ЛЕЧЕНИЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ МИКРООРГАНИЗМАМИ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/395 C07K16/12 A61P31/04 

Настоящее изобретение касается лечения инфекций организма человека или животных, вызываемых микроорганизмами, такими как S. aureus, особенно устойчивыми к антибиотикам штаммами микроорганизмов, такими как MRSA. Предлагаются лекарства для лечения инфекции, вызываемой микроорганизмами, такими как S. aureus, способы получения лекарств для лечения инфекции, фармацевтические упаковки, содержащие лекарства для лечения инфекции, и способы лечения инфекции организма человека или животных, вызываемых указанными микроорганизмами.

Множественная устойчивость к лекарствам (MDR) представляет собой растущую проблему в отношении грамположительных бактерий (Banergee, S.N. et al. 1991, Am. J. Med. 91: 865-895; Shaberg, D.R. et al., 1991, Am. J. Med. suppl., 88: 72-75; Gaynes, R.P. et al., 1994, Infect. Dis. Clin. Pract., 6: 452-455), особенно в больницах. В частности, метициллин-устойчивые Staphylococcus aureus (MRSA) и негативные в отношении коагулазы стафилококки (CNS), особенно метициллин-устойчивые CNS, создают проблемы, будучи устойчивыми ко всем пенициллинам и цефалоспоринам. Широко распространена устойчивость к другим агентам, таким как хинолоны (Malabarta, A. et al., 1997, Eur. J. Med. Chem., 32: 459-478; Lewis, K., 1994, TIBS, 19: 119-123; Traub, W.H. et al., 1996, Chemotherapy, 42: 118-132). Лечение обычно осуществляется с использованием ванкомицина или тейкопланина. Однако распространяется устойчивость к данным агентам, и, следовательно, необходимы новые способы терапии. Например, Hubert SK et al. (J. Clin Microbiol. 1999 Nov;37(11):3590-3; PMID: 10523558) описывает изоляты S. aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину и тейкопланину. Было обнаружено, что определенные эпидемические штаммы MRSA, включая EMRSA-15 (www.phls.org.uk, Public Health Laboratories, Colindale, UK), могут давать рост субклонов с увеличенной устойчивостью к ванкомицину (Burnie J et al., Clin Infect Dis. 2000 Sep;31(3):684-9; PMID: 11017816). Надеялись, что линезолид должен обеспечить весьма необходимую альтернативу имеющейся в настоящее время терапии, но Tsiodras S. et al. (Lancet. 2001 Jul 21;358(9277):207-8; PMID: 11476839) сообщили о клиническом изоляте MRSA, устойчивом к линезолиду у больного, которого лечили данным антибиотиком при перитоните, связанном с диализом.

Кроме того, введение больших количеств таких антибиотиков больным для эффективного лечения инфекций, особенно инфекций, которые проявляют устойчивость к вводимым антибиотику(кам), может быть токсичным и нефротоксичным и, хотя и помогает спасти жизнь больного, может приводить к тяжелым побочным эффектам.

Лечение и диагностика стафилококковых инфекций широко обсуждались в предшествующем уровне техники, и связанные публикации включают патенты WO 98/01154, WO 99/50418 и EP 0786519. Причины устойчивости к антибиотикам обсуждаются также в таких публикациях, как Allignet J. (Gene 1997 Nov 20; 202(1-2):133-8; PMID: 9427556).

Таким образом, существует очевидная потребность в новой и усиленной терапии инфекции, вызываемой микроорганизмами, особенно S. aureus.

Авторы настоящего изобретения в настоящее время обнаружили, что конкретное сочетание агентов, а именно антител (подробнее ниже), имеющих новую антигенсвязывающую часть, и гликопептидного антибиотика (такого как ванкомицин или тейкопланин), обладает очень неожиданным синергическим терапевтическим эффектом - терапевтическая эффективность гликопептидного антибиотика существенно увеличивается по сравнению с его терапевтической эффективностью при использовании в одиночку. Это, в частности, возникает в случае, когда микроорганизм, подвергаемый воздействию, устойчив к гликопептидному антибиотику. Важно, что настоящее изобретение способно воздействовать на штаммы S. aureus, полностью устойчивые к ванкомицину, и на штаммы с промежуточной устойчивостью к ванкомицину, применяя ванкомицин совместно с антителом SEQ ID NO: 2. Нигде на предшествующем уровне техники не предполагалось, что это может быть достигнуто. Гликопептидные антибиотики действуют путем влияния на стенку бактериальной клетки. Другие антибиотики, такие как пенициллины, также действуют на стенку бактериальной клетки. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что их эффективность не улучшается при применении их с антителом SEQ ID NO: 2. В частности, эксперименты показали, что эффективность флуклоксациллина не улучшается при применении его с антителом SEQ ID NO: 2. Бактерии, устойчивые к флуклоксациллину, не проявляют сниженной устойчивости при применении антитела SEQ ID NO: 2.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается антитело SEQ ID NO: 2 или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, хотя, конечно, нуклеотидная последовательность может быть легко модифицирована для, например, оптимизации кодонов для конкретных микроорганизмов, применяемых для их синтеза или для других причин, как это желательно.

