид, который состоит из последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 10-98, предпочтительно SEQ ID NO: 10-35.
В качестве дополнительного аспекта пептидные мотивы, изображенные на Фигуре 3 (ii) E (SEQ ID NO: 99), пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы, изображенные на Фигуре 5 (SEQ ID NOs: 199-215), пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы из Таблицы на Фигуре 6 (I и II) (SEQ ID NO: 10-14, 19-20, 22-23, 25-32 и 216-290) и пептиды RASGRP1, RASGRP2 и RASGRP3 из Таблицы на Фигуре 12 (SEQ ID NO: 291-309) все являются объектом настоящего изобретения и могут применяться в соответствии с настоящим изобретением.
Примеры
Специфичность ГДФ-L-фукозосинтазы
1. Характеристика TCC21.1
Подход к объективной идентификации антигена-мишени с использованием синтетических комбинаторных библиотек с позиционным сканированием (ps-SCL) схематично показан на Фигуре 2. Клон TCC21.1 был идентифицирован, как описано в Planas et al. (2015). TCC21.1 представляет собой CD4+ TCC, выделенный из инфильтрирующих СМЖ клеток и клонально размноженный в двух активных демиелинизированных в результате РС поражениях белого вещества (LI и LIII) от пациента с ВПРС (1154SA) с демиелинизацией типа II. TCC21.1 высвобождает цитокины Th2 и способствует пролиферации и выработке антител аутологичными В-клетками при неспецифичной активации. Для изучения пептидов, распознаваемых этим TCC с неизвестной специфичностью, с использованием библиотеки позиционного сканирования декапептидов, сначала идентифицировали молекула HLA класса II, используемую TCC21.1 для распознавания пептидных смесей. Это предварительное условие для использования подхода пептидной библиотеки/биометрического анализа для объективной идентификации антигенов-мишеней (Zhao et al., 2001, J Immunol, 167: 2130-2141; Sospedra et al., 2010, J Immunol Methods, 353 (1) -2): 93-101). Поскольку пациент 1154SA был гомозиготным по гаплотипу DR15, TCC21.1 первоначально протестировли смесями с аминокислотами (АК), определенными в положении 5, презентируемыми B-клетками клеточной линии (BCL), иммортализованной инфекцией ВЭБ, синдрома голых лимфоцитов (BLS), трансфицированными разными одиночными аутологичными молекулами HLA DR/DQ (DRA*01:01/DRB5*01:01=DR2a, DRA*01:01/DRB1*15:01=DR2b и DQA1*01:02/DQB1*06:02). В качестве показателя активации Т-клеток использовали продукцию ГМКСФ, поскольку TCC21.1 высвобождает этот цитокин после неспецифичной стимуляции анти-CD3 и PMA (Planas et al., 2015). Только смеси, презентируемые BCL, экспрессирующими молекулы DRB1*15:01 (DR2b) класса II, были стимулирующими (данные не приводятся).
2. Синтетическая комбинаторная библиотека с позиционным сканированием как метод идентификации антигенов/идентификации ГДФ-L-фукозосинтазы
Затем TCC21.1 тестировали с полной библиотекой с позиционным сканированием декапептидов (200 смесей; т.е. смесей, представляющих 10 положений 10-мера и в каждом из фиксированных положений одну из 20 L-аминокислот), пререзентируемых BCL, экспрессирующей молекулы DRB1*15:01 класса II. Высвобождение ГМКСФ в ответ на полную библиотеку показан на Фигуре 3A. Аналогичная картина ответа была получена с высвобождением IL-10. Затем создавали оценочную матрицу биометрического анализа путем присвоения числовых значений стимулирующему потенциалу каждой из 20 определенных АК в каждой из десяти позиций библиотеки декапептидов, как описано ранее (Zhao et al., 2001). Здесь значения были рассчитаны как логарифм по основанию 10 медианы секреции ГМКСФ (пг/мл) в трех независимых экспериментах в присутствии смесей за вычетом секреции в отсутствие смесей (Фигура 3B). Основываясь на модели независимого вклада отдельных АК в распознавание пептидного антигена, прогнозируемый стимулирующий потенциал данного пептида представляет собой сумму значений матрицы каждой АК, содержащейся в пептиде в каждом положении (Zhao et al., 2001). Этот метод оценки применяли для ранжирования всех естественных перекрывающихся 10-мерных пептидов белковых последовательностей в базе данных белков человека UniProt в соответствии с оценкой их стимулирующего потенциала, которая позволяет прогнозировать их стимулирующую активность. Основываясь на этих предсказанных значениях, 50 предсказанных природных пептидов человека с наивысшими баллами были синтезированы и протестированы при концентрации 5 мкг/мл (Фигура 4). Неожиданно ни один из пептидов не оказывал явного стимулирующего воздействия (Фигура 3C). Прогнозирующая способность вышеуказанного подхода, сочетающего библиотеку позиционного сканирования и биометрический анализ, была ниже для этого TCC, чем для других в предыдущих исследованиях. Наиболее стимулирующие смеси, как показано на Фигуре 3B, имеют идентичные определенные АК в последовательных положениях, что позволяет предположить возможное распознавание одного мотива АК во многих рамках. Чтобы иметь возможность анализировать данные с использованием подхода, описанного на Фигуре 2, был разработан, синтезирован и протестирован набор из 22 смесей с двойным определением (т.е. смесей позиционного сканирования с двумя заданными положениями) (Фигура 3D); результаты подтвердили наличие уникального мотива распознавания (LHSXFEV, SEQ ID NO: 99) с различными фланкирующими остатками (Фигура 3E). Чтобы применить этот мотив распознавания в двух рамках к исходной матрице, полученной для ГМКСФ, и выполнить биометрический анализ, использовали модель среднего гармонического (СГ), чтобы интегрировать стимулирующие реакции некоторых из дважды определенных смесей (Фигура 3D), Смеси рамки 1/2-СГ) в исходную матрицу. Используя новые матрицы «гармонического усиления» рамки 1 и рамки 2, все естественные перекрывающиеся 10-мерные пептиды, полученные из базы данных белков человека UniProt, были оценены и ранжированы, как схематически показано на Фигуре 2. 50 предсказанных природных пептидов с наивысшими баллами для обеих матриц были синтезированы и протестированы на высвобождение ГМКСФ (Фигура 4). Эти две матрицы позволили идентифицировать три явно стимулирующих пептида (Фигура 3F). Два наиболее стимулирующих пептида, NVLHSAFEVG (SEQ ID NO: 16), предсказанные с помощью гармонического усиления рамки 1 и DNVLHSAFEV (SEQ ID NO: 15), предсказанные с помощью гармонического усиления рамки 2, принадлежат ГДФ-L-фукозосинтазе, кодируемой геном TSTA3, и перекрываются на 9 АК.
Подробно на Фигуре 3 показано: A. Продукция ГМКСФ TCC21.1 в ответ на полную библиотеку декапептидов для позиционного сканирования (200 смесей), презентируемую клетками BLS, экспрессирующими только DRB1*15:01. B. Оценочная матрица, разработанная с использованием медианы log10 продукции ГМКСФ в трех независимых экспериментах. Жирные границы показывают смеси, выбранные в качестве дважды определенных смесей. C. Продукция ГМКСФ TCC21.1 в ответ на 50 пептидов с наивысшими баллами, предсказанными с использованием оценочной матрицы на основе ГМКСФ. D. Продукция ГМКСФ TCC21.1 в ответ на 22 дважды определенных смеси. Серым цветом показаны смеси с определенными АК мотива TCR в рамке 1 и черным цветом в рамке 2. Стимулирующие реакции смесей, выделенные жирным шрифтом (рамка 1/2-СГ), были интегрированы в исходную матрицу с использованием модели среднего гармонического. E. Мотив TCR и значения активности дважды определенной смеси, выбранные на основе модели среднего гармонического и включенные в исходную матрицу, рамка 1-СГ серым цветом и рамка 2-СГ черным. F. Продукция ГМКСФ TCC21.1 в ответ на 50 пептидов с более высокими баллами, предсказанными с использованием оценочных матриц гармонического усиления рамки 1 и 2. Полная библиотека декапептидов, дважды определенные смеси и индивидуальные декапептиды были презентированы клетками BLS, экспрессирующими DRB1*15:01. Смеси тестировали при концентрации 200 мкг/мл и индивидуальные декапептиды при концентрации 5 мкг/мл. Гистограммы показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (СОС), а точечные графики - среднее значение трех независимых экспериментов. Высвобожденный цитокин всегда выражается в пг/мл, высвобождаемых TCC21.1 в ответ на стимулы, минус пг/мл, высвобождаемых в отсутствие стимулов (отрицательный контроль).
На Фигуре 4 показана краткая характеристика декапептидов человека, предсказанных с помощью биометрического подхода, которые были синтезированы и затем протестированы на стимулирующую способность при концентрации 5 мг/мл на основе высвобождения ГМКСФ. Пептиды ранжируются от 1 до 50 для гармонического усиления рамки 1 и 2 соответственно.
3. Данные RNASeq/транскриптома и протеома, демонстрирующие экспрессию ГДФ-L-фукозосинтазы в ткани головного мозга.
Уровень транскрипта, выраженный как «количество прочтений на тысячу основания модели экзона на миллион картированных прочтений (RPKM) ГДФ-L-фукозосинтазы в LI и LIII аутологичного головного мозга, показан на Фигуре 5. Значения транскриптов для других специфичных для головного мозга генов также показаны в качестве контроля качества образцов и в качестве эталона для генов, экспрессируемых на высоком (MBP, PLP1) и среднем (миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG), миелин-ассоциированный основной белок олигодендроцитов (MOBP) и миелиновый гликопротеин олигодендроцитов (OMG)) уровне.
Семнадцать пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы были идентифицированы в ткани белого и серого вещества головного мозга от других пациентов с РС и контрольной группы без РС с помощью протеомного анализа. На Фигуре 5 перечислены пептидные последовательности, а также совпадения пептидных спектров (PSM) в различных образцах. Процент последовательности АК ГДФ-L-фукозосинтазы, покрытой идентифицированными пептидами, составлял 56%. Позиция относится к последовательности UniProtKB/Swiss-Prot: Q13630.1. Также включен анализ других специфичных для головного мозга белков в качестве эталона сравнения (Фигура 5).
Таким образом, было показано, что ГДФ-L-фукозосинтаза экспрессируется в головном мозге (РНК и белок).
4. ГДФ-L-фукозосинтаза как основной аутоантиген для TCC, инфильтрирующего мозг.
Чтобы идентифицировать аутоантигены, распознаваемые TCC21.1 в двух аутологичных очагах поражениях головного мозга, в которых TCC21.1, как известно, был клонально размножен (LI и III (Planas et al., 2015)), матрицы гармонического усиления рамки 1 и рамки 2 затем использовали для оценки и ранжирования в соответствии с их стимулирующей оценкой всех естественных перекрывающихся 10-мерных пептидов в белковых последовательностях в суббазе данных белков головного мозга, созданной с использованием данных транскриптома на основе RNASeq из этих двух повреждений (GSE60943). Из 40 предсказанных природных пептидов головного мозга с наивысшими баллами для матрицы рамки 1 38 пептидов уже были предсказаны на основе объективной базы данных белков человека UniProt. Для матрицы рамки 2 были ранее предсказаны первые 40 пептидов (Фигура 4). Два новых пептида для рамки 1 были синтезированы и протестированы. Было обнаружено, что NVLHSAFEVG (ГДФ-L-фукозосинтаза 96-105, SEQ ID NO: 16) и DNVLHSAFEV (95-104, SEQ ID NO: 15) стимулируют TCC21.1 (Фигура 4).
5. Характеристика распознавания ГДФ-L-фукозосинтазы/характеристика ответа
Как упоминалось выше, два пептида ГДФ-L-фукозосинтазы, распознаваемые TCC21.1, перекрываются на 9 АК. На клетках BCL, экспрессирующих DRB1*15:01, были синтезированы и протестированы девять дополнительных 10-мерных пептидов, перекрывающихся на 9 АК, и был идентифицирован дополнительный пептид VLHSAFEVGA (97-106, SEQ ID NO: 18), который индуцировал высвобождение ГМКСФ. Пептид NVLHSAFEVG (96-105, SEQ ID NO: 16) давал оптимальный ответ с EC50 0,2 мкг/мл и презентировался молекулами DRB1*15:01 и DQB1*06:02. Обычными АК трех стимулирующих пептидов являются VLHSAFEV (97-104) (данные не приводятся).
Затем была охарактеризована реакция TCC21.1 на пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы, презентируемые аутологичными облученными МКПК и BCL. Пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы, презентируемые двумя типами АПК, были способны индуцировать пролиферацию. Также был проанализирован функциональный фенотип этого ответа. TCC21.1 проявляет фенотип Th2, высвобождая в основном цитокины Th2 и более низкие уровни IL-22 и IL-10. Неожиданно, когда пептиды презентировались аутологичными BCL, они индуцировали более высокие уровни ИФНγ. Кроме того, TCC21.1 также высвобождает ГМКСФ и IL-3 в ответ на пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы. Высвобождение этих двух цитокинов, по-видимому, является специфической особенностью этого TCC по сравнению с другими TCC Th1, Th1* или Th1/2, которые были получены от пациентов с различными состояниями. Внутриклеточное окрашивание цитокинов подтвердило функциональный фенотип Th2 TCC21.1 в ответ на ГДФ-L-фукозосинтазу (96-105, SEQ ID NO: 16). Более 60% клеток TCC21.1 были IL-4+ после стимуляции ГДФ-L-фукозосинтазой (96-105, SEQ ID NO: 16), в то время как только около 12% были ИФНγ+. Около 60% клеток были ГМКСФ+ и 47,7% из них также были IL-4+. Дальнейшая характеристика TCC21.1 продемонстрировала экспрессию CD28 и хемокинового рецептора CRTh2 (данные не приводятся).
6. Распознавание ГДФ-L-фукозосинтазы инфильтрирующими СМЖ CD4+ Т-клетками пациента 1154SA.
Шестьдесят два 15-мерных пептида, перекрывающихся на 10 АК и покрывающих весь белок ГДФ-L-фукозосинтазы (Фигура 6), были синтезированы и протестированы на их способность индуцировать пролиферацию TCC21.1 при презентировании аутологичными МКПК. Семь иммунодоминантных/энцефалитогенных миелиновых пептидов (Bielekova et al., 2004), пул пептидов CEF (цитомегаловирус, ВЭБ, вирус гриппа и столбнячный анатоксин) и контрольные гранулы тестировали параллельно (Фигура 6). TCC21.1 распознал два перекрывающихся пептида ГДФ-L-фукозосинтазы, 91-105 (SEQ ID NO: 14) и 96-110 (SEQ ID NO: 17), содержащих три стимулирующих декапептида (95-104 (SEQ ID NO: 15), 96-105 (SEQ ID NO: 16) и 97-106 (SEQ ID NO: 18)), которые были идентифицированы ранее.
7. Распознавание ГДФ-L-фукозосинтазы инфильтрирующими СМЖ CD4+ Т-клетками пациентов с КИС/РС.
Чтобы выяснить, происходит ли специфичное распознавание ГДФ-L-фукозосинтазы в CD4+ Т-клетках, инфильтрирующих СМЖ, у пациентов с различными формами РС (большинство из них с КИС и РРРС), был разработан новый протокол для увеличения количества свежих инфильтрирующих СМЖ CD4+ Т-клеток до большого количества за один раунд, чтобы минимизировать вариации в исходном репертуаре Т-клеток. Покоящиеся ФГА-размноженные инфильтрирующие СМЖ CD4+ Т-клетки, Т-клетки, которые также происходят из компартмента ЦНС, от 31 пациента с КИС/РС тестировали в четырех повторностях с 62 перекрывающимися пептидами ГДФ-L-фукозосинтазы, презентируемыми аутологичными облученными МКПК, как а также с семью миелиновыми пептидами, пулом пептидов CEF и контрольными гранулами. Все индексы стимуляции (ИС; кроме контрольных гранул) объединяли, и значения ИС меньше единицы считали имеющими значение единицы. Для определения оптимального порогового значения для дифференциации ответных значений ИС от не отвечающих значений в этой группе пациентов проводили кластерный анализ k-средних. Кластеризация k-средних привела к значению отсечения 1,455, чтобы отличить положительные ответы от отрицательных. Впоследствии для каждого пациента все пептиды, имеющие средний ИС (для четырехкратной повторности) более 1,455, были идентифицированы как дающие положительный ответ.
Затем вычисляли баллы пациентов путем расчета суммы медианного ИС каждого дающего ответ пептида, взвешенного по общему количеству пациентов, которые ответили на этот пептид. Таким образом, как сами значения ИС для каждого пептида, так и относительная иммуногенность каждого пептида были учтены для оценки частоты и силы иммунного ответа против конкретных антигенов. Трехкластерный анализ k-средних был выполнен на основе 10 баллов пациентов и четко сгруппировал пациентов по трем категориям: «не отвечающие», «пациенты со средней степенью ответа» и «пациенты с высоким уровнем ответа». Таким образом, девятнадцать пациентов (61,3%) были охарактеризованы как не отвечающие на ГДФ-L-фукозосинтазу, шесть (19,35%) как умеренные и шесть (19,35%) как пациенты с высокой степенью ответа (данные не приводятся). Не было обнаружено значимых различий между тремя группами для ответов на CEF или для положительного или отрицательного контроля. Иммунодоминантные пептиды были определены как пептиды, способные вызывать положительные ответы по меньшей мере у 10% пациентов. 14 пептидов GDP-L-фукозосинтазы, удовлетворяющих этому критерию, показаны на Фигуре 7. Функциональный анализ наиболее сильных ответов на некоторые иммунодоминантные пептиды выявил фенотип Th1 с продуцированием в основном ИФН-γ (данные не приводятся).
Подробно на Фигуре 7 показано: Число пациентов с КИС/РС с инфильтрирующими СМЖ CD4+ Т-клетками, которые ответили на пептиды GDP-L-фукозосинтазы. Иммунодоминантные пептиды, которые были положительными по меньшей мере у трех пациентов, показаны черным. Черными квадратами обозначены пациенты с высоким уровнем ответа, а белыми квадратами - со средним уровнем ответа.
В заключение, примерно 20-25% пациентов с РС (КИС, РРРС, ВПРС) демонстрируют иммунный ответ на различные иммунодоминантные пептиды ГДФ-L-фукозосинтазы; большинство этих ГДФ-L-фукозосинтаза-специфичных Т-клеток имеют фенотип Th1 (наиболее частый фенотип у пациентов с РС). Сравнение с реакцией на 7 миелиновых пептидов (пептиды ETIMS) показывает, что значительно меньшее количество пациентов реагирует на эти пептиды по сравнению с ГДФ-L-фукозосинтазой.