Антитело SEQ ID NO: 2 (обозначаемое также как зарегистрированное торговое название "Aurograb") представляет собой генетическое рекомбинантное антитело человека. Оно связывает иммунодоминантный антиген клеточной поверхности, GrfA, стафилококковый белок-транспортер ABC (патент WO 99/50418; Burnie JP et al., Infect Immun. 2000 Jun;68(6):3200-9; PMID: 10816464). Исходно оно произошло от больных, которые выздоравливали после септицемии S. aureus и продуцировали антитела GrfA. Оно имеет существенную антистафилококковую активность и проявляет синергизм с ванкомицином и другими гликопептидными антибиотиками, как in vitro, так и in vivo, против широкого спектра штаммов S. aureus, включая MRSA и ванкомицин-устойчивые MRSA. Антибактериальная активность антитела SEQ ID NO: 2, как одного, так и в сочетании с гликопептидными антибиотиками, дает существенные преимущества при лечении инфекций S. aureus.

Как иммуноглобулин из плазмы человека (Ramisse F et al., J Infect Dis. 1993 Oct; 168(4):1030-3; PMID: 837815), так и гипериммунная антисыворотка кролика, действующая против GrfA, являются защитными в моделях стафилококковых инфекций (см. раздел «Эксперименты» ниже). Рекомбинантные антитела человека, специфичные для GrfA, являются защитными в мышиных моделях MRSA инфекции. Особенно аминокислотная последовательность GrfA, эпитоп SEQ ID NO: 3, как обнаружено, часто является мишенью для гуморального иммунного ответа больных, выздоравливающих от септицемии S. aureus (Burnie JP et al., 2000, выше).

Однако нигде на предшествующем уровне техники не предполагалось, что усовершенствованное лечение инфекций, вызываемых микроорганизмами, такими как S. aureus, может быть достигнуто при применении сочетания гликопептидного антибиотика, такого как ванкомицин, тейкопланин и даптомицин, и против антитела GrfA, в частности, антитела, специфичного в отношении эпитопа SEQ ID NO: 3, и более конкретно антитела, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предлагается лекарство, включающее терапевтически эффективное количество гликопептидного антибиотика и антитела, специфичного в отношении GrfA, в частности, антитела, специфичного в отношении эпитопа SEQ ID NO: 3. Предлагаются также способы получения лекарств, фармацевтические упаковки и способы лечения, все включающие или использующие вышеуказанное. Лекарство может применяться для лечения инфекции S. aureus. Применяемый здесь термин «лечение» обозначает любое лечение, которое предназначено для вылечивания, облегчения, исчезновения или уменьшения симптомов, или для предотвращения или снижения возможности заражения такой инфекцией, и включает профилактику.

Белок GrfA, который представляет собой белок-транспортер ABC, выделен из S. aureus и очищен, но существуют гомологи, которые выполняют ту же самую функцию в других организмах, и они могут быть использованы в качестве мишеней для терапии. Таким образом, может быть получено антитело против гомолога GrfA, продуцируемого микроорганизмом, отличным от S. aureus, и оно может быть применено совместно с гликопептидным антибиотиком для эффективного лечения инфекции, вызываемой микроорганизмом, у больного. Примерами других микроорганизмов, на которые может быть направлено лечение, являются другие стафилококки, особенно негативные в отношении коагулазы стафилококки, такие как S. haemolyticus, S. epidermidis и S. saprophyticus. Инфекцию, вызываемую энтерококками, особенно E. faecalis и E. faecium, также можно лечить, так же как и инфекцию, вызываемую Corynebacteria, такими как C. jeikeium и C. xerosis.

Гомолог GrfA может иметь гомологию последовательности с GrfA, по меньшей мере, 60%, например, по меньшей мере, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%. Гомологии последовательностей определяют с применением программ NCBI BLASTN (сравнения нуклеотидных последовательностей) или BLASTP (сравнения полипептидов), версия 2.1.2, с параметрами по умолчанию. Программы NCBI BLAST могут быть найдены на www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/. Применяемый здесь термин «идентичность последовательностей» относится к аминокислотным остаткам в оптимально выравненных последовательностях, которые попарно выровнены в соответствующих относительных положениях.

В организмах, отличных от S. aureus, особенно в других стафилококках, эпитоп (SEQ ID NO: 3), против которого выработаны антитела и который применяют как основу для лечения, может оставаться одним и тем же.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предлагается лекарство для лечения инфекции, особенно инфекции, вызываемой S. aureus, причем указанное лекарство включает терапевтически эффективное количество гликопептидного антибиотика и антитело SEQ ID NO: 2 или его антигенсвязывающий фрагмент.