Специфичность RASGRP2
8. Идентификация TCC14 и тестирование ps-SCL с TCC14 для идентификации RASGRP2.
TCC14 был идентифицирован аналогичным подходом у пациента 1 с РС (гомозиготный по HLA-DR15), однако в данном случае из фракции автопролиферирующих (пролиферация без стимуляции) Т-клеток периферической крови, которая обогащена Т-клетками, мигрирующими в головной мозг. Также было показано путем глубокого секвенирования TCR клеток, инфильтрирующих поражения головного мозга пациента, что TCC14 клонально размножается в головном мозге. TCC14 был получен, как схематично показано на Фигуре 1 (правая часть). Выделение автопролиферирующих Т-клеток более подробно показано на Фигуре 8А. Более подробно, мононуклеарные клетки периферической крови высевают в дублирующие лунки после мечения красителем N-сукцинимидиловый сложный эфир карбоксифлуоресцеина диацетата N (CFSE) без стимула. После 7 дней культивирования пролиферирующие (CFSEdim) и непролиферирующие (CFSEhi) клетки идентифицировали с помощью проточной цитометрии, а автопролиферирующие Т-клетки (CFSEdim) выделяли путем сортировки клеток. Последовательности TCRβV сравнивали у клеток из поражений головного мозга при РС и популяцией CFSEdim (автопролиферирующей). Более 20% последовательностей TCRβV популяции CFSEdim также обнаруживаются в поражениях мозга при РС (Фигура 8B).
Затем TCC14 размножали и тестировали, как показано на Фигуре 2, с использованием объективного подхода для идентификации антигена(ов)-мишени TCC14 с использованием библиотек комбинаторных пептидов для позиционного сканирования и биометрического анализа, как описано выше. TCC14 размножился достаточно хорошо для тестирования с полным набором из 200 смесей библиотеки позиционного сканирования. Ограничение TCC14 было протестировано с клетками BLS, трансфицированными гаплотипом HLA-DR15, экспрессирующим аллели HLA класса II (DR2a, DR2b или DQw6), поскольку TCC был получен от пациента с РС гомозиготного по HLA-DR15. После определения его ограничения классом II HLA (DRB1*15:01), реактивность против всех 200 образцов была протестирована с использованием клеток BLS, трансфицированных DRB1*15:01, и он показал положительные ответы против одной или нескольких аминокислот (ак) в каждом из 10 положений. Пролиферацию (индекс стимуляции=ИС; пунктирная линия ИС=2) на основе анализа включения тимидина использовали через 72 часа в качестве показателя ответа TCC (Фигура 9, панель I). Используя оценочные матрицы для суммирования реактивности TCC14 против всех 20 L-аминокислот в каждом из 10 положений библиотеки декапептидов после тестирования нескольких доз, пептиды, которые будут распознаваться TCC14 (Фигура9, панель II), были предсказаны с использованием процесса биометрического анализа (Zhao et al., 2001). Средние значения ответов из трех повторяющихся экспериментов использовали для создания матрицы для оптимальных комбинаций аминокислот потенциального пептидного лиганда. Данные транскриптома головного мозга и соответствующие белки пациента 1, у которого был выделен TCC, использовали в качестве базы данных поиска. 92 последовательности были синтезированы и протестированы на распознавание TCC14 на основании их появления в 50 наиболее часто предсказанных пептидах, по меньшей мере для одной из используемых матриц (стимулирующий ответ с ИС>3) (Фигура 9, панель III). Как было показано ранее для других TCC, существует хорошая взаимосвязь между прогнозируемым высоким рейтингом и ответом Т-клеток (Sospedra et al., 2010; Zhao et al., 2001), поскольку TCC14 распознал многие из пептидов с высокими балами. Чтобы оценить их функциональную авидность, были проведены эксперименты по титрованию дозы с 33 пептидами, которые дали положительный ответ. Среди них были пептиды с SEQ ID NO: 33-35. Стимулирующие пептиды испытывали в уменьшающихся концентрациях на пролиферативный ответ TCC14 с использованием BLS DR2b через 72 часа. (Фигура 9, панель IV). Пептид из RASGRP2 был распознан с высокой антигенной авидностью (EC50=0,012 мкМ) (SEQ ID NO: 33), но пептиды из нескольких других изоформ RASGRP (RASGRP1, -3, 4) и другие пептиды также дали положительные ответы (Фигура 9 панель IV). Распознавание пептида RASGRP2 TCC14 приводило к секреции цитокинов Th2, а также ИФН-γ (данные не приводятся).
В заключение, несколько вариантов RASGRP распознаются клоном TCC14, но RASGRP2 с гораздо большей авидностью (то есть при более низких концентрациях антигена), что подчеркивает его биологическую значимость.
9. Реакционная способность RASGRP2 для клеток периферической крови.
Чтобы проверить реакционную способность RASGRP2 для Т-клеток памяти, полученных из периферической крови, криоконсервированные МКПК (1×108 клеток) пациентов с РС, получавших натализумаб (NAT; n=8), размораживали, а затем удаляли CD45RA-экспрессирующие клетки при помощи магнитной сортировки клеток (Miltenyi). В лунку высевали 2 × 105 МКПК, истощенных по CD45RA, (10-15 повторных лунок на условие) в среде X-Vivo и либо обрабатывали носителем (ДМСО), либо гранулами CD2/ CD3/CD28, либо активировали пулами пептида RASGRP2 (конечная концентрация пула 10 мкМ) или полноразмерным очищенным белком RASGRP2 (Origene; 0,3 мкг/мл). 15-мерные перекрывающиеся пептиды, покрывающие весь белок RASGRP2 (SEQ ID NO: s 38-98), были организованы в 9 пулов пептидов с 7 пептидами на пул, покрывающие последовательность RASGRP2 от N- (пул 1) до С-конца (пул 9). Анализ включения тимидина использовали для измерения ответов пролиферации на RASGRP2. На 7 день клетки обрабатывали метил-3H-тимидином с активностью 1 мкКи на лунку (Hartmann Analytic) и собирали через 15 часов на мембране (Tomtec). Включение измеряли с помощью β-сцинтилляционного счета (Wallac 1450, PerkinElmer). Результаты показаны точками (среднее ± СОС). Индекс стимуляции (ИС) рассчитывали как отношение пептидной или белковой стимуляции к контролю с носителем. Значения ИС > 2 считались положительными (Фигура 10).
В итоге, на Фигуре 10 показано, что Т-клетки памяти пациентов с РС с высокой степенью автопролиферации реагируют на RASGRP2. Все 8 доноров ответили или на отдельные пептидные пулы пептидов RASGRP2, либо на несколько (включая пул 2, который содержит пептид с SEQ ID NO: 46, который перекрывается с целевым пептидом-мишенью TCC14 (SEQ ID NO: 33)) и/или на полноразмерный белок, демонстрируя, что RASGRP2 является аутоантигеном, который широко распознается пациентами с РС с высокой степенью автопролиферации.
10. Данные RNASeq/транскриптома и протеома, демонстрирующие экспрессию RASGRP2 в В-клетках и в головном мозге.
Экспрессию RASGRP1-4 тестировали на уровне РНК и белка в периферических В-клетках и головном мозге (Фигура 11). RASGRP1-3 экспрессируются как в головном мозге пациента 1, так и в транскриптоме автопролиферирующих В-клеток памяти (Фигура 11).
Подробно на Фигуре 11 показано: (A) Уровень экспрессии транскриптов стимулирующих пептидов в активном очаге поражения головного мозга III пациента с РС 1 (RPKM) и автопролиферирующих (CFSEdim) В-клетках периферической крови (RPKM) от 6 пациентов с РРРС (REM). Уровни экспрессии ниже 0,1 или при отсутствии экспрессии транскрипта принимали за 0,1. Также показана экспрессия контрольных транскриптов головного мозга (MOBP) и В-клеток (CD19). (B) Масс-спектрометрический анализ В-клеток периферической крови пациентов с РРРС (REM, nihil; n=4) и ткани головного мозга (серое вещество, объединенное, n=6) пациентов с РС. Покрытие белка (столбцы) и спектральные подсчеты (числа) RASGRP1-4 изображены как мера содержания белка.
Ткань головного мозга (белое и серое вещество) контрольной группы и пациентов с РС также была протестирована с помощью протеомики с использованием масс-спектрометрии. Пептиды белков RASGRP1, 2 и 3 были идентифицированы в ткани головного мозга, в частности, с высоким содержанием RASGRP2 (Фигура 12). Положение относится к последовательности: GenBank AAC97349.1 (RASGRP1), GenBank AAI10307.1 (RASGRP2) и GenBank AAY15037.1 (RASGRP3).
Кроме того, были проведены иммуногистохимические исследования (ИГХ), которые показали экспрессию белка RASGRP2 в сером веществе головного мозга, в частности, в корковых нейронах, а также в селезенке (данные не приводятся).
11. Идентификация дополнительных иммунодоминантных пептидов в последовательностях ГДФ-L-фукозосинтазы и RASGRP2.
Кроме того, пептиды идентифицировали на основе обычно используемых алгоритмов поиска и предположений, что они потенциально иммуногенные. Подход был взят из контекста вакцинации против опухолей, где поиск иммуногенных пептидов в собственных белках (из опухоли) является стандартной процедурой. В этом сценарии последовательность белка проверяется на наличие пептидов, которые, как предполагается, связываются со значимыми для заболевания аллелями HLA (или аллелями HLA данного пациента с опухолью). Поэтому были взяты последовательности ГДФ-L-фукозосинтазы и RASGRP2, и пептиды с сильным (SB) или слабым (WB) связыванием были предсказаны с использованием общепринятых алгоритмов прогнозирования связывания пептидов in silico NetMHCII (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/) и IEDB (http://www.iedb.org/). Подробная информация о том, как выполнять поиск, доступна на сайтах двух поисковых алгоритмов. В кратком изложении, поиск предусматривает копирование последовательности интересующего белка в веб-инструмент и выбор интересующего аллеля HLA класса II (или класса I, если он представляет интерес). Затем алгоритм выдает пептидные последовательности и их соответствующее предсказанное связывание с аллелем HLA класса II. Для аллелей, для которых поиск NetMHCII был невозможен, использовался IEDB. Были использованы аллели HLA, для которых известно, что они связаны с РС. Если теперь рассматривать все области двух белков, которые, предположительно обладают WB (они представляют наибольший интерес в контексте аутоантигенов) или SB (поиск NetMHCII) или имеют прогнозируемый ранг связывания 25% или ниже (IEDB), то эти аминокислотные последовательности будут покрывать почти всю последовательность белков ГДФ-L-фукозосинтазы и RASGRP2:
Для белка ГДФ-L-фукозосинтазы предполагалось связывание пептидов, охватывающих область аминокислот с 1 по 315.
Для белка RASGRP2 предполагалось связывание пептидов, охватывающих области аминокислот с 9 до 449 и с 457 до 659.
Были использованы следующие аллели:
- HLA-DRB1*15:01 (NetMHCII)
- HLA-DRB5*01:01 (NetMHCII)
- HLA-DRB1*03:01 (NetMHCII)
- HLA-DRB1*13:03 (IEDB)
- HLA-DRB1*08:01 (IEDB)
- HLA-DRB3*02:02 (IEDB)
- HLA-DRB1*04:01 (NetMHCII)
- HLA-DRB1*04:04 (NetMHCII)
- HLA-DQw6 (DQA1*01:01; DQB1*06:02) (IEDB)
Были использованы следующие белковые последовательности:
ГДФ-L-фукозосинтаза: GenBank: AAH93061.1
RASGRP2: GenBank: AAI10307.1
В заключение, полноразмерные белки и иммунодоминантные пептиды подходят для применения в лечении, диагностике и/или предотвращении РС.
12. Получение химически связанных эритроцитов.
EDC как химический сшивающий агент
Пептид, который был синтезирован с остатком биотина (биотин-PLP1; PLP1=PLP 139-154), был использован для обеспечения возможности высокоспецифичного обнаружения пептида с использованием стрепативидина, конъюгированного с флуорофором. В кратком изложении, на мононуклеарные клетки периферической крови воздействовали или биотин-PLP1 (конечная концентрация 0,05 мг/мл), или EDC (конечная концентрация 10 мг/мл), оба в ФСБ в течение 1 часа при температуре 4C°. После двух стадий промывки клетки окрашивали стрептавидином, конъюгированным с флуорофором, и анализировали при помощи проточной цитометрии (стрептавидин-АПК).
Как показано на Фигуре 13, эффективное связывание пептида наблюдалось только в присутствии обоих веществ (пептид биотин-PLP и EDC).
13. Дальнейший анализ с участием 105 пациентов с РС (для ГДФ-L-фукозосинтазы) и 57 пациентов с РС (для RASGRP2).
Дальнейший анализ с участием 105 пациентов с РС (для ГДФ-L-фукозосинтазы) и 57 пациентов с РС (для RASGRP2) проводили для подтверждения иммунодоминантности пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы 51-65, 136-150, 161-175, 246-260 и 296-310 (SEQ ID NO: 12, 21, 23, 28 и 32) и пептида RASGRP2 78-92 (SEQ ID NO: 46). Реактивность CD4+ Т-клеток, инфильтрирующих СМЖ, которые имеют большое значение для патогенеза РС, по отношению к тестируемым пептидам сравнивали с реактивностью по отношению к известным иммунодоминантным эталонным пептидам MBP 13-32, MBP 83-99, MBP 111-129, MBP 146-170, MOG 1-20, MOG 35-55 и PLP 139-154.
Результаты показаны на Фигурах 14 и 15. Данные показывают, что тестируемые пептиды, которые являются фрагментами идентифицированных здесь белков ГДФ-L-фукозосинтазы и RASGRP2, обладают такой же или даже большей реактивностью, чем известные иммунодоминантные эталонные пептиды. Таким образом, тестируемые пептиды снова подтвердили свою иммунодоминантность. Изучение Т-клеток, инфильтрирующих СМЖ, и их реакции на предполагаемый аутоантиген особенно важно, потому что аутореактивные Т-клетки, которые проникли в орган-мишень, то есть головной мозг, спинной мозг или СМЖ, считаются, вероятно, биологически значимыми.
Пролиферативные ответы и секрецию ИФН-γ тестировали, как описано выше в разделе 7. и ниже в разделе 15. Материалы и методы, если не указано иное.
Подробно на Фигуре 14 показано: A. Пролиферативные ответы, выраженные в виде индексов стимуляции (ИС) и секреции ИФН-γ (пг/мл) инфильтрирующих СМЖ CD4+ T-клеток (один цикл роста с ФГА) на пять пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы (51-65, 136-150, 161-175, 246-260 и 296-310), четыре пептида MBP (13-32, 83-99, 111-129 и 146-170), два пептида MOG (1- 20 и 35-55), один пептид PLP (139-154) и пептиды CEF, презентируемые аутологичными МКПК. Все пептиды тестировали в четырех лунках для каждого пациента. Каждая точка представляет одну лунку, и каждый пептид был протестирован в 420 лунках (4 лунки × 105 пациентов). Положительные лунки - это лунки с ИС выше 2 (пунктирная линия) или с уровнем секреции ИФН-γ выше 20 пг/мл (пунктирная линия). Также показан процент положительных лунок, и соотношение между процентом положительных лунок по ИФН-γ и ИС. B. Процент положительных пациентов с инфильтрирующими СМЖ CD4+ Т-клетками, специфичными для различных пептидов или без установленной специфичности. Положительные пациенты определяются как пациенты с более чем 2 положительными лунками из 4 по ИС (левая гистограмма), ИФН-γ (средняя гистограмма) и ИС или ИФН-γ (правая гистограмма).
Подробно на Фигуре 15 показано: A. Пролиферативные ответы, выраженные в виде индексов стимуляции (ИС) и секреции ИФН-γ (пг/мл) инфильтрирующих СМЖ CD4+ Т-клеток (один цикл роста с ФГА) на один пептид RASGRP2 (78-92 ), четыре пептида MBP (13-32, 83-99, 111-129 и 146-170), два пептида MOG (1-20 и 35-55), один пептид PLP (139-154) и пептиды CEF, презентируемые аутологичными МКПК. Все пептиды тестировали в четырех лунках для каждого пациента. Каждая точка представляет одну лунку, и каждый пептид был протестирован в 228 лунках (4 лунки × 57 пациентов). Положительные лунки - это лунки с ИС выше 2 (пунктирная линия) или с уровнем секреции ИФН-γ выше 20 пг/мл (пунктирная линия). Также показан процент положительных лунок, и соотношение между процентом положительных лунок по ИФН-γ и ИС. B. Процент положительных пациентов с инфильтрирующими СМЖ CD4+Т-клетками, специфичными для различных пептидов или без установленной специфичности. Положительные пациенты определяются как пациенты с более чем 2 положительными лунками из 4 по ИС (левая гистограмма), ИФН-γ (средняя гистограмма) и ИС или ИФН-γ (правая гистограмма).
14. Индукция толерантности in vivo к миелиновым пептидам в испытании фазы Ib.
10 пациентов, у которых был диагностирован РС, протестировали на индукцию толерантности. В частности, они были протестированы на безопасность и переносимость связанных с пептидами, EDC-фиксированных эритроцитов и на индикаторы индукции толерантности in vivo путем внутривенной инъекции аутологичных эритроцитов, химически (посредством EDC), связанных с набором миелиновых пептидов (MBP 13-32, MBP 83-99, MBP 111-129, MBP 146-170, MOG 1-20, MOG 35-55 и PLP 139-154) (SEQ ID NO: 261-267) в контексте исследования фазы Ib. В кратком изложении, у каждого пациента берали кровь и отделяли эритроциты. Затем эритроциты химически связывали с миелиновыми пептидами ex vivo в стерильных условиях и внутривенно вводили пациенту. 2 пациента получили 1 × 1010 клеток, 3 пациента получили 1 × 1011 клеток и 5 пациентов получили 3 × 1011 клеток. День инъекции был определен как День 0.
Кровь также брали за 6 недель до инъекции (= пре-толеризация) и через 12 недель после инъекции (= пост-толеризация). В эти дни лимфоциты периферической крови получали и исследовали с помощью проточной цитометрии с флуоресцентно меченными антителами на наличие широкого спектра различных типов клеток, включая несколько субпопуляций Т-клеток, В-клеток, моноцитов и дендритных клеток, натуральных клеток-киллеров, включая экспрессирующие маркеры индуцированные Т-регуляторные клетки (Tr1) или естественные Т-регуляторные клетки (nTreg). Последние два типа клеток можно охарактеризовать следующими маркерами:
- Т-регуляторные 1 (Tr1) клетки (CD3+ CD4+ CD45RA- CD49b+ LAG3+)
- FoxP3+натуральные регуляторные Т-клетки (nTreg) (CD4+ CD25hi FOXP3+)
Кроме того, реактивность Т-клеток ко всем семи пептидам по отдельности измеряли для Т-клеток периферической крови и Т-клеток, инфильтрирующих СМЖ, как описано ниже в разделах «Тестирование гуппы Т-клеток, полученных из СМЖ, от пациентов с КИС и РРРС, против ГДФ-L-фукозосинтазы и миелиновых пептидов» и «Стимуляция Т-клеток» в те же даты, т.е. 6 недель до инъекции и 12 недель после инъекции.
На Фигуре 16 показано, что признаки индукции антигенспецифичной толерантности при инъекции связанных эритроцитов определялись по увеличению реактивности Tr1 и FoxP3+ nTreg-клеток и снижению реактивности пептид-специфичных Т-клеток. Эти данные показывают, что путем введения иммунодоминантных пептидов может быть индуцирована толерантность к соответствующим иммунодоминантным пептидам.
Подробно на Фигуре 16 показано:
A. Процент клеток Tr1 среди CD4+ клеток памяти за 6 недель до инъекции (= пре-толеризация) и через 12 недель после инъекции (= пост-толеризация). B. Процент FoxP3+ nTreg клеток среди CD4+ клеток памяти за 6 недель до инъекции (= пре-толеризация) и 12 недель после инъекции (= пост-толеризация). C. Реактивность Т-клеток у пяти пациентов, получивших 3 × 1011 клеток за 6 недель до инъекции и через 12 недель после инъекции (серые точки: перед инъекцией; черные точки: после инъекции). На верхнем графике показан процент клеток, отвечающих на все пептиды. Нижний график показывает пролиферацию каждой отдельной микролунки (всего 60).
15. Материалы и методы.
Материал пациента
ГДФ-L-фукозосинтаза
Пациент 1154SA: происходящие из СМЖ мононуклеарные клетки и МКПК были получены от пациента с ВПРС с демиелинизирующими поражениями типа II, как описано ранее (Planas et al., 2015). Типы HLA класса I и II этого пациента: A*32:01, A*33:01, B*14:02, B*51:01, DRB1*15:01, DRB5*01:01, DQB1*06:02 и DQA1*01:02.
СМЖ из диагностической люмбальной пункции и парная проба периферической крови были собраны у 31 нелеченного пациента с РС: 8 пациентов с КИС, 20 пациентов с РРРС и 3 пациентов с ВПРС. Пациенты были набраны из амбулаторной клиники Института нейроиммунологии и рассеянного склероза и дневного стационара в Университетском медицинском центре Гамбург-Эппендорф и из отделения нейроиммунологии и рассеянного склероза неврологической клиники Университетской клиники Цюриха. Диагноз РС был основан на пересмотренных критериях Макдональда. У всех пациентов с КИС с помощью изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) были обнаружены СМЖ-специфичные олигоклональные зоны. Пациенты, которые не получали стероиды по меньшей мере за 4 недели до включения в исследование, или какие-либо иммуномодулирующие или иммуносупрессивные средства в течение последних 3 месяцев, считались нелеченными и включались в исследование. Свежие клетки спинномозговой жидкости этих пациентов были размножены in vitro (см. ниже). МКПК были свежевыделены из пробирок с ЭДТА с кровью центрифугированием в градиенте плотности фиколла (PAA, Pasching, Австрия) и заморожены. Комитет по этике Гамбургской медицинской ассоциации, протокол № 2758, и Кантональный этический комитет Цюриха, EC-No. исследовательского проекта 2013-0001, утвердили методики исследования. Информированное согласие было получено от всех пациентов или родственников.
Ткань аутопсии головного мозга 13 пациентов с РС (7 ВПРС, 5 ППРС и 1 первичный рецидивирующий (ПР) РС) и 7 контрольных образцов без РС были получены из Британского банка тканей рассеянного склероза (Британский многоцентровый комитет по этике исследований, MREC/02/2/39).
Для дальнейшего анализа ГДФ-L-фукозосинтазы (п.13 из раздела «Примеры») собирали СМЖ от 105 пациентов. Среди 105 пациентов соотношение женщин и мужчин составляло 1,9, средний возраст был 35,68 лет (диапазон 17-58), у 4 пациентов был диагностирован РИС, у 10 пациентов был диагностирован КИС, у 82 пациентов был диагностирован РРРС, у 4 пациентов был диагностирован ВПРС и 5 пациентам был поставлен диагноз ППРС.
RASGRP2
МКПК были выделены у пациента 1154SA центрифугированием в градиенте плотности фиколла.
Для дальнейшего анализа RASGRP2 (п.13. из раздела «Примеры») собирали СМЖ от 57 пациентов. Эти 57 пациентов были среди 105 пациентов, прошедших тестирование на ГДФ-L-фукозосинтазу. Среди 57 пациентов соотношение женщин и мужчин составляло 2,5, средний возраст был 35,33 лет (диапазон 17-55), у 2 пациентов был диагностирован РИС, у 8 пациентов был диагностирован диагноз КИС, у 43 пациентов был диагностирован РРРС, у 1 пациента был диагностирован ВПРС и 3 пациентам был поставлен диагноз ППРС.
Анализ автопролиферации
МКПК размораживали с полной средой IMDM (GE Healthcare), содержащей 100 ед./Мл пенициллина/стрептомицина (Corning), 50 мкг/мл гентамицина (Sigma-Aldrich), 2 ммоль/л L-глутамина (PAA) и 5% инактивированной нагреванием сыворотки человека (HS, PAA), а затем однократно промывали бессывороточной средой AIM-V (GIBCO, Thermo Fisher Scientific), содержащей человеческий альбумин. Клетки инкубировали в течение 15 мин в среде AIM-V, содержащей 50 ед./Мл ДНКазы (Roche), при температуре 37°C, чтобы избежать образования скоплений клеток. После двух стадий промывки ФСБ, содержащим 0,1% HS, клетки ресуспендировали при концентрации 10 × 106 клеток/мл в ФСБ/ 0,1% HS, а затем метили в конечной концентрации 0,5 мкМ CFSE (Sigma-Aldrich) в течение 3 минут при комнатной температуре. Мечение останавливали путем гашения 5-кратным избыточным объемом холодной полной среды RPMI (PAN Biotech), содержащей 10% HS. После еще одной стадии промывки с помощью AIM-V меченные CFSE клетки высевали из расчета 2 × 105 PBMC/200 мкл на лунку в AIM-V (10-12 реплицируемых лунок на донора и состояние) в 96-луночные планшеты для микротитрования с U-образным дном. (Greiner Bio-One) при температуре 37°C, 5% CO2, в отсутствие экзогенных стимулов (= автопролиферация). Для обычных Т-клеточных реакций для тех же доноров использовали ФГА (0,5 мкг/мл) в качестве TCR-независимого стимула, столбнячный анатоксин (TTx, 5 мкг/мл, Novartis Behring) в качестве стимула чужеродным антигеном и реакцию смешанных лимфоцитов (MLR) в качестве аллогенного антигенного стимула. Через 7 дней клетки, меченные CFSE, собирали из репликативных лунок и объединяли, промывали ФСБ, блокировали Fc человеческим IgG (Sigma-Aldrich) и метили с использованием набора реагентов Live/Dead® Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) при температуре 4°C. После промывания холодным ФСБ, содержащим 2 мМ ЭДТА и 2% ФТС, клетки непосредственно окрашивали на поверхностные маркеры с использованием антител, конъюгированных с флуорохромом (таблица основных ресурсов). Измерения выполняли на проточном цитометре LSR Fortessa (BD Biosciences), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star). Этот анализ в дальнейшем был использован для тестирования конкуренции за аутопролиферацию путем инкубации меченных CFSE МКПК в присутствии антител против HLA-DR, против CD4, против ИФН-γ и антител против ГМКСФ (10 мкг/мл) или соответствующих изотипических контролей в течение 7 дней. Для анализа включения тимидина 2 × 105 МКПК на лунку (10-12 реплицируемых лунок на донора и условия) культивировали с бессывороточной средой AIM-V в 96-луночных планшетах для микротитрования с U-образным дном при температуре 37°C, 5% CO2 и на 7 день обрабатывали метил-3H-тимидином с активностью 1 мкКи на лунку (Hartmann Analytic) и собирали клетки через 15 часов (Tomtec). Включение измеряли с помощью β-сцинтилляционного счета (Wallac 1450, PerkinElmer).
Клонирование Т-клеток
Для получения TCC из автопролиферирующего компартмента 500 клеток CFSEdim из отсортированного пула клеток CFSEdim (20000 клеток) пациента 1 с РС (для секвенирования TCRVβ, описанного выше) разделеяли и проводили предельное разведение, как описано ранее (Aly et al., 2011). TCC обогащали с использованием протокола размножения с ФГА (Sigma) и человеческим IL-2 (Aly et al., 2011). Секвенирование перестроек TCR полученных TCC было проанализировано, как описано ранее (Yousef et al., 2012). Для оценки цитокинового ответа TCC, нагруженные анти-CD2/CD3/CD28 антителами частицы MACSibead (Miltenyi) использовали для стимуляции каждого TCC в 7 реплицированных лунках с каждыми 200000 клеток в среде X-Vivo (Lonza). Через 48 ч супернатанты собирали и измеряли цитокиновые ответы, как описано выше. Для экспрессии хемокинового рецептора TCC окрашивали использованием набора реагентов Live/Dead® Aqua и антител против CXCR3 и CCR6 после оттаивания и покоя клеток в течение ночи.
Транскриптомный анализ
Транскриптомный анализ поражений головного мозга выполняли, как описано ранее (Planas et al., 2015). Обсуждаемые данные были депонированы в омнибусе экспрессии генов NCBI и доступны через регистрационный номер серии GEO GSE60943.
Протеомный анализ
Для протеомного анализа экстракцию и расщепление под давлением белка проводили с помощью бароциклера (2320EXT, BioSciences, Inc, Саут-Истон, Массачусетс). Восстановление и алкилирование применяли к гомогенату до того, как образцы были расщеплены Lys-C и трипсином. Пептиды обессоливали на колонках для твердофазной экстракции (C18 Finisterre, Wicom Germany), сушили в вакууме, повторно растворяли и измеряли (спектрофотометр Nanodrop 1000, (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)). Полученные пептиды очищали и разделяли хроматографией с гидрофильным взаимодействием (HILIC, Agilent LC1200, оснащенный колонкой Polyamin II 250 × 3,0 мм 120 Å, 5 мкм) перед введением в систему для наножидкостной хроматографии Easy-nLC, соединенную с прибором Orbitrap Fusion (Thermo Fisher). Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения MASCOT с использованием базы данных белков человека UniProtKB/Swiss-Prot (22 марта 2016 г., 40912 записей). Параметры поиска: допуск по массе фрагмента 0,05 Да и масса предшественника 10 м.д., минимальное количество пептидов 2 и FDR (коэффициент ложного обнаружения) 0,1%, допуская 2 ошибочных расщепления трипсином на фрагментах. Карбамидометилирование цистеина было установлено как фиксированная модификация, а окисление метионина, n-концевое ацетилирование - как вариабельные модификации.
Библиотеки позиционного сканирования пептидов и отдельные пептиды
ГДФ-L-фукозосинтаза
Получали синтетическую комбинаторную библиотеку декапептидов с N-ацетилированными C-амидированными L-аминокислотами (АК) в формате позиционного сканирования (200 смесей) и двадцать две смеси двойного определения. Индивидуальные пептиды (Фигура 4 и Фигура 6) были синтезированы фирмой Peptides & Elephants GmbH (Потсдам, Германия).
RASGRP2
Библиотеку позиционного сканирования декапептида L-АК (N-ацетилированные и C-амидированные TPI 2040) получали стандартными методами. Каждую из 200 смесей библиотеки тестировали на их пролиферативную активность с помощью TCC14 при концентрации 40, 120 и 200 мкг/мл с использованием анализа включения тимидина. Ограничение TCC14 было протестировано с клетками BLS, трансфицированными гаплотипом HLA-DR15, экспрессирующим аллели HLA класса II (DR2a (= DRB5*01:01), DR2b (= DRB1*15:01) или DQw6 (= DQB1*0602)), поскольку TCC получен от пациента с РС, гомозиготного по HLA-DR15. Экспрессия HLA класса II в клеточных линиях BLS была подтверждена с помощью специфичных антител против DR2a, DR2b и DQ, и клетки дали отрицательный результат в тесте на микоплазму. Результаты были организованы в четыре матрицы (данные не показаны): три матрицы, каждая из которых представляет активность при одной из вышеуказанных доз, и матрица, использующая концентрацию для достижения 3-кратной пролиферации для объединения всех трех доз в одну активность. Используя процесс биометрического анализа (Zhao et al., 2001) по базе данных транскриптомных белков из головного мозга пациента с рассеянным склерозом 1154SA, для каждой из четырех матриц были созданы списки прогнозируемых пептидов. Из-за большого количества совпадений между списками прогнозируемых пептидов, в общей сложности 92 различных декамерных пептида попали в число 50 пептидов, предсказанных с наибольшей вероятностью по меньшей мере в одном таком списке. Эти пептиды были выбраны для синтеза (Peptides & Elephants GmbH, Потсдам, Германия) и протестированы.
Клетки и условия культивирования
Группу мононуклеарных клеток, полученных из СМЖ пациента 1154SA, размножали, как описано ранее (Planas et al., 2015). В кратком изложении, 2000 клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты для микротитрования с U-образным дном вместе с 2 × 105 облученных аллогенных МКПК (45 Гр), 1 мкг/мл ФГА-L (Sigma, St Louis, MO) и супернатанта IL-2 (500 Ед/мл). Среда состояла из IMDM (PAA), содержала 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина (PAA), 50 мкг/мл гентамицина (BioWhittaker, Cambrex), 2 мМ L-глутамина (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) и 5% инактивированной нагреванием сыворотки человека (PAA). Дополнительный IL-2 добавляли каждые 3-4 дня. Инфильтрирующие СМЖ CD4+ Т-клетки были положительно отобраны с использованием анти-CD4 магнитных частиц (CD4 Micro Beads Human MACS, Miltenyi Biotec Inc, Калифорния, США) и повторно стимулированы ФГА-L, IL-2 и облученными аллогенными МКПК.
TCC21.1 был получен из инфильтрирующих СМЖ клеток, а TCC14 из МКПК-производных автопролиферирующих Т-клеток, как описано ранее (Planas et al., 2015).
Тестирование группы Т-клеток, полученных из СМЖ, от пациентов с КИС и РРРС, против ГДФ-L-фукозосинтазы и миелиновых пептидов.
Свежие мононуклеарные клетки, полученные из СМЖ, от 31 пациента с КИС/РС смешивали с 5 × 106 облученных аллогенных МКПК, и CD4+ Т-клетки были положительно отобраны с использованием анти-CD4 магнитных частиц. Затем фракции CD4+ клеток высевали по 1500 клеток на лунку в 96-луночные планшеты для микротитрования с U-образным дном вместе с 1,5 × 105 облученных аллогенных МКПК, 1 мкг/мл ФГА-L и супернатанта IL-2. Среда состояла из RPMI 1640 без Hepes (Pan-Biotech, Aidenbach, Германия) с добавлением 2 мМ глутамина (Pan-Biotech), 1% (об./об.) заменимых аминокислот (Gibco), 1% (об./ об.) пирувата натрия. (Gibco), 50 мкг/мл пенициллина-стрептомицина (Corning, Нью-Йорк, США), 0,00001% β-меркаптоэтанола (Gibco) и 5% сыворотки крови человека (Банк крови Базель). Дополнительный IL-2 добавляли каждые 4 дня. Содержимое лунок, в которых наблюдался рост, переносили в 48-луночные планшеты и затем в колбу объемом 75 см3 до полного покоя клеток (20-25 дней). Клетки сильно размножались за один цикл стимуляции.
Для дальнейшего анализа пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы и пептида RASGRP2 (п.13 из раздела «Примеры») использовали тот же метод.
Аутологичные BCL от пациента 1154SA получали путем трансформации ВЭБ. Клетки BLS трансфицировали отдельными молекулами HLA класса II, DR2a (DRA1*01:01, DRB5*01:01), DR2b (DRA1*01:01, DRB1*15:01) и DQw6 (DQA1*01:02, DQB1*06:02).
Стимуляция Т-клеток
Ответы ТСС на однократно/дважды определенные смеси пептидов или отдельные декапептиды проверяли путем посева в двух повторностях 2 × 104 Т-клеток и 5 × 104 облученных линий клеток BLS или аутологичных BCL или 1 × 105 облученных МКПК (как указано) с комбинаторными смесями пептидов или без них или с отдельными декапептидами. 2,5 мкг/мл ФГА и 10-7 M ФМА (Sigma), 1 мкг/мл анти-CD3 антитела с поверхностным покрытием (OKT3, Ortho Biotech Products, Raritan, NJ) и 0,5 мкг/мл растворимого анти-CD28 антитела (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния), и набор для активации Т-клеток (анти-CD3, анти-CD28, анти-CD2 гранулы) (Miltenyi Biotec) служили в качестве положительного контроля, как указано.
Ответ инфильтрирующих СМЖ CD4+ Т-клеток, размноженных с ФГА, на ГДФ-L-фукозосинтазу, миелин и пептиды CEF (Фигура 6) оценивали путем посева в четырех повторностях 6 × 104 Т-клеток и 2 × 105 облученных аутологичных МКПК с пептидами или без них. Для экспериментов EdU в качестве АПК использовались BLS DRB1*15:01. Набор для активации Т-клеток использовали в качестве положительного контроля.
Для дальнейшего анализа пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы и пептида RASGRP2 (п.13 из раздела «Примеры») использовали тот же метод, что и для анализа ответа CD4+ Т-клеток, инфильтрирующих в СМЖ, на ГДФ-L-фукозосинтазу.
Измерение цитокинов
ГДФ-L-фукозосинтаза
Цитокины в супернатанте стимулированных TCC21.1 и размноженных клеток СМЖ измеряли через 48 часов после стимуляции с помощью иммуноанализа на основе гранул с использованием панели антител к цитокинам T-клеток-хелперов человека LEGENDplex (Biolegend), ИФА ГМКСФ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) и ИФА IL-3 (Biolegend) согласно инструкциям производителя.