Предлагается также гликопептидный антибиотик и антитело SEQ ID NO: 2 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в способе получения лекарства для лечения инфекции.

При осуществлении терапии инфекции, особенно инфекции, вызываемой S. aureus, гликопептидный антибиотик и антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно вводить больному отдельно или последовательно. В соответствии с настоящим изобретением предлагается также фармацевтическая упаковка, включающая терапевтически эффективные количества гликопептидного антибиотика и антитела SEQ ID NO: 2 или его антигенсвязывающего фрагмента.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается также применение гликопептидного антибиотика и антитела SEQ ID NO: 2 или его антигенсвязывающего фрагмента для изготовления лекарства для лечения инфекции, особенно инфекции, вызываемой S. aureus.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается также способ лечения инфекции, особенно инфекции, вызываемой S. aureus, у больного, включающий стадию введения указанному больному терапевтически эффективного количества гликопептидного антибиотика и антитела SEQ ID NO: 2 или его антигенсвязывающего фрагмента.

Гликопептидными антибиотиками, особенно пригодными для настоящего изобретения, являются ванкомицин, тейкопланин и даптомицин, хотя, конечно, настоящее изобретение распространяется на другие члены семейства гликопептидных антибиотиков.

Применяемый здесь термин «антитело» в различных его грамматических формах относится к молекулам иммуноглобулинов и к иммунологически активным частям молекул иммуноглобулинов, т.е. к молекулам, которые содержат связывающий центр антитела или паратоп. Такие молекулы также обозначаются как «антигенсвязывающие фрагменты» молекул иммуноглобулинов.

Примерами молекул антител являются молекулы интактных иммуноглобулинов, молекулы по существу интактных иммуноглобулинов и те части молекулы иммуноглобулина, которые содержат паратоп, включающий те части, которые известны в данной области техники как Fab, Fab', F(ab')2, scFv и F(v).

Термин «связывающий сайт антитела» относится к структурной части молекулы антитела, включающей вариабельную и гипервариабельную области тяжелой и легкой цепей, которые специфически связывают антиген (иммунологически взаимодействуют с антигеном).

Что касается антитела SEQ ID NO: 2, оно может быть легко модифицировано для изменения своей аминокислотной последовательности, до тех пор пока присутствует тот же самый паратоп и сохраняется его антигенсвязывающая специфичность. Вообще говоря, его структура организована (от амино- к карбокситерминальной последовательности) как вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_K), ковалентно связанные друг с другом с помощью линкера и имеющие карбокситерминальную последовательность His.

Каждая из вариабельных областей включает комплемент-определяющие области CDR₁, CDR₂ и CDR₃, и они являются основополагающими для определения антигенсвязывающей специфичности антитела, т.е. паратопа. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что из данных областей часть CDR₃ области V_H является наиболее важной для определения антигенной специфичности. Дополнительные указания в отношении антител широко доступны в данной области техники, например, Harlow, E. and Lane, D., "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998. Используя обычные общие знания о частях, определяющих паратопы, и связывающем сайте антитела и представленные выше указания, специалист в данной области техники легко способен модифицировать последовательность SEQ ID NO: 2 для получения альтернативных антител с тем же паратопом, которые дают возможность достигнуть того же или сходного терапевтического эффекта.

Например, антигенсвязывающий фрагмент антитела SEQ ID NO: 2 может быть легко получен с помощью простого удаления одного или более карбокситерминальных остатков His. Другие примеры модификаций включают пересадку гипервариабельных частей (комплемент-определяющих областей) антитела SEQ ID NO: 2 в каркас вариабельных областей, отличных от таковых SEQ ID NO: 2, так, чтобы результирующее антитело также имело тот же самый паратоп (см., например, патент EP 239400 и тому подобное).

Под «усовершенствованным лечением» подразумевается, что данное количество гликопептидного антибиотика обладает более сильным терапевтическим эффектом при введении больному совместно с антителом настоящего изобретения, чем при введении в одиночку. Сходно, желаемый терапевтический эффект может быть достигнут у больного с помощью меньшей дозировки гликопептидного антибиотика, когда он вводится больному совместно с антителом настоящего изобретения по сравнению с введением одного гликопептидного антибиотика. Это особо важно, когда микроорганизм, такой как S. aureus, является устойчивым к гликопептидному антибиотику. Это может быть крайне полезно для снижения любых побочных эффектов лечения.

Обеспечивая существующие гликопептидные антибиотики «вторым дыханием» и давая возможность им быть терапевтически эффективными против инфекции, вызываемой S. aureus, даже когда S. aureus является устойчивым к ним, настоящее изобретение предлагает лекарства и способы лечения, безопасность и эффективность которых могут быть легко оценены и которые не включают новые классы веществ - параметры безопасности для гликопептидных антибиотиков уже хорошо известны и могут быть применены в настоящем изобретении. Применение антител в качестве другого активного ингредиента в настоящем изобретении аналогично является относительно простым в отношении безопасности. В частности, когда антитело находится в форме рекомбинантного фрагмента антитела, происходящего от последовательностей антител человека, его иммуногенность должна быть предельно низкой. Кроме того, применение режимов лечения, в которых антитело вводят в течение очень короткого периода времени (например, нескольких дней), означает, что существует небольшая вероятность для иммунной системы больного развить иммунный ответ против него. Таким образом, побочные реакции типа гиперчувствительности, вызываемые продукцией антитела против антитела настоящего изобретения и образованием/отложением иммунных комплексов, очень малы.

Антитело SEQ ID NO: 2 имеет также ряд конкретных преимуществ - оно не имеет части F_C, которая может служить триггером отложения комплемента и связывания макрофагами и, следовательно, маловероятно, чтобы оно вызывало нежелательную активацию каскада комплемента, который может вызвать воспаление и повреждение ткани.

Получая антитела настоящего изобретения без применения продуктов животного происхождения, можно избежать возможности введения больным агентов, вызывающих инфекционные болезни животных и человека, или онкогенов.

Режимы лечения и дозировки лекарств настоящего изобретения описываются ниже, и их модификации должны быть вполне очевидны специалисту в данной области техники, который, в частности, должен быть осведомлен о режимах лечения, применяемых с гликопептидным антибиотиком, и должен быть способен модифицировать их подходящим образом. Например, могут быть легко применены простые тесты доза-ответ, а результаты лечения на моделях млекопитающих, таких как мышиные модели, могут быть легко экстраполированы к человеку.

Настоящее изобретение будет далее ясно из последующего описания со ссылкой на прилагаемый чертеж, которое показывает с помощью примера только формы лечения инфекции, вызываемой S. aureus.

Чертеж представляет собой фармакокинетику высоких доз Aurograb. На оси Х отложено время в минутах. На оси Y представлена концентрация Aurograb в мкг/мл в образцах крови.

Эксперименты

Эксперименты, подробно описанные ниже, показывают, что Aurograb (т.е. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), приближенный к человеческому фрагмент рекомбинантного антитела настоящего изобретения, специфичный в отношении GrfA, обладает внутренней антистафилококковой активностью in vitro и стафилококковой инфекции мыши, и что он проявляет синергическое действие с гликопептидными антибиотиками, в особенности с гликопептидным антибиотиком широкого спектра действия - ванкомицином.

Синергичная с гликопептидными антибиотиками активность проявляется:

(1) в снижении минимальной ингибирующей концентрации ванкомицина в присутствии Aurograb in vitro и

(2) в снижении количества колоний в органах на моделях инфекции мыши S. aureus, когда после заражения S. aureus вводится однократная доза Aurograb (2 мг/кг) в сочетании с однократной дозой ванкомицина (6 мг/кг).

Если это не указано иначе, все подробно описанные здесь процедуры проводили с применением стандартных протоколов и в соответствии с инструкциями производителей, где это было применимо. Стандартные протоколы для различных способов, включая ПЦР, молекулярное клонирование, обработку, секвенирование, получение антител, эпитопное картирование и конструирование мимотопов, культивирование клеток и проявление фагов, описаны в руководствах, таких как McPherson, M.J. et al. (1991, PCR: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York), Huynh and Davies (1985, "DNA Cloning Vol I - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. D.M. Glover), Sanger, F. et al. (1977, PNAS USA 74(12): 5463-5467), Harlow, E. and Lane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), Jung, G. and Beck-Sickinger, A.G. (1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31:367-486), Harris, M.A. and Rae, I.F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645), "Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual" (Eds. Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J., Academic Press Inc., 1996, ISBN 0-12-402380-0).

Применимые для этого в подробно описанных здесь способах реактивы и оборудование среди прочих могут быть получены в равной мере от Amersham (www.amersham.co.uk), Boehrmger Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com), Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) and Stratagene (www.stratagene.com).

Когда для публикаций даются номера ссылок "PMID", эти номера обозначают идентификационные номера, присвоенные им Национальной медицинской библиотекой США, из которой полная библиографическая информация и реферат каждой публикации доступны по адресу www.ncbi.nlm.nih.gov. Может быть также обеспечен прямой доступ к электронным копиям полных публикаций, в особенности в случае публикаций, например, PNAS, JBC и MBC.

Содержание каждой из обсуждаемых здесь ссылок, включая цитированные здесь ссылки, включено здесь в качестве ссылки во всей своей полноте.