Для окрашивания внутриклеточных цитокинов TCC21.1 анализировали через 48 часов после стимуляции. Через 5 ч в присутствии ингибитора транспорта белка GolgiStop (BD Biosciences) Т-клетки метили с использованием набора реагентов Live/Dead® Aqua (Invitrogen). После фиксации и пермеабилизации с помощью Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) клетки окрашивали антителами против CD4 (APC-Cy7, Biolegend), ИФН-γ (FITC, Biolegend), IL-4 (PE, BD Bioscience), ГМКСФ. (APC, Biolegend) и IL-3 (PE, Biolegend) в ФСБ, содержащем сапонин и БСА, и анализировали при помощи проточной цитометрии.
Для дальнейшего анализа пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы и пептида RASGRP2 (п.13 из раздела «Примеры») секрецию ИФН-γ в супернатанте стимулированных и нестимулированных Т-клеток, инфильтрирующих СМЖ, измеряли через 48 часов культивирования с использованием ИФА ИФН-γ (Biolegend) в двух повторностях во всех отдельных лунках в соответствии с инструкциями производителя.
Пролиферативные ответы
ГДФ-L-фукозосинтаза
Пролиферацию измеряли через 72 часа после стимуляции по включению 3H-тимидина (Hartmann Analytic, Брауншвейг, Германия) в сцинтилляционном счетчике (Wallac 1450, PerkinElmer, Rodgau-Jürgesheim, Германия). Индекс стимуляции (ИС) рассчитывали следующим образом: ИС=медиана (повторности имп./мин с пептидом)/ медиана (повторности имп./мин без пептида). Пролиферацию также измеряли с использованием набора для проточной цитометрии Click-iTTM EdU (APC, Molecular Probes, Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки окрашивали следующими антителами против CD3 (PE-Cy-7, e-Bioscience, Сан-Диего, Калифорния) и против TRBV-21 (FITC, Beckman Coulter, Бреа, Калифорния) и анализировали с помощью проточной цитометрии.
RASGRP2
Пролиферативные ответы тестировали, как описано в п.9.
Для дальнейшего анализа пептидов ГДФ-L-фукозосинтазы и пептида RASGRP2 (п.13 в разделе «Примеры») измеряли пролиферативные ответы, как описано выше для ГДФ-L-фукозосинтазы.
Экспрессия поверхностных рецепторов
Покоящийся TCC21.1 окрашивали антителами против CD4 (PE-Texas Red, Thermo Fischer, Waltham, MA), TRBV21 (FITC, Beckman Coulter), CD28 (PE-Cy7, BioLegend), CCR4 (APC, BioLegend), CCR6 ( BV785, BioLegend) и CRTh2 (PE, BioLegend) и анализировали методом проточной цитометрии.
Проточный цитометрический анализ
Анализ образцов проводили с использованием проточного цитометра LSR Fortessa (BD Biosciences) с программным обеспечением Diva, а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
ОТ-ПЦР и секвенирование перестроек TCR
Экстракцию РНК, обратную транскрипцию и секвенирование α/β-цепи TCR (TRA/ BV) TCC21.1 проводили, как описано ранее (Planas et al., 2015). Обозначения генов TCR соответствуют номенклатуре IMGT (ImMunoGeneTics, www.IMGT.org).
HLA-типирование
Типирование индивидуумов по молекулам HLA-класса I и II проводили в фирме Histogenetics LLC, Нью-Йорк, США. Выделение ДНК из цельной крови с конечной концентрацией 15 нг/мкл выполняли по стандартному протоколу выделения ДНК с использованием лизирующего буфера Тритон и обработки протеиназой К. Образцы типировали по HLA класса I (A* и B*) и HLA класса II (DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5*, DQA1* и DQB1*) с использованием типирования на основе последовательностей HLA с высоким разрешением (SBT). Прогнозы связывания HLA класса II были сделаны с использованием консенсусного инструмента аналитического ресурса IEDB.
Статистический анализ
Проводили трехкластерный анализ k-средних баллов пациентов, чтобы сгруппировать пациентов в три категории. Связь между уровнями ответа пептидов, пациентами и статусом HLA устанавливали с использованием точного критерия Фишера с поправкой Бонферрони-Холма, примененной соответствующим образом, со значимостью 5%.
Варианты осуществления изобретения
1. Белок ГДФ-L-фукозосинтазы или белок семейства белков RASGRP, или его фрагмент, производное или вариант сплайсинга, или нуклеотидная последовательность, кодирующая любой из белков или его фрагмент, производное или вариант сплайсинга, для применения в лечении, диагностике и/или предотвращении рассеянного склероза (РС).
Особенно предпочтительным является белок ГДФ-L-фукозосинтазы или белок семейства белков RASGRP, в частности RASGRP2, или его фрагмент.
2. Белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с вариантом осуществления 1,
где белок ГДФ-L-фукозосинтазы
a) имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или
b) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или
c) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или
d) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и белок, его фрагмент или вариант сплайсинга связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, или ее фрагментом, или распознает их или
e) кодируется геном TSTA3, в частности нуклеотидной последовательностью с 143612618 по 143618048 нуклеотид в последовательности NC_000008.11, или кодируется геном, который имеет по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности с нуклеотидной последовательностью гена с 143612618 по 143618048 нуклеотид в последовательности NC_000008.11
и/или
где член семейства белков RASGRP
f) имеет аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или
g) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или
h) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или
i) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, и белок или его фрагмент или вариант сплайсинга связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с соответствующей аминокислотной последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, или ее фрагментом, или распознает их или
j) кодируется геном RASGRP, в частности, нуклеотидной последовательностью гена
- с 38488101 по 38565575 нуклеотид в последовательности NC_000015.10,
- с 64726911 по 64745456 нуклеотид в последовательности NC_000011.10,
- с 33436324 по 33564750 нуклеотид в последовательности NC_000002.12, или
- с 38409051 по 38426305 нуклеотид в последовательности NC_000019.10,
или кодируется геном, который по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидной последовательности гена
- с 38488101 по 38565575 нуклеотид в последовательности NC_000015.10,
- с 64726911 по 64745456 нуклеотид в последовательности NC_000011.10,
- с 33436324 по 33564750 нуклеотид в последовательности NC_000002.12, или
- с 38409051 по 38426305 нуклеотид в последовательности NC_000019.10.
Особенно предпочтительным является белок ГДФ-L-фукозосинтазы с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, или белок с идентичностью по меньшей мере 90%, или его фрагмент. Белок RASGRP2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, или белок с идентичностью по меньшей мере 90% или его фрагмент также является особенно предпочтительным.
3. Белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с вариантом осуществления 1 или 2, где фрагмент содержит от 5 до 50, предпочтительно от 5 до 20, более предпочтительно от 10 до 15 аминокислот, еще более предпочтительно, 15 аминокислот.
Особенно предпочтительным является фрагмент длиной от 10 до 15 аминокислот.
4. Белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с вариантом осуществления 2 или 3, где фрагмент
a) по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичен соответствующей аминокислотной последовательности или
b) по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологичен соответствующей аминокислотной последовательности или
c) по меньшей мере, на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологичен соответствующей аминокислотной последовательности и связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с соответствующей аминокислотной последовательностью или распознает ее.
Особенно предпочтительно, чтобы фрагмент был по меньшей мере на 90% идентичен соответствующей аминокислотной последовательности.
5. Белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-98, предпочтительно SEQ ID NO: 10-35, предпочтительно состоит из последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 10-98, предпочтительно SEQ ID NO: 10-35.
Фрагмент предпочтительно содержит последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-35.
6. Белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для идентификации человека, который подходит для толеризации к аутоантигенам при РС, предпочтительно на ранней стадии РС. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент.
7. Белок, фрагмент, производное или вариант сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 для диагностики рассеянного склероза типа II у человека. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент.
8. Носитель, содержащий по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5. Особенно предпочтительно, чтобы носитель содержал по меньшей мере один белок, фрагмент или нуклеотидную последовательность.
9. Носитель в соответствии с вариантом осуществления 8, где носитель связан по меньшей мере с одним белком, фрагментом, производным и/или вариантом сплайсинга, и/или носитель содержит по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена.
Особенно предпочтительно, чтобы носитель был связан по меньшей мере с одним белком или фрагментом и/или чтобы носитель содержал нуклеотидную последовательность.
10. Носитель в соответствии с вариантом осуществления 8 или 9, где носитель выбран из группы, включающей клетку, предпочтительно клетку крови, белок, липид, гликолипид, гранулу, наночастицу, вирусоподобную частицу (ВПЧ) и молекулу, такую как молекула сахара, и любую их комбинацию.
Носитель предпочтительно представляет собой клетку крови.
11. Носитель в соответствии с вариантом осуществления 10, где белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга экспрессируется клеткой, предпочтительно клеткой крови.
Особенно предпочтительно, чтобы белок экспрессировался клеткой крови.
12. Носитель в соответствии с вариантом осуществления 10 или 11, где клетка крови представляет собой эритроцит или лейкоцит.
13. Носитель в соответствии с любым из вариантов осуществления 10-12, где носитель представляет собой клетку крови, и эта клетка крови химически связана с помощью связывающего агента, предпочтительно 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ECDI/EDC), по меньшей мере с одним белком, фрагментом, производным и/или вариантом сплайсинга. Предпочтительно, по меньшей мере один белок или фрагмент связан с клеткой крови посредством EDC.
14. Способ получения химически связанной клетки крови в соответствии с вариантом осуществления 13, включающий выделение клетки крови у человека, добавление по меньшей мере одного белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга и последующее добавление связывающего агента, предпочтительно EDC. Предпочтительно добавляют по меньшей мере один белок или фрагмент.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция предпочтительно содержит по меньшей мере один белок или его фрагмент или нуклеотидную последовательность и фармацевтически приемлемый носитель.
16. Способ индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам у человека, страдающего или подверженного риску развития РС, включающий стадию применения к человеку
a) по меньшей мере, одного белка, фрагмента, производного, варианта сплайсинга, нуклеотидной последовательности и/или последовательность гена в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5, и/или
b) по меньшей мере, одного носителя в соответствии с любым из вариантов осуществления 8-13.
Предпочтительным является способ индукции антигенспецифичной толерантности, где применяется по меньшей мере один белок или его фрагмент или носитель, который связан по меньшей мере с одним белком или фрагментом, и/или носитель, который содержит нуклеотидную последовательность.
17. Способ в соответствии с вариантом осуществления 16, где по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидная последовательность и/или последовательность гена применяют путем назального, ингаляционного, перорального, подкожного, внутрицеломического, внутримышечного, внутрикожного, чрезкожного или внутривенного введения, предпочтительно внутривенно, подкожно, внутрикожно, чрезкожно, перорально, ингаляционно, назально или в сочетании с носителем, предпочтительно эритроцитом.
18. Способ в соответствии с вариантом осуществления 16 или 17 для индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам при раннем РС.
19. Способ идентификации человека, подходящего для толеризации к аутоантигенам при РС, предпочтительно раннем РС, включающий выделение Т-клеток и/или антител из крови, спинномозговой жидкости или другой жидкости организма субъекта и измерение реактивности Т-клеток и/или антител против белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5. Особенно предпочтительно измерять реактивность Т-клеток и/или антител против фрагмента.
20. Фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления 3-5, предпочтительно фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 5, для применения в качестве лекарственного средства. Фрагмент, в частности, содержит последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-35.
21. Применение белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 в диагностике РС in vitro. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент.
22. Способ диагностики РС in vitro с применением белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент.
23. Применение белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 в предварительном тестировании in vitro человека, у которого диагностирован РС, или человека, подверженного риску развития РС. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент.
24. Применение белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 для производства лекарственного средства для лечения, диагностики и/или предотвращения РС. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент.
25. Белок, фрагмент, производное и/или вариант сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5, где производное представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет гомологию или идентичность по всей своей длине с соответствующей частью эталонной аминокислотной последовательности по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.
26. Способ in vitro идентификации человека, подходящего для толеризации к аутоантигенам при РС, предпочтительно на ранней стадии РС, включающий измерение реактивности Т-клеток и/или антител против белка, фрагмента, производного и/или варианта сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 с ранее полученными Т-клетками и/или антителами из крови, спинномозговой жидкости или другой жидкости организма субъекта. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент.
27. По меньшей мере, один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидная последовательность и/или последовательность гена в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5, и/или по меньшей мере один носитель в соответствии с любым из вариантов осуществления 8-13 для применения в способе индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам у человека, страдающего от РС или имеющего риск развития РС, включающем стадию применения к человеку по меньшей мере одного белка, фрагмента, производного, варианта сплайсинга, нуклеотидной последовательности и/или последовательности гена в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 и/или по меньшей мере одного носителя в соответствии с любым из вариантов осуществления 8-13. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент и/или по меньшей мере один носитель, связанный с белком или его фрагментом.
28. По меньшей мере, один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидная последовательность и/или последовательность гена в соответствии с вариантом осуществления 27 и/или по меньшей мере один носитель в соответствии с вариантом осуществления 27, где по меньшей мере один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидная последовательность и/или последовательность гена применяется путем назального, ингаляционного, перорального, подкожного, внутрицеломического, внутримышечного, внутрикожного, чрезкожного или внутривенного введения, предпочтительно внутривенно, подкожно, внутрикожно, чрезкожно, перорально, ингаляционно, назально или в сочетании с носителем, предпочтительно эритроцитом. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент и/или по меньшей мере один носитель, связанный с белком или его фрагментом.