1. Исследование на человеке

Для данного исследования Aurograb вводили в сочетании с ванкомицином для снижения летальности и/или показателей заболеваемости больных с подтвержденным культивированием укоренившейся инфекции MRSA. Данное исследование проводили в трех частях:

i) Исследование переносимости и варьирования дозы, в котором группы из трех больных с инфекцией MRSA получают ступенчато возрастающие дозы Aurograb, начиная с суб-терапевтической дозы (0,1 мг/кг), и возрастающей до 1 мг/кг массы тела, во время которого каждого больного тщательно обследуют на предмет любых неблагоприятных побочных эффектов.

ii) Внутреннее, открытое, маркированное исследование, в котором 5 больных с инфекцией MRSA получают предполагаемый курс терапии Aurograb, а именно 1 мг/кг массы тела в течение 7 дней, с тщательным контролем в отношении устойчивости и фармакокинетики. Предварительная оценка эффективности может быть осуществлена на основании истории болезни.

iii) Проспективное, дважды слепое, рандомизированное испытание фазы II.

2. Физические, химические и фармацевтические свойства

Таблица 1Физическая форма:Aurograb представляет собой аморфный лиофилизированный порошок, который при растворении в воде при концентрации 2 мг/мл дает прозрачный, бесцветный растворСтруктурная формула:Рекомбинантный белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 - scFv человека, совместно с гистидиновой меткой карбоксильного конца из 6 аминокислотных остатков гистидинаМолекулярная масса:Мономер - 28,1 кДа - приблизительно 18% молекул находятся в виде гомодимераСвойства:Белый порошок рыхлого твердого вещества. ГигроскопичныйКислотность/щелочностьAurograb осаждается при pH 9,5±0,2.

3. Состав, композиция, обработка и хранение

3.1 Состав и композиция

Полный состав для Aurograb показан ниже в таблице 2. Он состоит из лиофилизированного (замороженного-высушенного) порошка, предлагаемого в количестве 10 мг на сосуд. Лекарство вводят ресуспендированием порошка в 5 мл стерильной воды для инъекций незадолго до инъекции. Воду не следует заменять никаким другим растворителем, поскольку Aurograb чувствителен к изменениям pH и был специально приготовлен для ресуспендирования в воде.

Таблица 2Наименования ингредиентовКоличество на сосуд AurograbКоличество на мл после разбавления 5 мл водыФункцияAurograb10 мг2 мгАктивный ингредиентМочевина Ph Eur, BP, USP, JP150 мг30 мгНаполнительАргинин Ph Eur174 мг34,8 мгНаполнитель

L-Аргинин и мочевина присутствуют для поддержания баланса pH состава и обеспечения растворимости Aurograb. Они оба находятся в дозах, которые рассматриваются как безопасные при клиническом внутривенном введении. Например, однократная доза Aurograb (37,5 мл для больного массой 75 кг) содержит 7,5 ммоль аргинина. Это в 26 раз меньше максимально допустимой ежедневной дозы L-аргинина при введении во время измерения уровня гормона роста у детей (руководство ABPI, 1998-99). В случае мочевины однократная доза Aurograb 35 мл содержит 1,125 г мочевины. И вновь это значительно меньше максимально допустимой ежедневной дозы 150 г мочевины (данная максимальная доза показана для лечения острого внутричерепного давления посредством внутривенной доставки - руководство ABPI, 1998-99).

3.2 Хранение

Лиофилизированное лекарство хранится в стеклянных сосудах при 4°С в темноте. Приемлема транспортировка в течение ночи при температуре окружающей среды. Следует избегать экспозиции при ярком свете или избыточной влажности. Не наблюдалось изменения активности Aurograb после хранения при 4°С (3 месяца).

После восстановления водой Aurograb должен храниться при 4°С, и его следует использовать в течение 14 часов. Активность будет медленно снижаться при комнатной температуре.

3.3 Получение и введение

Aurograb, предлагаемый в количестве 10 мг на сосуд, вводят путем ресуспендирования порошка в 5 мл стерильной воды для инъекций незадолго до внутривенной (в/в) инъекции. Примерной дозой для человека является 1 мг/кг массы тела. Стерильную вводу вносят непосредственно в сосуды посредством инъекции через резиновую пробку с помощью шприца/иглы подкожных инъекций.

Для разбавления:

добавить половину конечного объема воды (2,5 мл на сосуд) и вращать для растворения;

отфильтровать (если это необходимо) для удаления всего нерастворенного вещества;

добавить остальную воду.

Внимание. Если введение откладывается, хранить при 4°С (до 14 часов).

Не следует заменять воду никаким другим растворителем, поскольку Aurograb чувствителен к изменениям pH и был приготовлен специально для ресуспендирования в воде.

Aurograb следует вводить путем медленной в/в болюсной инъекцией, например с использованием комплекта для в/в введения, который следует сначала сполоснуть физиологическим раствором для удаления любых других в/в жидкостей с повторением процедуры после введения лекарства.

Не требуется особых предосторожностей для удаления пролитого или удаления отходов.

Физиологический раствор для в/в применения совместим с разбавленным Aurograb (при разведении 50:50). Он менее совместим с 20% глюкозой и буфером на основе бикарбоната натрия, как это показано снижением активности при ELISA, и поэтому при в/в введении посредством того же комплекта для в/в введения этих или других жидкостей инъекционный порт должен быть промыт струей физиологического раствора до и после введения Aurograb.

4. Неклинические исследования

Aurograb проявляет антибактериальную активность, как in vitro, так и in vivo, в отношении широкого спектра штаммов S. aureus. Кроме того, было показано, что Aurograb оказывает синергичное антибактериальное действие при применении в сочетании с ванкомицином.

4.1 Неклинические исследования эффективности: данные in vitro

Aurograb проявляет синергетическую активность в сочетании с ванкомицином в отношении широкого спектра штаммов MRSA, включая штаммы EMRSA с промежуточной устойчивостью к ванкомицину ("VISA" - нечувствительный к ванкомицину MRSA)

Эти данные были получены при применении методологии MIC, которую обычно используют в отношении антибиотиков.

Цели: Показать синергизм при применении в сочетании с ванкомицином в отношении широкого спектра эпидемических штаммов MRSA.

Задача: Демонстрация синергизма снижением MIC ванкомицина при применении Aurograb в сочетании.

Введение

Эпидемические штаммы MRSA легко вырастают в субпопуляции с промежуточной устойчивостью к ванкомицину (т.е., MIC 4 или 8 мкг/мл) при последовательных пассажах в питательном бульоне с возрастающими концентрациями ванкомицина (Burnie J et al., Clin Infect Dis. 2000 Sep; 31(3):684-9; PMID: 11017816). Это, возможно, служит причиной многих неудач в лечении, связанном с терапией ванкомицином. В данном исследовании активность Aurograb оценивали в отношении как данных VISA, так и полностью чувствительного к ванкомицину исходного штамма EMRSA-15.

Способ

Штаммы MRSA выращивали в течение ночи в питательном бульоне и разбавляли для получения прививочного материала в концентрации 1·10³ клеток на мл. 100 мкл аликвоты культуры помещали в планшеты для микротитрования с плоским дном и добавляли ванкомицин в диапазоне 0,125-250 мкг/мл. Культуры инкубировали еще в течение 2 дней. Минимальную ингибирующую рост концентрацию (MIC) определяют как наибольшую концентрацию антибиотика, при которой происходит рост бактерий, и ее определяют путем спектрофотометрической оценки мутности (роста) культуры. MIC определяли в присутствии экзогенного Aurograb или в присутствии буфера для состава Aurograb (отрицательный контроль).

Результаты:

Таблица 3Штамм MRSAMIC ванкомицина в присутствии Aurograb в следующих концентрацияхVISA:-0 мкг/мл60 мкг/мл80 мкг/мл125 мкг/млEMRSA-18 мкг/мл4 мкг/мл2 мкг/мл<0,125 мкг/млEMRSA-24 мкг/мл0,5 мкг/мл1 мкг/мл<0,125 мкг/млEMRSA-88 мкг/мл2 мкг/мл1 мкг/мл<0,125 мкг/млEMRSA-114 мкг/мл4 мкг/мл1 мкг/мл<0,125 мкг/млEMRSA-128 мкг/мл4 мкг/мл2 мкг/мл<0,125 мкг/млEMRSA-158 мкг/мл4 мкг/мл2 мкг/мл<0,125 мкг/млИсходный EMRSA-151 мкг/мл-0,25 мкг/мл<0,125 мкг/мл

Спектр активности: Повышенная антибактериальная активность наблюдается в отношении всех тестированных штаммов, что показывает широкий спектр активности против штаммов MRSA.

Синергизм: Aurograb обладает способностью повышать чувствительность MRSA к ванкомицину, включая MRSA со сниженной чувствительностью к ванкомицину.

Были предприняты дополнительные эксперименты для определения MIC ванкомицина в отношении ряда штаммов MRSA и действия антитела Aurograb на MIC. Были также проведены эксперименты с применением флуклоксациллина вместо ванкомицина для исследования эффективности антител пенициллинового типа с использованием Aurograb. Результаты приведены в таблице 3a:

Таблица 3АШтамм EMRSAMIC для ванкомицинаMIC для ванкомицина + 100 мкг/мл Aurograb10,5 мкг/мл0,03 мкг/мл20,5 мкг/мл0,03 мкг/мл30,5 мкг/мл0,03 мкг/мл40,5 мкг/мл0,03 мкг/мл50,5 мкг/мл0,03 мкг/мл60,5 мкг/мл0,0125 мкг/мл70,5 мкг/мл0,03 мкг/мл80,5 мкг/мл0,0125 мкг/мл90,5 мкг/мл0,0125 мкг/мл100,5 мкг/мл0,03 мкг/мл110,5 мкг/мл0,03 мкг/мл120,5 мкг/мл0,03 мкг/мл130,5 мкг/мл0,03 мкг/мл140,25 мкг/мл0,03 мкг/мл150,5 мкг/мл0,03 мкг/мл160,5 мкг/мл0,03 мкг/мл

Результаты, полученные с флуклоксациллином, показали, что полученная MIC была > 256 мкг/мл в отношении всех штаммов EMRSA. Флуклоксациллин + Aurograb дали те же результаты и показали отсутствие снижения MIC флуклоксациллина.