29. По меньшей мере, один белок, фрагмент, производное, вариант сплайсинга, нуклеотидная последовательность и/или последовательность гена в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5, и/или по меньшей мере один носитель в соответствии с любым из вариантов осуществления 8-13 для индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам при раннем РС. Особенно предпочтительно использовать белок или его фрагмент и/или по меньшей мере один носитель, связанный с белком или его фрагментом.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Universitat Zurich
<120> Иммунодоминантные белки и фрагменты при рассеянном склерозе
<130> 60 613 K
<150> EP18180326.3
<151> 2018-06-28
<160> 309
<170> Патентная версия 3.5
<210> 1
<211> 321
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
35 40 45
Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr
50 55 60
His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp Asn
85 90 95
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val Ser Cys
100 105 110
Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
115 120 125
Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
130 135 140
Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln
145 150 155 160
Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
165 170 175
His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
180 185 190
His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
195 200 205
Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
210 215 220
Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
225 230 235 240
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr Phe Asp
260 265 270
Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys
275 280 285
Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala
290 295 300
Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg
305 310 315 320
Lys
<210> 2
<211> 662
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Ala Ala Ala Ala Arg Pro Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Trp Gly
1 5 10 15
Arg Pro Gly Arg Cys Gly Leu Leu Ala Ala Gly Pro Lys Arg Val Arg
20 25 30
Ser Glu Pro Gly Gly Arg Leu Pro Glu Arg Ser Leu Gly Pro Ala His
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Ala Met Ala Gly Thr Leu Asp Leu Asp Lys Gly Cys
50 55 60
Thr Val Glu Glu Leu Leu Arg Gly Cys Ile Glu Ala Phe Asp Asp Ser
65 70 75 80
Gly Lys Val Arg Asp Pro Gln Leu Val Arg Met Phe Leu Met Met His
85 90 95
Pro Trp Tyr Ile Pro Ser Ser Gln Leu Ala Ala Lys Leu Leu His Ile
100 105 110
Tyr Gln Gln Ser Arg Lys Asp Asn Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys Thr
115 120 125
Cys His Leu Val Arg Tyr Trp Ile Ser Ala Phe Pro Ala Glu Phe Asp
130 135 140
Leu Asn Pro Glu Leu Ala Glu Gln Ile Lys Glu Leu Lys Ala Leu Leu
145 150 155 160
Asp Gln Glu Gly Asn Arg Arg His Ser Ser Leu Ile Asp Ile Asp Ser
165 170 175
Val Pro Thr Tyr Lys Trp Lys Arg Gln Val Thr Gln Arg Asn Pro Val
180 185 190
Gly Gln Lys Lys Arg Lys Met Ser Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro
195 200 205
Met Glu Leu Ala Glu His Leu Thr Tyr Leu Glu Tyr Arg Ser Phe Cys
210 215 220
Lys Ile Leu Phe Gln Asp Tyr His Ser Phe Val Thr His Gly Cys Thr
225 230 235 240
Val Asp Asn Pro Val Leu Glu Arg Phe Ile Ser Leu Phe Asn Ser Val
245 250 255
Ser Gln Trp Val Gln Leu Met Ile Leu Ser Lys Pro Thr Ala Pro Gln
260 265 270
Arg Ala Leu Val Ile Thr His Phe Val His Val Ala Glu Lys Leu Leu
275 280 285
Gln Leu Gln Asn Phe Asn Thr Leu Met Ala Val Val Gly Gly Leu Ser
290 295 300
His Ser Ser Ile Ser Arg Leu Lys Glu Thr His Ser His Val Ser Pro
305 310 315 320
Glu Thr Ile Lys Leu Trp Glu Gly Leu Thr Glu Leu Val Thr Ala Thr
325 330 335
Gly Asn Tyr Gly Asn Tyr Arg Arg Arg Leu Ala Ala Cys Val Gly Phe
340 345 350
Arg Phe Pro Ile Leu Gly Val His Leu Lys Asp Leu Val Ala Leu Gln
355 360 365
Leu Ala Leu Pro Asp Trp Leu Asp Pro Ala Arg Thr Arg Leu Asn Gly
370 375 380
Ala Lys Met Lys Gln Leu Phe Ser Ile Leu Glu Glu Leu Ala Met Val
385 390 395 400
Thr Ser Leu Arg Pro Pro Val Gln Ala Asn Pro Asp Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Leu Thr Val Ser Leu Asp Gln Tyr Gln Thr Glu Asp Glu Leu Tyr Gln
420 425 430
Leu Ser Leu Gln Arg Glu Pro Arg Ser Lys Ser Ser Pro Thr Ser Pro
435 440 445
Thr Ser Cys Thr Pro Pro Pro Arg Pro Pro Val Leu Glu Glu Trp Thr
450 455 460
Ser Ala Ala Lys Pro Lys Leu Asp Gln Ala Leu Val Val Glu His Ile
465 470 475 480
Glu Lys Met Val Glu Ser Val Phe Arg Asn Phe Asp Val Asp Gly Asp
485 490 495
Gly His Ile Ser Gln Glu Glu Phe Gln Ile Ile Arg Gly Asn Phe Pro
500 505 510
Tyr Leu Ser Ala Phe Gly Asp Leu Asp Gln Asn Gln Asp Gly Cys Ile
515 520 525
Ser Arg Glu Glu Met Val Ser Tyr Phe Leu Arg Ser Ser Ser Val Leu
530 535 540
Gly Gly Arg Met Gly Phe Val His Asn Phe Gln Glu Ser Asn Ser Leu
545 550 555 560
Arg Pro Val Ala Cys Arg His Cys Lys Ala Leu Ile Leu Gly Ile Tyr
565 570 575
Lys Gln Gly Leu Lys Cys Arg Ala Cys Gly Val Asn Cys His Lys Gln
580 585 590
Cys Lys Asp Arg Leu Ser Val Glu Cys Arg Arg Arg Ala Gln Ser Val
595 600 605
Ser Leu Glu Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Pro Met His Ser His His
610 615 620
His Arg Ala Phe Ser Phe Ser Leu Pro Arg Pro Gly Arg Arg Gly Ser
625 630 635 640
Arg Pro Pro Glu Ile Arg Glu Glu Glu Val Gln Thr Val Glu Asp Gly
645 650 655
Val Phe Asp Ile His Leu
660
<210> 3
<211> 797
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gly Thr Leu Gly Lys Ala Arg Glu Ala Pro Arg Lys Pro Ser His
1 5 10 15
Gly Cys Arg Ala Ala Ser Lys Ala Arg Leu Glu Ala Lys Pro Ala Asn
20 25 30
Ser Pro Phe Pro Ser His Pro Ser Leu Ala His Ile Thr Gln Phe Arg
35 40 45
Met Met Val Ser Leu Gly His Leu Ala Lys Gly Ala Ser Leu Asp Asp
50 55 60
Leu Ile Asp Ser Cys Ile Gln Ser Phe Asp Ala Asp Gly Asn Leu Cys
65 70 75 80
Arg Ser Asn Gln Leu Leu Gln Val Met Leu Thr Met His Arg Ile Val
85 90 95
Ile Ser Ser Ala Glu Leu Leu Gln Lys Val Ile Thr Leu Tyr Lys Asp
100 105 110
Ala Leu Ala Lys Asn Ser Pro Gly Leu Cys Leu Lys Ile Cys Tyr Phe
115 120 125
Val Arg Tyr Trp Ile Thr Glu Phe Trp Val Met Phe Lys Met Asp Ala
130 135 140
Ser Leu Thr Asp Thr Met Glu Glu Phe Gln Glu Leu Val Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Glu Glu Leu His Cys Arg Leu Ile Asp Thr Thr Gln Ile Asn Ala
165 170 175
Arg Asp Trp Ser Arg Lys Leu Thr Gln Arg Ile Lys Ser Asn Thr Ser
180 185 190
Lys Lys Arg Lys Val Ser Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Glu Glu
195 200 205
Leu Ser Glu His Leu Thr Tyr Leu Glu Phe Lys Ser Phe Arg Arg Ile
210 215 220
Ser Phe Ser Asp Tyr Gln Asn Tyr Leu Val Asn Ser Cys Val Lys Glu
225 230 235 240
Asn Pro Thr Met Glu Arg Ser Ile Ala Leu Cys Asn Gly Ile Ser Gln
245 250 255
Trp Val Gln Leu Met Val Leu Ser Arg Pro Thr Pro Gln Leu Arg Ala
260 265 270
Glu Val Phe Ile Lys Phe Ile Gln Val Ala Gln Lys Leu His Gln Leu
275 280 285
Gln Asn Phe Asn Thr Leu Met Ala Val Ile Gly Gly Leu Cys His Ser
290 295 300
Ser Ile Ser Arg Leu Lys Glu Thr Ser Ser His Val Pro His Glu Ile
305 310 315 320
Asn Lys Val Leu Gly Glu Met Thr Glu Leu Leu Ser Ser Ser Arg Asn
325 330 335
Tyr Asp Asn Tyr Arg Arg Ala Tyr Gly Glu Cys Thr Asp Phe Lys Ile
340 345 350
Pro Ile Leu Gly Val His Leu Lys Asp Leu Ile Ser Leu Tyr Glu Ala
355 360 365
Met Pro Asp Tyr Leu Glu Asp Gly Lys Val Asn Val His Lys Leu Leu
370 375 380
Ala Leu Tyr Asn His Ile Ser Glu Leu Val Gln Leu Gln Glu Val Ala
385 390 395 400
Pro Pro Leu Glu Ala Asn Lys Asp Leu Val His Leu Leu Thr Leu Ser
405 410 415
Leu Asp Leu Tyr Tyr Thr Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Leu Ser Tyr Ala
420 425 430
Arg Glu Pro Arg Asn His Arg Ala Pro Pro Leu Thr Pro Ser Lys Pro
435 440 445
Pro Val Val Val Asp Trp Ala Ser Gly Val Ser Pro Lys Pro Asp Pro
450 455 460
Lys Thr Ile Ser Lys His Val Gln Arg Met Val Asp Ser Val Phe Lys
465 470 475 480
Asn Tyr Asp His Asp Gln Asp Gly Tyr Ile Ser Gln Glu Glu Phe Glu
485 490 495
Lys Ile Ala Ala Ser Phe Pro Phe Ser Phe Cys Val Met Asp Lys Asp
500 505 510
Arg Glu Gly Leu Ile Ser Arg Asp Glu Ile Thr Ala Tyr Phe Met Arg
515 520 525
Ala Ser Ser Ile Tyr Ser Lys Leu Gly Leu Gly Phe Pro His Asn Phe
530 535 540
Gln Glu Thr Thr Tyr Leu Lys Pro Thr Phe Cys Asp Asn Cys Ala Gly
545 550 555 560
Phe Leu Trp Gly Val Ile Lys Gln Gly Tyr Arg Cys Lys Asp Cys Gly
565 570 575
Met Asn Cys His Lys Gln Cys Lys Asp Leu Val Val Phe Glu Cys Lys
580 585 590
Lys Arg Ala Lys Asn Pro Val Ala Pro Thr Glu Asn Asn Thr Ser Val
595 600 605
Gly Pro Val Ser Asn Leu Cys Ser Leu Gly Ala Lys Asp Leu Leu His
610 615 620
Ala Pro Glu Glu Gly Pro Phe Thr Phe Pro Asn Gly Glu Ala Val Glu
625 630 635 640
His Gly Glu Glu Ser Lys Asp Arg Thr Ile Met Leu Met Gly Val Ser
645 650 655
Ser Gln Lys Ile Ser Leu Arg Leu Lys Arg Ala Val Ala His Lys Ala
660 665 670
Thr Gln Thr Glu Ser Gln Pro Trp Ile Gly Ser Glu Gly Pro Ser Gly
675 680 685
Pro Phe Val Leu Ser Ser Pro Arg Lys Thr Ala Gln Asp Thr Leu Tyr
690 695 700
Val Leu Pro Ser Pro Thr Ser Pro Cys Pro Ser Pro Val Leu Val Arg
705 710 715 720
Lys Arg Ala Phe Val Lys Trp Glu Asn Lys Asp Ser Leu Ile Lys Ser
725 730 735
Lys Glu Glu Leu Arg His Leu Arg Leu Pro Thr Tyr Gln Glu Leu Glu
740 745 750
Gln Glu Ile Asn Thr Leu Lys Ala Asp Asn Asp Ala Leu Lys Ile Gln
755 760 765
Leu Lys Tyr Ala Gln Lys Lys Ile Glu Ser Leu Gln Leu Glu Lys Ser
770 775 780
Asn His Val Leu Ala Gln Met Glu Gln Gly Asp Cys Ser
785 790 795
<210> 4
<211> 690
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Gly Ser Ser Gly Leu Gly Lys Ala Ala Thr Leu Asp Glu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Thr Cys Ile Glu Met Phe Asp Asp Asn Gly Glu Leu Asp Asn Ser
20 25 30
Tyr Leu Pro Arg Ile Val Leu Leu Met His Arg Trp Tyr Leu Ser Ser
35 40 45
Thr Glu Leu Ala Glu Lys Leu Leu Cys Met Tyr Arg Asn Ala Thr Gly
50 55 60
Glu Ser Cys Asn Glu Phe Arg Leu Lys Ile Cys Tyr Phe Met Arg Tyr
65 70 75 80
Trp Ile Leu Lys Phe Pro Ala Glu Phe Asn Leu Asp Leu Gly Leu Ile
85 90 95
Arg Met Thr Glu Glu Phe Arg Glu Val Ala Ser Gln Leu Gly Tyr Glu
100 105 110
Lys His Val Ser Leu Ile Asp Ile Ser Ser Ile Pro Ser Tyr Asp Trp
115 120 125
Met Arg Arg Val Thr Gln Arg Lys Lys Val Ser Lys Lys Gly Lys Ala
130 135 140
Cys Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Ile Glu Leu Ala Glu His Leu
145 150 155 160
Thr Phe Leu Glu His Lys Ser Phe Arg Arg Ile Ser Phe Thr Asp Tyr
165 170 175
Gln Ser Tyr Val Ile His Gly Cys Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Glu
180 185 190
Arg Ser Ile Ala Leu Phe Asn Gly Ile Ser Lys Trp Val Gln Leu Met
195 200 205
Val Leu Ser Lys Pro Thr Pro Gln Gln Arg Ala Glu Val Ile Thr Lys
210 215 220
Phe Ile Asn Val Ala Lys Lys Leu Leu Gln Leu Lys Asn Phe Asn Thr
225 230 235 240
Leu Met Ala Val Val Gly Gly Leu Ser His Ser Ser Ile Ser Arg Leu
245 250 255
Lys Glu Thr His Ser His Leu Ser Ser Glu Val Thr Lys Asn Trp Asn
260 265 270
Glu Met Thr Glu Leu Val Ser Ser Asn Gly Asn Tyr Cys Asn Tyr Arg
275 280 285
Lys Ala Phe Ala Asp Cys Asp Gly Phe Lys Ile Pro Ile Leu Gly Val
290 295 300
His Leu Lys Asp Leu Ile Ala Val His Val Ile Phe Pro Asp Trp Thr
305 310 315 320
Glu Glu Asn Lys Val Asn Ile Val Lys Met His Gln Leu Ser Val Thr
325 330 335
Leu Ser Glu Leu Val Ser Leu Gln Asn Ala Ser His His Leu Glu Pro
340 345 350
Asn Met Asp Leu Ile Asn Leu Leu Thr Leu Ser Leu Asp Leu Tyr His
355 360 365
Thr Glu Asp Asp Ile Tyr Lys Leu Ser Leu Val Leu Glu Pro Arg Asn
370 375 380
Ser Lys Ser Gln Pro Thr Ser Pro Thr Thr Pro Asn Lys Pro Val Val
385 390 395 400
Pro Leu Glu Trp Ala Leu Gly Val Met Pro Lys Pro Asp Pro Thr Val
405 410 415
Ile Asn Lys His Ile Arg Lys Leu Val Glu Ser Val Phe Arg Asn Tyr
420 425 430
Asp His Asp His Asp Gly Tyr Ile Ser Gln Glu Asp Phe Glu Ser Ile
435 440 445
Ala Ala Asn Phe Pro Phe Leu Asp Ser Phe Cys Val Leu Asp Lys Asp
450 455 460
Gln Asp Gly Leu Ile Ser Lys Asp Glu Met Met Ala Tyr Phe Leu Arg
465 470 475 480
Ala Lys Ser Gln Leu His Cys Lys Met Gly Pro Gly Phe Ile His Asn
485 490 495
Phe Gln Glu Met Thr Tyr Leu Lys Pro Thr Phe Cys Glu His Cys Ala
500 505 510
Gly Phe Leu Trp Gly Ile Ile Lys Gln Gly Tyr Lys Cys Lys Asp Cys
515 520 525
Gly Ala Asn Cys His Lys Gln Cys Lys Asp Leu Leu Val Leu Ala Cys
530 535 540
Arg Arg Phe Ala Arg Ala Pro Ser Leu Ser Ser Gly His Gly Ser Leu
545 550 555 560
Pro Gly Ser Pro Ser Leu Pro Pro Ala Gln Asp Glu Val Phe Glu Phe
565 570 575
Pro Gly Val Thr Ala Gly His Arg Asp Leu Asp Ser Arg Ala Ile Thr
580 585 590
Leu Val Thr Gly Ser Ser Arg Lys Ile Ser Val Arg Leu Gln Arg Ala
595 600 605
Thr Thr Ser Gln Ala Thr Gln Thr Glu Pro Val Trp Ser Glu Ala Gly
610 615 620
Trp Gly Asp Ser Gly Ser His Thr Phe Pro Lys Met Lys Ser Lys Phe
625 630 635 640
His Asp Lys Ala Ala Lys Asp Lys Gly Phe Ala Lys Trp Glu Asn Glu
645 650 655
Lys Pro Arg Val His Ala Gly Val Asp Val Val Asp Arg Gly Thr Glu
660 665 670
Phe Glu Leu Asp Gln Asp Glu Gly Glu Glu Thr Arg Gln Asp Gly Glu
675 680 685
Asp Gly
690
<210> 5
<211> 673
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Asn Arg Lys Asp Ser Lys Arg Lys Ser His Gln Glu Cys Thr Gly
1 5 10 15
Lys Ile Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Gln Val Arg Arg His Lys Thr
20 25 30
Cys Pro Ser Pro Arg Glu Ile Ser Lys Val Met Ala Ser Met Asn Leu
35 40 45
Gly Leu Leu Ser Glu Gly Gly Cys Ser Glu Asp Glu Leu Leu Glu Lys
50 55 60
Cys Ile Gln Ser Phe Asp Ser Ala Gly Ser Leu Cys His Glu Asp His
65 70 75 80
Met Leu Asn Met Val Leu Ala Met His Ser Trp Val Leu Pro Ser Ala
85 90 95
Asp Leu Ala Ala Arg Leu Leu Thr Ser Tyr Gln Lys Ala Thr Gly Asp
100 105 110
Thr Gln Glu Leu Arg Arg Leu Gln Ile Cys His Leu Val Arg Tyr Trp
115 120 125
Leu Met Arg His Pro Glu Val Met His Gln Asp Pro Gln Leu Glu Glu
130 135 140
Val Ile Gly Arg Phe Trp Ala Thr Val Ala Arg Glu Gly Asn Ser Ala
145 150 155 160
Gln Arg Arg Leu Gly Asp Ser Ser Asp Leu Leu Ser Pro Gly Gly Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Leu Pro Met Ser Ser Pro Gly Leu Gly Lys Lys Arg Lys
180 185 190
Val Ser Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Thr Gly Glu Leu Ala Gln His
195 200 205
Leu Thr Tyr Leu Glu Phe Arg Ser Phe Gln Ala Ile Thr Pro Gln Asp
210 215 220
Leu Arg Ser Tyr Val Leu Gln Gly Ser Val Arg Gly Cys Pro Ala Leu
225 230 235 240
Glu Gly Ser Val Gly Leu Ser Asn Ser Val Ser Arg Trp Val Gln Val
245 250 255
Met Val Leu Ser Arg Pro Gly Pro Leu Gln Arg Ala Gln Val Leu Asp
260 265 270
Lys Phe Ile His Val Ala Gln Arg Leu His Gln Leu Gln Asn Phe Asn
275 280 285
Thr Leu Met Ala Val Thr Gly Gly Leu Cys His Ser Ala Ile Ser Arg
290 295 300
Leu Lys Asp Ser His Ala His Leu Ser Pro Asp Ser Thr Lys Ala Leu
305 310 315 320
Leu Glu Leu Thr Glu Leu Leu Ala Ser His Asn Asn Tyr Ala Arg Tyr
325 330 335
Arg Arg Thr Trp Ala Gly Cys Ala Gly Phe Arg Leu Pro Val Leu Gly
340 345 350
Val His Leu Lys Asp Leu Val Ser Leu His Glu Ala Gln Pro Asp Arg
355 360 365
Leu Pro Asp Gly Arg Leu His Leu Pro Lys Leu Asn Asn Leu Tyr Leu
370 375 380
Arg Leu Gln Glu Leu Val Ala Leu Gln Gly Gln His Pro Pro Cys Ser
385 390 395 400
Ala Asn Glu Asp Leu Leu His Leu Leu Thr Leu Ser Leu Asp Leu Phe
405 410 415
Tyr Thr Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Leu Ser Tyr Ala Arg Glu Pro Arg
420 425 430
Cys Pro Lys Ser Leu Pro Pro Ser Pro Phe Asn Ala Pro Leu Val Val
435 440 445
Glu Trp Ala Pro Gly Val Thr Pro Lys Pro Asp Arg Val Thr Leu Gly
450 455 460
Arg His Val Glu Gln Leu Val Glu Ser Val Phe Lys Asn Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Glu Gly Arg Gly Thr Ile Ser Gln Glu Asp Phe Glu Arg Leu Ser Gly
485 490 495
Asn Phe Pro Phe Ala Cys His Gly Leu His Pro Pro Pro Arg Gln Gly
500 505 510
Arg Gly Ser Phe Ser Arg Glu Glu Leu Thr Gly Tyr Leu Leu Arg Ala
515 520 525
Ser Ala Ile Cys Ser Lys Leu Gly Leu Ala Phe Leu His Thr Phe His
530 535 540
Glu Val Thr Phe Arg Lys Pro Thr Phe Cys Asp Ser Cys Ser Gly Phe
545 550 555 560
Leu Trp Gly Val Thr Lys Gln Gly Tyr Arg Cys Arg Glu Cys Gly Leu
565 570 575
Cys Cys His Lys His Cys Arg Asp Gln Val Lys Val Glu Cys Lys Lys
580 585 590
Arg Pro Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Val Pro
595 600 605
Ser Thr Pro Ala Pro His Ala Ser Cys Gly Ser Glu Glu Asn His Ser
610 615 620
Tyr Thr Leu Ser Leu Glu Pro Glu Thr Gly Cys Gln Leu Arg His Ala
625 630 635 640
Trp Thr Gln Thr Glu Ser Pro His Pro Ser Trp Glu Thr Asp Thr Val
645 650 655
Pro Cys Pro Val Met Asp Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ser Lys Leu Asp
660 665 670
Ser
<210> 6
<211> 609
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Ala Gly Thr Leu Asp Leu Asp Lys Gly Cys Thr Val Glu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Arg Gly Cys Ile Glu Ala Phe Asp Asp Ser Gly Lys Val Arg Asp
20 25 30
Pro Gln Leu Val Arg Met Phe Leu Met Met His Pro Trp Tyr Ile Pro
35 40 45
Ser Ser Gln Leu Ala Ala Lys Leu Leu His Ile Tyr Gln Gln Ser Arg
50 55 60
Lys Asp Asn Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys Thr Cys His Leu Val Arg
65 70 75 80
Tyr Trp Ile Ser Ala Phe Pro Ala Glu Phe Asp Leu Asn Pro Glu Leu
85 90 95
Ala Glu Gln Ile Lys Glu Leu Lys Ala Leu Leu Asp Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Arg Arg His Ser Ser Leu Ile Asp Ile Asp Ser Val Pro Thr Tyr Lys
115 120 125
Trp Lys Arg Gln Val Thr Gln Arg Asn Pro Val Gly Gln Lys Lys Arg
130 135 140
Lys Met Ser Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Met Glu Leu Ala Glu
145 150 155 160
His Leu Thr Tyr Leu Glu Tyr Arg Ser Phe Cys Lys Ile Leu Phe Gln
165 170 175
Asp Tyr His Ser Phe Val Thr His Gly Cys Thr Val Asp Asn Pro Val
180 185 190
Leu Glu Arg Phe Ile Ser Leu Phe Asn Ser Val Ser Gln Trp Val Gln
195 200 205
Leu Met Ile Leu Ser Lys Pro Thr Ala Pro Gln Arg Ala Leu Val Ile
210 215 220
Thr His Phe Val His Val Ala Glu Lys Leu Leu Gln Leu Gln Asn Phe
225 230 235 240
Asn Thr Leu Met Ala Val Val Gly Gly Leu Ser His Ser Ser Ile Ser
245 250 255
Arg Leu Lys Glu Thr His Ser His Val Ser Pro Glu Thr Ile Lys Leu
260 265 270
Trp Glu Gly Leu Thr Glu Leu Val Thr Ala Thr Gly Asn Tyr Gly Asn
275 280 285
Tyr Arg Arg Arg Leu Ala Ala Cys Val Gly Phe Arg Phe Pro Ile Leu
290 295 300
Gly Val His Leu Lys Asp Leu Val Ala Leu Gln Leu Ala Leu Pro Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asp Pro Ala Arg Thr Arg Leu Asn Gly Ala Lys Met Lys Gln
325 330 335
Leu Phe Ser Ile Leu Glu Glu Leu Ala Met Val Thr Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Pro Val Gln Ala Asn Pro Asp Leu Leu Ser Leu Leu Thr Val Ser Leu
355 360 365
Asp Gln Tyr Gln Thr Glu Asp Glu Leu Tyr Gln Leu Ser Leu Gln Arg
370 375 380
Glu Pro Arg Ser Lys Ser Ser Pro Thr Ser Pro Thr Ser Cys Thr Pro
385 390 395 400
Pro Pro Arg Pro Pro Val Leu Glu Glu Trp Thr Ser Ala Ala Lys Pro
405 410 415
Lys Leu Asp Gln Ala Leu Val Val Glu His Ile Glu Lys Met Val Glu
420 425 430
Ser Val Phe Arg Asn Phe Asp Val Asp Gly Asp Gly His Ile Ser Gln
435 440 445
Glu Glu Phe Gln Ile Ile Arg Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Phe
450 455 460
Gly Asp Leu Asp Gln Asn Gln Asp Gly Cys Ile Ser Arg Glu Glu Met
465 470 475 480
Val Ser Tyr Phe Leu Arg Ser Ser Ser Val Leu Gly Gly Arg Met Gly
485 490 495
Phe Val His Asn Phe Gln Glu Ser Asn Ser Leu Arg Pro Val Ala Cys
500 505 510
Arg His Cys Lys Ala Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Lys Gln Gly Leu Lys
515 520 525
Cys Arg Ala Cys Gly Val Asn Cys His Lys Gln Cys Lys Asp Arg Leu
530 535 540
Ser Val Glu Cys Arg Arg Arg Ala Gln Ser Val Ser Leu Glu Gly Ser
545 550 555 560
Ala Pro Ser Pro Ser Pro Met His Ser His His His Arg Ala Phe Ser
565 570 575
Phe Ser Leu Pro Arg Pro Gly Arg Arg Gly Ser Arg Pro Pro Glu Ile
580 585 590
Arg Glu Glu Glu Val Gln Thr Val Glu Asp Gly Val Phe Asp Ile His
595 600 605
Leu
<210> 7
<211> 671
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Gly Thr Gln Arg Leu Cys Gly Arg Gly Thr Gln Gly Trp Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ser Glu Gln His Val Gln Glu Ala Thr Ser Ser Ala Gly Leu His
20 25 30
Ser Gly Val Asp Glu Leu Gly Val Arg Ser Glu Pro Gly Gly Arg Leu
35 40 45
Pro Glu Arg Ser Leu Gly Pro Ala His Pro Ala Pro Ala Ala Met Ala
50 55 60
Gly Thr Leu Asp Leu Asp Lys Gly Cys Thr Val Glu Glu Leu Leu Arg
65 70 75 80
Gly Cys Ile Glu Ala Phe Asp Asp Ser Gly Lys Val Arg Asp Pro Gln
85 90 95
Leu Val Arg Met Phe Leu Met Met His Pro Trp Tyr Ile Pro Ser Ser
100 105 110
Gln Leu Ala Ala Lys Leu Leu His Ile Tyr Gln Gln Ser Arg Lys Asp
115 120 125
Asn Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys Thr Cys His Leu Val Arg Tyr Trp
130 135 140
Ile Ser Ala Phe Pro Ala Glu Phe Asp Leu Asn Pro Glu Leu Ala Glu
145 150 155 160
Gln Ile Lys Glu Leu Lys Ala Leu Leu Asp Gln Glu Gly Asn Arg Arg
165 170 175
His Ser Ser Leu Ile Asp Ile Asp Ser Val Pro Thr Tyr Lys Trp Lys
180 185 190
Arg Gln Val Thr Gln Arg Asn Pro Val Gly Gln Lys Lys Arg Lys Met
195 200 205
Ser Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Met Glu Leu Ala Glu His Leu
210 215 220
Thr Tyr Leu Glu Tyr Arg Ser Phe Cys Lys Ile Leu Phe Gln Asp Tyr
225 230 235 240
His Ser Phe Val Thr His Gly Cys Thr Val Asp Asn Pro Val Leu Glu
245 250 255
Arg Phe Ile Ser Leu Phe Asn Ser Val Ser Gln Trp Val Gln Leu Met
260 265 270
Ile Leu Ser Lys Pro Thr Ala Pro Gln Arg Ala Leu Val Ile Thr His
275 280 285
Phe Val His Val Ala Glu Lys Leu Leu Gln Leu Gln Asn Phe Asn Thr
290 295 300
Leu Met Ala Val Val Gly Gly Leu Ser His Ser Ser Ile Ser Arg Leu
305 310 315 320
Lys Glu Thr His Ser His Val Ser Pro Glu Thr Ile Lys Leu Trp Glu
325 330 335
Gly Leu Thr Glu Leu Val Thr Ala Thr Gly Asn Tyr Gly Asn Tyr Arg
340 345 350
Arg Arg Leu Ala Ala Cys Val Gly Phe Arg Phe Pro Ile Leu Gly Val
355 360 365
His Leu Lys Asp Leu Val Ala Leu Gln Leu Ala Leu Pro Asp Trp Leu
370 375 380
Asp Pro Ala Arg Thr Arg Leu Asn Gly Ala Lys Met Lys Gln Leu Phe
385 390 395 400
Ser Ile Leu Glu Glu Leu Ala Met Val Thr Ser Leu Arg Pro Pro Val
405 410 415
Gln Ala Asn Pro Asp Leu Leu Ser Leu Leu Thr Val Ser Leu Asp Gln
420 425 430
Tyr Gln Thr Glu Asp Glu Leu Tyr Gln Leu Ser Leu Gln Arg Glu Pro
435 440 445
Arg Ser Lys Ser Ser Pro Thr Ser Pro Thr Ser Cys Thr Pro Pro Pro
450 455 460
Arg Pro Pro Val Leu Glu Glu Trp Thr Ser Ala Ala Lys Pro Lys Leu
465 470 475 480
Asp Gln Ala Leu Val Val Glu His Ile Glu Lys Met Val Glu Ser Val
485 490 495
Phe Arg Asn Phe Asp Val Asp Gly Asp Gly His Ile Ser Gln Glu Glu
500 505 510
Phe Gln Ile Ile Arg Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Phe Gly Asp
515 520 525
Leu Asp Gln Asn Gln Asp Gly Cys Ile Ser Arg Glu Glu Met Val Ser
530 535 540
Tyr Phe Leu Arg Ser Ser Ser Val Leu Gly Gly Arg Met Gly Phe Val
545 550 555 560
His Asn Phe Gln Glu Ser Asn Ser Leu Arg Pro Val Ala Cys Arg His
565 570 575
Cys Lys Ala Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Lys Gln Gly Leu Lys Cys Arg
580 585 590
Ala Cys Gly Val Asn Cys His Lys Gln Cys Lys Asp Arg Leu Ser Val
595 600 605
Glu Cys Arg Arg Arg Ala Gln Ser Val Ser Leu Glu Gly Ser Ala Pro
610 615 620
Ser Pro Ser Pro Met His Ser His His His Arg Ala Phe Ser Phe Ser
625 630 635 640
Leu Pro Arg Pro Gly Arg Arg Gly Ser Arg Pro Pro Glu Ile Arg Glu
645 650 655
Glu Glu Val Gln Thr Val Glu Asp Gly Val Phe Asp Ile His Leu
660 665 670
<210> 8
<211> 144
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Ala Gly Thr Leu Asp Leu Asp Lys Gly Cys Thr Val Glu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Arg Gly Cys Ile Glu Ala Phe Asp Asp Ser Gly Lys Val Arg Asp
20 25 30
Pro Gln Leu Val Arg Met Phe Leu Met Met His Pro Trp Tyr Ile Pro
35 40 45
Ser Ser Gln Leu Ala Ala Lys Leu Leu His Ile Tyr Gln Gln Ser Arg
50 55 60
Lys Asp Asn Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys Thr Cys His Leu Val Arg
65 70 75 80
Tyr Trp Ile Ser Ala Phe Pro Ala Glu Phe Asp Leu Asn Pro Glu Leu
85 90 95
Ala Glu Gln Ile Lys Glu Leu Lys Ala Leu Leu Asp Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Arg Arg His Ser Ser Leu Ile Asp Ile Asp Ser Val Cys Val Gly Ala
115 120 125
Glu His Arg Gly Leu Gly Gly His Ser Val Ser Tyr Thr Ile Cys Ala
130 135 140
<210> 9
<211> 610
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Ala Gly Thr Leu Asp Leu Asp Lys Gly Cys Thr Val Glu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Arg Gly Cys Ile Glu Ala Phe Asp Asp Ser Gly Lys Val Arg Asp
20 25 30
Pro Gln Leu Val Arg Met Phe Leu Met Met His Pro Trp Tyr Ile Pro
35 40 45
Ser Ser Gln Leu Ala Ala Lys Leu Leu His Ile Tyr Gln Gln Ser Arg
50 55 60
Lys Asp Asn Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys Thr Cys His Leu Val Arg
65 70 75 80
Tyr Trp Ile Ser Ala Phe Pro Ala Glu Phe Asp Leu Asn Pro Glu Leu
85 90 95
Ala Glu Gln Ile Lys Glu Leu Lys Ala Leu Leu Asp Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Arg Arg His Ser Ser Leu Ile Asp Ile Asp Ser Val Pro Thr Tyr Lys
115 120 125
Trp Lys Arg Gln Val Thr Gln Arg Asn Pro Val Gly Gln Lys Lys Arg
130 135 140
Lys Met Ser Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Met Glu Leu Ala Glu
145 150 155 160
His Leu Thr Tyr Leu Glu Tyr Arg Ser Phe Cys Lys Ile Leu Phe Gln
165 170 175
Asp Tyr His Ser Phe Val Thr His Gly Cys Thr Val Asp Asn Pro Val
180 185 190
Leu Glu Arg Phe Ile Ser Leu Phe Asn Ser Val Ser Gln Trp Val Gln
195 200 205
Leu Met Ile Leu Ser Lys Pro Thr Ala Pro Gln Arg Ala Leu Val Ile
210 215 220
Thr His Phe Val His Val Ala Glu Lys Leu Leu Gln Leu Gln Asn Phe
225 230 235 240
Asn Thr Leu Met Ala Val Val Gly Gly Leu Ser His Ser Ser Ile Ser
245 250 255
Arg Leu Lys Glu Thr His Ser His Val Ser Pro Glu Thr Ile Lys Leu
260 265 270
Trp Glu Gly Leu Thr Glu Leu Val Thr Ala Thr Gly Asn Tyr Gly Asn
275 280 285
Tyr Arg Arg Arg Leu Ala Ala Cys Val Gly Phe Arg Phe Pro Ile Leu
290 295 300
Gly Val His Leu Lys Asp Leu Val Ala Leu Gln Leu Ala Leu Pro Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asp Pro Ala Arg Thr Arg Leu Asn Gly Ala Lys Met Lys Gln
325 330 335
Leu Phe Ser Ile Leu Glu Glu Leu Ala Met Val Thr Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Pro Val Gln Ala Asn Pro Asp Leu Leu Ser Leu Leu Thr Val Ser Leu
355 360 365
Asp Gln Tyr Gln Thr Glu Asp Glu Leu Tyr Gln Leu Ser Leu Gln Arg
370 375 380
Glu Pro Arg Ser Lys Ser Ser Pro Thr Ser Pro Thr Ser Cys Thr Pro
385 390 395 400
Pro Pro Arg Pro Pro Val Leu Glu Glu Trp Thr Ser Ala Ala Lys Pro
405 410 415
Lys Leu Asp Gln Ala Leu Val Val Glu His Ile Glu Lys Met Val Glu
420 425 430
Ser Val Phe Arg Asn Phe Asp Val Asp Gly Asp Gly His Ile Ser Gln
435 440 445
Glu Glu Phe Gln Ile Ile Arg Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Phe
450 455 460
Gly Asp Leu Asp Gln Asn Gln Asp Gly Cys Ile Ser Arg Glu Glu Met
465 470 475 480
Val Ser Tyr Phe Leu Arg Ser Ser Ser Val Leu Gly Gly Arg Met Gly
485 490 495
Phe Val His Asn Phe Gln Glu Ser Asn Ser Leu Arg Pro Val Ala Cys
500 505 510
Arg His Cys Lys Ala Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Lys Gln Gly Leu Lys
515 520 525
Cys Arg Ala Cys Gly Val Asn Cys His Lys Gln Cys Lys Asp Arg Leu
530 535 540
Ser Val Glu Cys Arg Arg Arg Ala Gln Ser Val Ser Leu Glu Gly Ser
545 550 555 560
Ala Pro Ser Pro Ser Pro Met His Ser His His His Arg Ala Phe Ser
565 570 575
Phe Ser Leu Pro Arg Pro Gly Arg Arg Gly Ser Arg Pro Pro Ala Glu
580 585 590
Ile Arg Glu Glu Glu Val Gln Thr Val Glu Asp Gly Val Phe Asp Ile
595 600 605
His Leu
610
<210> 10
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 11
Val Val Ala Asp Gly Ala Gly Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 12
Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr His
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 13
Leu Phe Arg Asn Ile Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 14
Val His Met Asn Asp Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 16
Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val
1 5 10 15
<210> 18
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 18
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 19
Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu Thr Met Ile His Asn Gly Pro
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 20
Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 21
Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser Tyr Ala Lys Arg Met Ile
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 22
Ala Tyr Phe Gln Gln Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 23
Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 24
Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 25
Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile Ile Leu Ser Val Gly
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 26
Glu Val Glu Pro Ile Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 27
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 28
Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala Glu Ala Val Val
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 29
Ser Ile Lys Glu Ala Ala Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 30
Ala Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 31
Phe Asp Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 32
Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala Val Lys Glu Thr Cys Ala
1 5 10 15
<210> 33
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 33
Leu Val Arg Tyr Trp Ile Ser Ala Phe Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 34
Phe Val Arg Tyr Trp Ile Thr Glu Phe Trp
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 35
Phe Met Arg Tyr Trp Ile Leu Lys Phe Pro
1 5 10
<210> 36
<211> 23
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 36
Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Met Glu Leu Ala Glu His Leu Thr
1 5 10 15
Tyr Leu Glu Tyr Arg Ser Phe
20
<210> 37
<211> 28
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 37
Asn Phe Asn Thr Leu Met Ala Val Val Gly Gly Leu Ser His Ser Ser
1 5 10 15
Ile Ser Arg Leu Lys Glu Thr His Ser His Val Ser
20 25
<210> 38
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 38
Pro Ala Ala Met Ala Gly Thr Leu Asp Leu Asp Lys Gly Cys Thr
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 39
Asp Lys Gly Cys Thr Val Glu Glu Leu Leu Arg Gly Cys Ile Glu
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 40
Arg Gly Cys Ile Glu Ala Phe Asp Asp Ser Gly Lys Val Arg Asp
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 41
Gly Lys Val Arg Asp Pro Gln Leu Val Arg Met Phe Leu Met Met
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 42
Met Phe Leu Met Met His Pro Trp Tyr Ile Pro Ser Ser Gln Leu
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 43
Pro Ser Ser Gln Leu Ala Ala Lys Leu Leu His Ile Tyr Gln Gln
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 44
His Ile Tyr Gln Gln Ser Arg Lys Asp Asn Ser Asn Ser Leu Gln
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 45
Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys Thr Cys His Leu Val Arg Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 46
Leu Val Arg Tyr Trp Ile Ser Ala Phe Pro Ala Glu Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 47
Ala Glu Phe Asp Leu Asn Pro Glu Leu Ala Glu Gln Ile Lys Glu
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 48
Glu Gln Ile Lys Glu Leu Lys Ala Leu Leu Asp Gln Glu Gly Asn
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 49
Asp Gln Glu Gly Asn Arg Arg His Ser Ser Leu Ile Asp Ile Asp
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 50
Leu Ile Asp Ile Asp Ser Val Pro Thr Tyr Lys Trp Lys Arg Gln
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 51
Lys Trp Lys Arg Gln Val Thr Gln Arg Asn Pro Val Gly Gln Lys
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 52
Pro Val Gly Gln Lys Lys Arg Lys Met Ser Leu Leu Phe Asp His
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 53
Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Met Glu Leu Ala Glu His Leu
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 54
Leu Ala Glu His Leu Thr Tyr Leu Glu Tyr Arg Ser Phe Cys Lys
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 55
Arg Ser Phe Cys Lys Ile Leu Phe Gln Asp Tyr His Ser Phe Val
1 5 10 15
<210> 56
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 56
Tyr His Ser Phe Val Thr His Gly Cys Thr Val Asp Asn Pro Val
1 5 10 15
<210> 57
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 57
Val Asp Asn Pro Val Leu Glu Arg Phe Ile Ser Leu Phe Asn Ser
1 5 10 15
<210> 58
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 58
Ser Leu Phe Asn Ser Val Ser Gln Trp Val Gln Leu Met Ile Leu
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 59
Gln Leu Met Ile Leu Ser Lys Pro Thr Ala Pro Gln Arg Ala Leu
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 60
Pro Gln Arg Ala Leu Val Ile Thr His Phe Val His Val Ala Glu
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 61
Val His Val Ala Glu Lys Leu Leu Gln Leu Gln Asn Phe Asn Thr
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 62
Gln Asn Phe Asn Thr Leu Met Ala Val Val Gly Gly Leu Ser His
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 63
Gly Gly Leu Ser His Ser Ser Ile Ser Arg Leu Lys Glu Thr His
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 64
Leu Lys Glu Thr His Ser His Val Ser Pro Glu Thr Ile Lys Leu
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 65
Glu Thr Ile Lys Leu Trp Glu Gly Leu Thr Glu Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 66
Glu Leu Val Thr Ala Thr Gly Asn Tyr Gly Asn Tyr Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 67
Asn Tyr Arg Arg Arg Leu Ala Ala Cys Val Gly Phe Arg Phe Pro
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 68
Gly Phe Arg Phe Pro Ile Leu Gly Val His Leu Lys Asp Leu Val
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 69
Leu Lys Asp Leu Val Ala Leu Gln Leu Ala Leu Pro Asp Trp Leu
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 70
Leu Pro Asp Trp Leu Asp Pro Ala Arg Thr Arg Leu Asn Gly Ala
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 71
Arg Leu Asn Gly Ala Lys Met Lys Gln Leu Phe Ser Ile Leu Glu
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 72
Phe Ser Ile Leu Glu Glu Leu Ala Met Val Thr Ser Leu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 73
Thr Ser Leu Arg Pro Pro Val Gln Ala Asn Pro Asp Leu Leu Ser
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 74
Pro Asp Leu Leu Ser Leu Leu Thr Val Ser Leu Asp Gln Tyr Gln
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 75
Leu Asp Gln Tyr Gln Thr Glu Asp Glu Leu Tyr Gln Leu Ser Leu
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 76
Tyr Gln Leu Ser Leu Gln Arg Glu Pro Arg Ser Lys Ser Ser Pro
1 5 10 15
<210> 77
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 77
Ser Lys Ser Ser Pro Thr Ser Pro Thr Ser Cys Thr Pro Pro Pro
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 78
Cys Thr Pro Pro Pro Arg Pro Pro Val Leu Glu Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 79
Glu Glu Trp Thr Ser Ala Ala Lys Pro Lys Leu Asp Gln Ala Leu
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 80
Leu Asp Gln Ala Leu Val Val Glu His Ile Glu Lys Met Val Glu
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 81
Glu Lys Met Val Glu Ser Val Phe Arg Asn Phe Asp Val Asp Gly
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 82
Phe Asp Val Asp Gly Asp Gly His Ile Ser Gln Glu Glu Phe Gln
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 83
Gln Glu Glu Phe Gln Ile Ile Arg Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 84
Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Phe Gly Asp Leu Asp Gln Asn Gln Asp
1 5 10 15
<210> 85
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 85
Asp Gln Asn Gln Asp Gly Cys Ile Ser Arg Glu Glu Met Val Ser
1 5 10 15
<210> 86
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 86
Glu Glu Met Val Ser Tyr Phe Leu Arg Ser Ser Ser Val Leu Gly
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 87
Ser Ser Val Leu Gly Gly Arg Met Gly Phe Val His Asn Phe Gln
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 88
Val His Asn Phe Gln Glu Ser Asn Ser Leu Arg Pro Val Ala Cys
1 5 10 15
<210> 89
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 89
Arg Pro Val Ala Cys Arg His Cys Lys Ala Leu Ile Leu Gly Ile
1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 90
Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Lys Gln Gly Leu Lys Cys Arg Ala Cys
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 91
Lys Cys Arg Ala Cys Gly Val Asn Cys His Lys Gln Cys Lys Asp
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 92
Lys Gln Cys Lys Asp Arg Leu Ser Val Glu Cys Arg Arg Arg Ala
1 5 10 15
<210> 93
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 93
Cys Arg Arg Arg Ala Gln Ser Val Ser Leu Glu Gly Ser Ala Pro
1 5 10 15
<210> 94
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 94
Glu Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Pro Met His Ser His His His
1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 95
His Ser His His His Arg Ala Phe Ser Phe Ser Leu Pro Arg Pro
1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 96
Ser Leu Pro Arg Pro Gly Arg Arg Gly Ser Arg Pro Pro Glu Ile
1 5 10 15
<210> 97
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 97
Arg Pro Pro Glu Ile Arg Glu Glu Glu Val Gln Thr Val Glu Asp
1 5 10 15
<210> 98
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 98
Glu Glu Val Gln Thr Val Glu Asp Gly Val Phe Asp Ile His Leu
1 5 10 15
<210> 99
<211> 7
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<221> прочий_признак
<222> (4)..(4)
<223> Хаа может быть любой природной аминокислотой
<400> 99
Leu His Ser Xaa Phe Glu Val
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 100
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val
1 5
<210> 101
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 101
Arg Lys Leu His Ser Phe Tyr Glu Val Lys
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 102
Leu Lys Leu His Ser Arg Phe Tyr Glu Leu
1 5 10
<210> 103
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 103
Gln Lys Lys His Ser Gly Phe Glu Asp Glu
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 104
Leu Ala Leu His Ser Val Phe Glu Gly Leu
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 105
Arg Arg Leu His Ser Pro Pro Glu Val Glu
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 106
Leu Ser Leu His Arg Met Phe Glu Val Val
1 5 10
<210> 107
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 107
Gln Lys Leu His Leu His Phe Glu Arg Leu
1 5 10
<210> 108
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 108
Gln Arg Leu His Leu His Phe Glu Lys Val
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 109
Leu Leu Leu His Ser Ile Phe Glu Leu Asn
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 110
Asn Gly Leu His Ser His Ser Glu Val Leu
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 111
Arg Arg Leu His Leu His Phe Glu Arg Val
1 5 10
<210> 112
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 112
Leu Arg Leu His Ser Pro Pro Glu Val Thr
1 5 10
<210> 113
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 113
Ser His Leu His Ser Leu Phe Arg Val Leu
1 5 10
<210> 114
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 114
Val Glu Leu His Ser His Ser Glu Val Pro
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 115
Gly His Leu His Ser Gln Leu Glu Val Ser
1 5 10
<210> 116
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 116
Glu Lys Lys Val Ser Ser Phe Glu Val Phe
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 117
Asp Gly Leu His Ser Ser Asn Glu Val Leu
1 5 10
<210> 118
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 118
Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 119
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 119
Phe Thr Pro His Ser Arg Phe Glu Val Leu
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ile Lys Leu Pro Ser Ser Phe Glu Lys Trp
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 121