Заключение: Применение Aurograb в сочетании с ванкомицином должно повышать терапевтическую эффективность ванкомицина и препятствовать появлению устойчивых к ванкомицину штаммов. Благодаря структуре и функции антитела в отношении молекулы-мишени, можно ожидать, что сходные результаты будут получены при применении других гликопептидных антибиотиков, таких как тейкопланин, поскольку используемые S. aureus механизмы устойчивости к ним являются такими же, что и в отношении ванкомицина, и, следовательно, они также служат мишенью для антитела и поддаются терапии с его применением.

4.2 Неклинические исследования эффективности: данные in vivo

Мышиная модель стафилококковой инфекции широко и рутинно применяется при оценке противомикробных лекарств. Она служит хорошим предсказателем эффективности у инфицированных людей, поскольку S. aureus вводят внутривенно для создания бактериемии, в случае которой патоген распространяется в другие органы, включая почки, печень и селезенку. Следовательно, природа инфекции (септицемия) является аналогичной ситуации у инфицированных больных. Кроме того, внутривенный путь введения Aurograb, применяемый на животных моделях (данные приведены ниже), является тем же путем, который обычно следует применять у больных, что улучшает шансы на сопоставимость фармакокинетики, биологической доступности лекарства и эффективности.

Данные цикла 1: Aurograb - внутренняя антибактериальная активность против EMRSA-15

Цели: Демонстрация того, что Aurograb представляет собой терапевтическое средство при введении его одного мышам, инфицированным чувствительным к ванкомицину штаммом MRSA, EMRSA-15.

Задача: Демонстрация антистафилококковой активности по снижению летальности или бактериальной нагрузки (колониеобразующих единиц) в почках, печени или селезенке в присутствии Aurograb.

Способ: 20 самок мыши CD-1 получали сублетальное контрольное заражение (1,3·10⁷ КОЕ) устойчивым к метициллину, чувствительным к ванкомицину штаммом S. aureus (EMRSA-15, типированный госпитальный изолят, Central Manchester Healthcare Trust) в 100 мкл в/в болюса (все в/в инъекции производят через латеральную хвостовую вену). Через 1 час две группы из 10 мышей получали в виде 100 мкл в/в болюса:

1. буфер для состава (аргинин-мочевина) в качестве отрицательного контроля или

2. Aurograb (2,0 мг/кг) в буфере для состава.

Всех животных забивали через 48 часов и определяли жизнеспособные клетки как КОЕ на грамм органа.

Результаты:

Таблица 4Группа (n=10)AurograbПочкиПеченьСелезенка  Log КОЕ/г ткани1. Буфер состава-8,58±2,594,79±0,535,04±0,242. Aurograb2 мг/кг7,20±1,153,63±0,683,79±0,82

Заключение: Антибактериальная активность - Жизнеспособные стафилококки были обнаружены в почках, печени и селезенке с предпочтительной локализацией в почках. Введение Aurograb приводило к логарифмическому (10-кратному) снижению жизнеспособных микроорганизмов, обнаруживаемых во всех трех органах. Это позволяет предполагать, что Aurograb снижает жизнеспособность S. aureus при экспериментальных инфекциях мышей в отсутствие любого другого экзогенного противомикробного агента при применении мышиной модели глубоко укоренившейся инфекции.

Данные цикла 2: Исследование варьирования дозы Aurograb

Цели: Исследование варьирования дозы для применения Aurograb против штамма EMRSA-15 S. aureus.

Задача: Показать антибактериальную активность как большее снижение бактериальной нагрузки (КОЕ в органе) в почках, печени или селезенке при введении Aurograb в виде единственного агента по сравнению с контролем - плацебо. Диапазон доз определяют путем сравнения КОЕ (выраженных в виде log КОЕ на грамм ткани) для разных органов при различных дозах.

Способ: 40 самок мышей CD-1 (24-26 г) получали контрольное заражение путем в/в болюса S. aureus с последующим через 2 часа в/в введением однократной дозы плацебо или Aurograb (2 мг/кг, 1 мг/кг или 20 мг/кг). Всех мышей забивали через 48 часов для культивирования почек, печени и селезенки для определения показателей жизнеспособных микроорганизмов в органах.