Val Met Leu Leu Ser Leu Phe Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 122
Phe Ala Leu His Ser Leu Phe Glu Ala Lys
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 123
Arg Lys Leu Lys Ala Ser Phe Glu Val Ser
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 124
Lys Ala Leu His Ser Asp Phe Ile Val Lys
1 5 10
<210> 125
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 125
Lys Lys Leu Arg Ser Ser Phe Glu Ser Ser
1 5 10
<210> 126
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 126
Leu Gln Leu His Ser Pro Phe Glu Arg Gly
1 5 10
<210> 127
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 127
Arg Lys Cys His Ser Ser Gly Glu Val Gln
1 5 10
<210> 128
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 128
Arg Lys Leu Leu Ser Asp Phe Pro Val Val
1 5 10
<210> 129
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 129
Lys Lys Arg His Ser Tyr Phe Glu Lys Pro
1 5 10
<210> 130
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 130
Val His Leu His Ser Phe Phe Ala Val Gly
1 5 10
<210> 131
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 131
Glu Ala Leu Leu Ser Gly Phe Glu Val Ile
1 5 10
<210> 132
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 132
Glu Lys Leu Phe Ser Gln Phe Glu Val Asp
1 5 10
<210> 133
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 133
Gly Asp Leu Lys Ser Gly Phe Glu Glu Val
1 5 10
<210> 134
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 134
Lys Gly Leu His Ser Lys Lys Glu Val Pro
1 5 10
<210> 135
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 135
Glu Phe Leu Ala Ser Ser Phe Glu Val Ser
1 5 10
<210> 136
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 136
Gly Val Leu His Ser Lys Phe Trp Val Val
1 5 10
<210> 137
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 137
Lys Gln Leu Val His His Phe Glu Val Asp
1 5 10
<210> 138
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 138
Arg His Leu His Ser Val Leu Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 139
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 139
Arg Leu Leu Ser Ser Gly Phe Glu Glu Val
1 5 10
<210> 140
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 140
Gln Met Leu His Pro Ile Phe Glu Glu Ala
1 5 10
<210> 141
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 141
Arg Arg Leu His Ser Thr His Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 142
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 142
Arg Lys Leu His Trp Leu Phe Glu Leu Leu
1 5 10
<210> 143
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 143
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr
1 5 10
<210> 144
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 144
Arg Lys Leu Leu His Arg Phe Glu Thr Glu
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 145
Asn Lys Leu Ile Ser Glu Phe Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 146
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 146
Ser Lys Leu Val Ser Asn Lys Glu Val Val
1 5 10
<210> 147
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 147
Leu Leu Leu His Ser Leu Phe Pro Val Pro
1 5 10
<210> 148
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 148
Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 149
Arg Phe Lys His Ser Ser Thr Glu Val Leu
1 5 10
<210> 150
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 150
Arg Arg Lys Leu His Ser Phe Tyr Glu Val
1 5 10
<210> 151
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 151
Arg Lys Leu Leu Ser Ser Gly Phe Glu Ile
1 5 10
<210> 152
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 152
Arg Arg Leu Leu Ser Ser Gly Phe Glu Glu
1 5 10
<210> 153
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 153
Arg Lys Lys Leu His Lys Phe Glu Glu Thr
1 5 10
<210> 154
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 154
Leu Lys Lys Leu His Asp Phe Glu Glu Gln
1 5 10
<210> 155
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 155
Gly Leu Leu Leu His Ser Ile Phe Glu Leu
1 5 10
<210> 156
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 156
Gln Lys Lys Leu His Asp Phe Glu Glu Gln
1 5 10
<210> 157
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 157
Gln Lys Lys Leu Ser Ser Gly Glu Glu Lys
1 5 10
<210> 158
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 158
Arg Lys His Leu His Ser Gly Gln Glu Ala
1 5 10
<210> 159
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 159
Gln Lys Leu Val His Ser Leu Phe Glu Ser
1 5 10
<210> 160
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 160
Cys Tyr Leu Leu His Ser Phe Glu Glu Phe
1 5 10
<210> 161
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 161
Ser Lys Thr Leu His Ser Val Glu Glu Lys
1 5 10
<210> 162
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 162
Leu Lys Arg Leu His Glu Phe Glu Glu Gln
1 5 10
<210> 163
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 163
Val Lys Glu Leu His Ser Ala Glu Glu Gly
1 5 10
<210> 164
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 164
Ser Leu Leu Leu His Ser Gln Glu Glu Lys
1 5 10
<210> 165
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 165
Ala Val His Leu His Ser Gly Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 166
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 166
His Thr Arg Leu His Ser Gly Glu Glu Pro
1 5 10
<210> 167
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 167
Met Pro Leu Leu His Ala Ile Phe Glu Val
1 5 10
<210> 168
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 168
Glu Lys Lys Arg His Ser Tyr Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 169
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 169
Gln Ala Lys Leu His Ser Gln Glu Glu Asp
1 5 10
<210> 170
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 170
Gln Gln Lys Lys His Ser Gly Phe Glu Asp
1 5 10
<210> 171
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 171
Leu Lys Lys Leu His Gln Gln Phe Glu Met
1 5 10
<210> 172
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 172
Lys Leu Leu Leu His Ser Gly Val Glu Asn
1 5 10
<210> 173
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 173
Phe Ser Lys Leu His Thr Phe Glu Glu Val
1 5 10
<210> 174
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 174
Gln Ala Lys Leu Ser Ser Phe Glu Glu Thr
1 5 10
<210> 175
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 175
Ser Leu Ala Leu His Ser Val Phe Glu Gly
1 5 10
<210> 176
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 176
Glu Phe Ala Leu His Ser Leu Phe Glu Ala
1 5 10
<210> 177
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 177
Met Arg His Leu Lys Ser Phe Phe Glu Ala
1 5 10
<210> 178
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 178
Gln Lys Lys Arg His Ser Phe Leu Glu Ser
1 5 10
<210> 179
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 179
Gln Lys Lys Leu His His Phe Phe Ile Gly
1 5 10
<210> 180
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 180
Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu
1 5 10
<210> 181
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 181
Leu Arg Leu Phe His Ser Phe Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 182
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 182
Gln Lys Phe Leu His Ser Ser Phe Val Ala
1 5 10
<210> 183
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 183
Ala Trp Leu Leu His Ser Gly Pro Glu Gly
1 5 10
<210> 184
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 184
Thr Lys Leu Leu His Arg Thr Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 185
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 185
Phe Lys Thr Leu Ser Ser Lys Phe Glu Leu
1 5 10
<210> 186
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 186
Lys Arg Arg Leu His Leu Val Phe Glu Tyr
1 5 10
<210> 187
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 187
Glu His Leu Leu Asn Ser Gly Phe Glu Val
1 5 10
<210> 188
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 188
Val Met Lys Leu Leu Ser Ile Phe Glu Ser
1 5 10
<210> 189
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 189
Lys Leu Glu Leu His Ser Ser Glu Glu Ala
1 5 10
<210> 190
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 190
Lys Leu Pro Leu His Ser Ser Glu Glu Ala
1 5 10
<210> 191
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 191
Leu Lys Arg Leu Leu Ser Asn Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 192
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 192
Thr Thr Arg Leu His Ser Leu Glu Glu Lys
1 5 10
<210> 193
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 193
His Ala Arg Leu His Ser Leu Glu Glu Thr
1 5 10
<210> 194
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 194
Leu Pro Arg Leu His Gly His Phe Glu Gln
1 5 10
<210> 195
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 195
Val Lys Thr Leu His His Lys Glu Glu Val
1 5 10
<210> 196
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 196
Ser Pro Ser Leu His Ser Arg Glu Glu Ala
1 5 10
<210> 197
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 197
Pro Arg Lys Leu His Trp Leu Phe Glu Leu
1 5 10
<210> 198
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 198
Leu Lys Lys Leu Leu Ser Phe Ala Glu Asn
1 5 10
<210> 199
<211> 12
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 199
Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val Gly Lys
1 5 10
<210> 200
<211> 19
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 200
Val Val Ala Asp Gly Ala Gly Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val
1 5 10 15
Ser Ser Lys
<210> 201
<211> 11
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 201
Asp Ala Asp Leu Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg
1 5 10
<210> 202
<211> 18
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 202
Val Gln Pro Thr His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu
1 5 10 15
Phe Arg
<210> 203
<211> 7
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 203
Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg
1 5
<210> 204
<211> 8
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 204
Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys
1 5
<210> 205
<211> 18
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 205
Asn Val His Met Asn Asp Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 206
<211> 19
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 206
Asn Val His Met Asn Asp Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly
1 5 10 15
Ala Arg Lys
<210> 207
<211> 13
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 207
Val Val Ser Cys Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys
1 5 10
<210> 208
<211> 7
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 208
Met Ile Asp Val Gln Asn Arg
1 5
<210> 209
<211> 8
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 209
Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg
1 5
<210> 210
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 210
Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp Gly Thr Gly Asn Pro Arg
1 5 10 15
<210> 211
<211> 16
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 211
Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg
1 5 10 15
<210> 212
<211> 26
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 212
Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His
1 5 10 15
Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser Tyr Ala Lys
20 25
<210> 213
<211> 21
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 213
Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp
1 5 10 15
Glu Val Ser Ile Lys
20
<210> 214
<211> 7
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 214
Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg
1 5
<210> 215
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 215
Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg
1 5
<210> 216
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 216
Gly Ser Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val Gly
1 5 10 15
<210> 217
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 217
Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys
1 5 10 15
<210> 218
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 218
Ser Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly
1 5 10 15
<210> 219
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 219
Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly Leu Pro Gly
1 5 10 15
<210> 220
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 220
Ala Gly Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp
1 5 10 15
<210> 221
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 221
Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu Thr Asp
1 5 10 15
<210> 222
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 222
Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg
1 5 10 15
<210> 223
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 223
Ala Asp Leu Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
<210> 224
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 224
Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr His Val Ile His Leu Ala
1 5 10 15
<210> 225
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 225
Val Gln Pro Thr His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly
1 5 10 15
<210> 226
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 226
Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
1 5 10 15
<210> 227
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 227
Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile Lys Tyr Asn Leu Asp
1 5 10 15
<210> 228
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 228
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp
1 5 10 15
<210> 229
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 229
Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp Asn Val Leu His Ser
1 5 10 15
<210> 230
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 230
Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val
1 5 10 15
<210> 231
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 231
Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val Ser Cys Leu Ser Thr
1 5 10 15
<210> 232
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 232
Ala Arg Lys Val Val Ser Cys Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp
1 5 10 15
<210> 233
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 233
Ser Cys Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro
1 5 10 15
<210> 234
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 234
Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu Thr Met
1 5 10 15
<210> 235
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 235
Ile Asp Glu Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn
1 5 10 15
<210> 236
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 236
Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser Tyr Ala Lys Arg Met Ile
1 5 10 15
<210> 237
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 237
Phe Gly Tyr Ser Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg
1 5 10 15
<210> 238
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 238
Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln
1 5 10 15
<210> 239
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 239
Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln Tyr Gly Cys Thr Phe
1 5 10 15
<210> 240
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 240
Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro His Asp Asn Phe
1 5 10 15
<210> 241
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 241
Thr Asn Val Phe Gly Pro His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly
1 5 10 15
<210> 242
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 242
Pro His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly
1 5 10 15
<210> 243
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 243
Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile His Lys Val
1 5 10 15
<210> 244
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 244
His Val Leu Pro Gly Leu Ile His Lys Val His Leu Ala Lys Ser
1 5 10 15
<210> 245
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 245
Leu Ile His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
<210> 246
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 246
His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp Gly Thr
1 5 10 15
<210> 247
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 247
Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg
1 5 10 15
<210> 248
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 248
Thr Val Trp Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 249
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 249
Gly Asn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala Gln
1 5 10 15
<210> 250
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 250
Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala Gln Leu Phe Ile Trp Val
1 5 10 15
<210> 251
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 251
Leu Asp Leu Ala Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn
1 5 10 15
<210> 252
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 252
Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
1 5 10 15
<210> 253
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 253
Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr Phe Asp Thr Thr Lys
1 5 10 15
<210> 254
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 254
His Gly Glu Val Thr Phe Asp Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe
1 5 10 15
<210> 255
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 255
Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys Leu Arg
1 5 10 15
<210> 256
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 256
Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp
1 5 10 15
<210> 257
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 257
Asn Ser Lys Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro
1 5 10 15
<210> 258
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 258
Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala Val
1 5 10 15
<210> 259
<211> 15
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 259
Phe Lys Gln Ala Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn
1 5 10 15
<210> 260
<211> 16
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 260
Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg Lys
1 5 10 15
<210> 261
<211> 20
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 261
Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val
1 5 10 15
Gly Asp Glu Val
20
<210> 262
<211> 21
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 262
Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu
1 5 10 15
Tyr Arg Asn Gly Lys
20
<210> 263
<211> 20
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 263
Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe
1 5 10 15
Leu Pro Arg His
20
<210> 264
<211> 17
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 264
Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 265
<211> 19
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 265
Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Gly
<210> 266
<211> 25
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 266
Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser
1 5 10 15
Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg
20 25
<210> 267
<211> 16
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 267
His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly Ile
1 5 10 15
<210> 268
<211> 11
<212> Белок
<213> Influenza A virus
<400> 268
Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 269
<211> 15
<212> Белок
<213> Вирус гриппа A
<400> 269
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val
1 5 10 15
<210> 270
<211> 16
<212> Белок
<213> Вирус гриппа A
<400> 270
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser
1 5 10 15
<210> 271
<211> 13
<212> Белок
<213> Вирус гриппа B
<400> 271
Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn
1 5 10
<210> 272
<211> 12
<212> Белок
<213> Clostridium tetani
<400> 272
Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu
1 5 10
<210> 273
<211> 12
<212> Белок
<213> Вирус гриппа A
<400> 273
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 274
<211> 13
<212> Белок
<213> Вирус гриппа A
<400> 274
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 275
<211> 9
<212> Белок
<213> Вирус гриппа A
<400> 275
Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser
1 5
<210> 276
<211> 19
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 276
Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile
1 5 10 15
Ser Arg Gly
<210> 277
<211> 15
<212> Белок
<213> Clostridium tetani
<400> 277
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 278
<211> 14
<212> Белок
<213> Clostridium tetani
<400> 278
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
1 5 10
<210> 279
<211> 21
<212> Белок
<213> Clostridium tetani
<400> 279
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu
20
<210> 280
<211> 13
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 280
Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 281
<211> 16
<212> Белок
<213> Clostridium tetani
<400> 281
Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe
1 5 10 15
<210> 282
<211> 16
<212> Белок
<213> Clostridium tetani
<400> 282
Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys
1 5 10 15
<210> 283
<211> 18
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 283
Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 284
<211> 14
<212> Белок
<213> Цитомегаловирус человека
<400> 284
Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His
1 5 10
<210> 285
<211> 15
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 285
Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 286
<211> 13
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 286
Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln
1 5 10
<210> 287
<211> 16
<212> Белок
<213> Вирус гриппа A
<400> 287
Arg Gly Tyr Phe Lys Met Arg Thr Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser
1 5 10 15
<210> 288
<211> 11
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 288
Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu
1 5 10
<210> 289
<211> 15
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 289
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg
1 5 10 15
<210> 290
<211> 20
<212> Белок
<213> Вирус герпеса человека 4-го типа
<400> 290
Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu
1 5 10 15
Gln Thr His Ile
20
<210> 291
<211> 26
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 291
Asp Leu Leu His Ala Pro Glu Glu Gly Pro Phe Thr Phe Pro Asn Gly
1 5 10 15
Glu Ala Val Glu His Gly Glu Glu Ser Lys
20 25
<210> 292
<211> 11
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 292
Ile Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Leu Gln Lys
1 5 10
<210> 293
<211> 23
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 293
Val Ser Leu Leu Phe Asp His Leu Glu Pro Glu Glu Leu Ser Glu His
1 5 10 15
Leu Thr Tyr Leu Glu Phe Lys
20
<210> 294
<211> 11
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 294
Ala Phe Ser Phe Ser Leu Pro Arg Pro Gly Arg
1 5 10
<210> 295
<211> 8
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 295
Ala Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Lys
1 5
<210> 296
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 296
Ala Leu Leu Asp Gln Glu Gly Asn Arg Arg
1 5 10
<210> 297
<211> 13
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 297
Ala Leu Val Ile Thr His Phe Val His Val Ala Glu Lys
1 5 10
<210> 298
<211> 17
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 298
Asp Leu Val Ala Leu Gln Leu Ala Leu Pro Asp Trp Leu Asp Pro Ala
1 5 10 15
Arg
<210> 299
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 299
Asp Asn Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys
1 5
<210> 300
<211> 14
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 300
His Ser Ser Leu Ile Asp Ile Asp Ser Val Pro Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 301
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 301
Lys Asp Asn Ser Asn Ser Leu Gln Val Lys
1 5 10
<210> 302
<211> 12
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 302
Leu Asp Gln Ala Leu Val Val Glu His Ile Glu Lys
1 5 10
<210> 303
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 303
Leu Leu His Ile Tyr Gln Gln Ser Arg
1 5
<210> 304
<211> 24
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 304
Leu Leu Gln Leu Gln Asn Phe Asn Thr Leu Met Ala Val Val Gly Gly
1 5 10 15
Leu Ser His Ser Ser Ile Ser Arg
20
<210> 305
<211> 19
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 305
Leu Trp Glu Gly Leu Thr Glu Leu Val Thr Ala Thr Gly Asn Tyr Gly
1 5 10 15
Asn Tyr Arg
<210> 306
<211> 18
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 306
Met Phe Leu Met Met His Pro Trp Tyr Ile Pro Ser Ser Gln Leu Ala
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 307
<211> 8
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 307
Val Arg Asp Pro Gln Leu Val Arg
1 5
<210> 308
<211> 21
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 308
Tyr Trp Ile Ser Ala Phe Pro Ala Glu Phe Asp Leu Asn Pro Glu Leu
1 5 10 15
Ala Glu Gln Ile Lys
20
<210> 309
<211> 8
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 309
Leu Ser Leu Val Leu Glu Pro Arg
1 5
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| НЕОАНТИГЕНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2813924C2 |
| УНИВЕРСАЛЬНАЯ ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ОБЩИХ ОПУХОЛЕВЫХ НЕОАНТИГЕНОВ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ФОРМ РАКА С МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТЬЮ (MSI) | 2018 |
|
RU2792843C2 |
| ЧАСТИЦЫ, КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ПЕПТИДОМ | 2014 |
|
RU2813163C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛ К СКЛЕРОСТИНУ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕСОВЕРШЕННОГО ОСТЕОГЕНЕЗА | 2017 |
|
RU2789033C2 |
| HPV-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ | 2018 |
|
RU2804664C2 |
| ИСКУССТВЕННЫЕ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2018 |
|
RU2763798C1 |
| АНТИТЕЛА К PD-1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2017 |
|
RU2761640C2 |
| Композиции и способы лечения и предупреждения инфекций, вызванных Staphylococcus aureus | 2015 |
|
RU2764981C1 |
| ПРОКОАГУЛЯНТНЫЕ АНТИТЕЛА | 2018 |
|
RU2810094C2 |
| МОДИФИЦИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА IGG, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ТРАНСФОРМИРУЮЩИМ ФАКТОРОМ РОСТА БЕТА-1 С ВЫСОКОЙ АФФИННОСТЬЮ, АВИДНОСТЬЮ И СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ | 2016 |
|
RU2728858C2 |
Группа изобретений относится к антигенспецифичной иммунотерапии. Раскрыто применение белка ГДФ-L-фукозосинтазы или белка семейства белков RASGRP, его иммунодоминантного фрагмента, производного или варианта сплайсинга, или их нуклеотидной последовательности, для лечения или предотвращения рассеянного склероза (РС), где иммунодоминантный фрагмент содержит от 5 до 50 аминокислот, производное имеет гомологию или идентичность по всей своей длине с соответствующей частью эталонной аминокислотной последовательности по меньшей мере 75%. Также раскрыты применение белка ГДФ-L-фукозосинтазы для диагностики РС, применение ГДФ-L-фукозосинтазы или белка семейства белков RASGRP для идентификации человека, который подходит для толеризации к аутоантигенам при РС, способ получения химически связанной клетки крови, применение фармацевтической композиции для лечения, диагностики или предотвращения РС, способ индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам у человека, страдающего или подверженного риску развития РС, способ идентификации человека, подходящего для толеризации к аутоантигенам при РС. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала средств определенного назначения. 11 н. и 16 з.п. ф-лы, 16 ил., 3 табл., 15 пр.
1. Применение белка, выбранного из ГДФ-L-фукозосинтазы или белка семейства белков RASGRP, или его иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного или иммунодоминантного варианта сплайсинга, или нуклеотидной последовательности, кодирующей любого из белков или его иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного или иммунодоминантного варианта сплайсинга, для лечения или предотвращения рассеянного склероза (РС), где иммунодоминантный фрагмент содержит от 5 до 50 аминокислот или иммунодоминантное производное имеет гомологию или идентичность по всей своей длине с соответствующей частью эталонной аминокислотной последовательности по меньшей мере 75% и где указанные ГДФ-L-фукозосинтаза или белок семейства белков RASGRP являются аутоантигенами.
2. Применение по п. 1, где иммунодоминантный фрагмент содержит от 5 до 20, предпочтительно от 10 до 15 аминокислот, более предпочтительно 15 аминокислот.
3. Применение по п. 1, где иммунодоминантное производное имеет гомологию или идентичность по всей своей длине с соответствующей частью эталонной аминокислотной последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.
4. Применение белка ГДФ-L-фукозосинтазы или его иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного или иммунодоминантного варианта сплайсинга, или нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ГДФ-L-фукозосинтазу или его иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное или иммунодоминантный вариант сплайсинга, как определено в п. 1, для диагностики рассеянного склероза (РС).
5. Применение по п. 1 или 4,
где белок ГДФ-L-фукозосинтазы
a) имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или
b) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или
c) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или
d) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и белок или его иммунодоминантный фрагмент или иммунодоминантный вариант сплайсинга связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, или ее иммунодоминантным фрагментом или распознает их, или
e) кодируется геном TSTA3, в частности нуклеотидной последовательностью с 143612618 по 143618048 нуклеотид в последовательности NC_000008.11, или кодируется геном, который имеет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности с нуклеотидной последовательностью гена с 143612618 по 143618048 нуклеотид в последовательности NC_000008.11,
и/или
где член семейства белков RASGRP
f) имеет аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, или
g) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, или
h) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, или
i) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, и белок или его иммунодоминантный фрагмент или иммунодоминантный вариант сплайсинга связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с соответствующей аминокислотной последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, или ее иммунодоминантным фрагментом, или распознает их, или
j) кодируется геном RASGRP, в частности нуклеотидной последовательностью гена
- с 38488101 по 38565575 нуклеотид в последовательности NC_000015.10,
- с 64726911 по 64745456 нуклеотид в последовательности NC_000011.10,
- с 33436324 по 33564750 нуклеотид в последовательности NC_000002.12 или
- с 38409051 по 38426305 нуклеотид в последовательности NC_000019.10,
или кодируется геном, который по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидной последовательности гена
- с 38488101 по 38565575 нуклеотид в последовательности NC_000015.10,
- с 64726911 по 64745456 нуклеотид в последовательности NC_000011.10,
- с 33436324 по 33564750 нуклеотид в последовательности NC_000002.12 или
- с 38409051 по 38426305 нуклеотид в последовательности NC_000019.10.
6. Применение по п. 4 или 5, где иммунодоминантный фрагмент
a) по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичен соответствующей аминокислотной последовательности или
b) по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичен соответствующей аминокислотной последовательности или
c) по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичен соответствующей аминокислотной последовательности и связывается с аутологичным аллелем HLA, распознается Т-клеткой и/или распознается антителом, которое связывается с соответствующей аминокислотной последовательностью или распознает ее.
7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где иммунодоминантный фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-98, предпочтительно SEQ ID NO: 10-35, предпочтительно состоит из последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 10-98, предпочтительно SEQ ID NO: 10-35.
8. Применение белка, выбранного из ГДФ-L-фукозосинтазы или белка семейства белков RASGRP, или его иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного или иммунодоминантного варианта сплайсинга, или нуклеотидной последовательности, кодирующей любого из белков или его иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного или иммунодоминантного варианта сплайсинга, как определено в любом из пп. 1 или 5-7, для идентификации человека, который подходит для толеризации к аутоантигенам при РС.
9. Применение по п. 8, где РС представляет собой ранний РС, клинически изолированный синдром (КИС), радиологически изолированный синдром (РИС) или рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (РРРС).
10. Применение по любому из пп. 4-7 для диагностики рассеянного склероза типа II у человека.
11. Применение носителя, содержащего по меньшей мере один белок, иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное, иммунодоминантный вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена, охарактеризованные в любом из пп. 1 или 5-7, для лечения или предотвращения РС.
12. Применение носителя, содержащего по меньшей мере один белок ГДФ-L-фукозосинтазу или его иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное или иммунодоминантный вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена, кодирующие белок ГДФ-L-фукозосинтазу или его иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное или иммунодоминантный вариант сплайсинга, как охарактеризовано в любом из пп. 1 или 5-7, для диагностики РС.
13. Применение по п. 11 или 12, где носитель связан по меньшей мере с одним белком, иммунодоминантным фрагментом, иммунодоминантным производным и/или иммунодоминантным вариантом сплайсинга и/или носитель содержит по меньшей мере один белок, иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное, иммунодоминантный вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена.
14. Применение по любому из пп. 11-13, где носитель выбран из группы, включающей клетку, предпочтительно клетку крови, белок, липид, гликолипид, гранулу, наночастицу, вирусоподобную частицу (ВПЧ) и молекулу, такую как молекула сахара, и любую их комбинацию.
15. Применение по п. 14, где белок, иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное и/или иммунодоминантный вариант сплайсинга экспрессируется клеткой, предпочтительно клеткой крови.
16. Применение по п. 14 или 15, где клетка крови представляет собой эритроцит или лейкоцит.
17. Применение по любому из пп. 14-16, где носитель представляет собой клетку крови и эта клетка крови химически связана с помощью связывающего агента, предпочтительно 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ECDI/EDC), по меньшей мере с одним белком, иммунодоминантным фрагментом, иммунодоминантным производным и/или иммунодоминантным вариантом сплайсинга.
18. Способ получения химически связанной клетки крови, охарактеризованной в п. 17, включающий выделение клетки крови у человека, добавление по меньшей мере одного белка, иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного и/или иммунодоминантного варианта сплайсинга и последующее добавление связывающего агента.
19. Способ по п. 18, где связывающий агент представляет собой EDC.
20. Применение фармацевтической композиции для лечения или предотвращения РС, где указанная композиция содержит в эффективном количестве по меньшей мере один белок, иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное, иммунодоминантный вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена, охарактеризованные в любом из пп. 1 или 5-7, и фармацевтически приемлемый носитель.
21. Применение фармацевтической композиции для диагностики РС, где указанная композиция содержит в эффективном количестве по меньшей мере один белок ГДФ-L-фукозосинтазу или его иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное или иммунодоминантный вариант сплайсинга, или нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена, кодирующие белок ГДФ-L-фукозосинтазу или его иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное или иммунодоминантный вариант сплайсинга, как охарактеризовано в любом из пп. 1 или 5-7, и фармацевтически приемлемый носитель.
22. Способ индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам у человека, страдающего или подверженного риску развития РС, включающий стадию применения к человеку
a) по меньшей мере одного белка, иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного, иммунодоминантного варианта сплайсинга, нуклеотидной последовательности и/или последовательность гена, охарактеризованных в любом из пп. 1 или 5-7, и/или
b) по меньшей мере одного носителя, как определено в любом из пп. 11-17.
23. Способ по п. 22, где по меньшей мере один белок, иммунодоминантный фрагмент, иммунодоминантное производное, иммунодоминантный вариант сплайсинга, нуклеотидную последовательность и/или последовательность гена применяют путем назального, ингаляционного, перорального, подкожного, внутрицеломического, внутримышечного, внутрикожного, чрескожного или внутривенного введения, предпочтительно внутривенно, подкожно, внутрикожно, чрескожно, перорально, ингаляционно, назально или в сочетании с носителем, предпочтительно эритроцитом.
24. Способ по п. 22 или 23 для индукции антигенспецифичной толерантности к аутоантигенам при раннем РС, РИС, КИС и раннем РРРС.
25. Способ идентификации человека, подходящего для толеризации к аутоантигенам при РС, включающий выделение Т-клеток и/или антител из крови, спинномозговой жидкости или другой жидкости организма субъекта и измерение реактивности Т-клеток и/или антител против белка, иммунодоминантного фрагмента, иммунодоминантного производного и/или иммунодоминантного варианта сплайсинга, охарактеризованных в любом из пп. 1 или 5-7, где положительная реактивность Т-клеток и/или антител к указанному белку, иммунодоминантному фрагменту, иммунодоминантному производному и/или иммунодоминантному варианту сплайсинга определяет человека, подходящего для толеризации к аутоантигенам при РС.
26. Способ по п. 25, где РС представляет собой ранний РС, РИС, КИС или ранний РРРС.
27. Применение иммунодоминантного фрагмента, охарактеризованного в любом из пп. 1 или 5-7, в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения РС.
| US 2014018245 A1, 16.01.2014 | |||
| US 2013244897 A1, 19.09.2013 | |||
| US 20040082772 A1, 29.04.2004 | |||
| WO 2009140679 A2, 14.07.2010 | |||
| ANDREAS L | |||
| ET AL | |||
| Antigen-specific tolerization approaches in multiple sclerosis // Expert Opinion on Investigational Drugs, 2014, V | |||
| Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб | 1921 |
|
SU23A1 |
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| Разборный с внутренней печью кипятильник | 1922 |
|
SU9A1 |
| ХАРКЕВИЧ Д.А | |||
| Фармакология: Учебник, 2010, 10-е издание, стр.73 | |||
| ЯКУБКЕ | |||