Результаты: выражены в виде log КОЕ на грамм ткани

Эксперимент 1: S. aureus (1,5·10⁷ КОЕ): EMRSA-15

Таблица 5Доза AurograbПочкиПеченьСелезенка08,40±2,2567,22±2,526,98±2,392 мг/кг7,62±1,165,22±1,395,10±1,291 мг/кг8,7±2,65,40±1,385,33±1,210,2 мг/кг8,5±2,556,61±3,035,69±1,16

Эксперимент 2: S. aureus (9·10⁶ КОЕ): клинический изолят EMRSA-15 - низкая доза Aurograb

Таблица 6Доза AurograbПочкиПеченьСелезенка0,2 мг/кг
Aurograb7,14±1,283,13±0,443,40±0,64Плацебо¹7,36±1,054,14±1,274,01±1,26¹Антитело отрицательного контроля (WC7), специфичное в отношении незащищающего эпитопа GrfA.

Эксперимент 1: Было достигнуто от 10- до 100-кратного снижения жизнеспособных бактерий в печени и селезенке в диапазоне от 1,0 до 2,0 мг/кг Aurograb. При дозе Aurograb 0,2 мг/кг освобождение селезенки от микроорганизмов остается еще хорошим, но снижено в печени. Полученная наибольшая доза обеспечивала снижение бактериального заражения на 0,8 log в почках, но при меньших дозах снижение не происходило.

Эксперимент 2: При низких дозах, таких как 0,2 мг, снижение жизнеспособных стафилококков не обнаружено в почках, но очевидна гибель бактерий в печени и селезенке.

Заключение: Введение Aurograb в дозе 2 мг/кг приводит к снижению жизнеспособных микроорганизмов во всех трех органах, и в особенности в селезенке и печени. Aurograb в дозе 2 мг/кг также проявлял значительную антибактериальную активность в селезенке и печени, но терял активность в почках. Низкие дозы, такие как 0,2 мг/кг, все еще проявляют антибактериальную активность в селезенке и, в меньшей степени, в печени.

Экстраполяция на человека: Однократная доза 2,0 мг/кг у мышей обеспечивает приблизительно 2,0 log снижение в печени и селезенке и 0,8 log снижение в почках. На основе массы тела это соответствует дозе 1 мг/кг, вводимой дважды в день человеку.

Данные цикла 3: Антибактериальная активность Aurograb и синергизм с ванкомицином: сублетальная модель.

Цели: Демонстрация того, что Aurograb является антибактериальным агентом при введении его одного и синергичным при введении в сочетании с ванкомицином у мышей, инфицированных сублетальной дозой S. aureus.

Задачи: Демонстрация антибактериальной активности по снижению бактериального заражения (колониеобразующих единиц) в почках, печени или селезенке в присутствии одного Aurograb. Синергизм демонстрируется большим снижением количества колоний в органе при совместном введении Aurograb и ванкомицина по сравнению с раздельным введением любого из данных антибактериальных агентов.

Способы: 60 самок мышей CD-1 (22-24 г) получали 1·10⁷ КОЕ EMRSA-15 в виде 100 мкл в/в болюса. Через 2 часа группы из 10 мышей получали в виде однократного 100 мкл в/в болюса:

Группа 1 - 6,0 мг/кг ванкомицин + 2,0 мг/кг Aurograb.

Группа 2 - 6,0 мг/кг ванкомицин + 0,2 мг/кг Aurograb.

Группа 3 - 6,0 мг/кг ванкомицин + плацебо (буфер для состава).

Группа 4 - плацебо + 2,0 мг/кг Aurograb.

Группа 5 - плацебо + 0,2 мг/кг Aurograb.

Группа 6 - плацебо + 2,0 мг/кг Aurograb.

Всех мышей забивали через 48 часов для культивирования почек, печени и селезенки.

Результаты: выражены в виде log КОЕ на грамм ткани, хотя большинство мышей (>5) было свободно от инфекции (т.е. органы были отрицательными в культуре). Не опр. = не определяли.

Таблица 7ГруппаВанкомицинAurograbПочкиПеченьСелезенка   Log КОЕ/г ткани (количество мышей без инфекции)16 мг/кг2,0 мг/кг6,02±1,210 (все 10 без инфекции)Не опр. (9 без инфекции)26 мг/кг0,2 мг/кг6,28±1,36Не опр. (7 без инфекции)3,51±0,63 (5 без инфекции)36 мг/кг-6,53±1,53Не опр. (8 без инфекции)3,63±0,91 (5 без инфекции)4-2,0 мг/кг7,30±1,26Не опр. (8 без инфекции)3,54±0,61 (4 без инфекции)5-0,2 мг/кг7,50±1,534,28±1,28 (2 без инфекции)3,91±0,87 (3 без инфекции)6--7,65±1,624,34±1,37 (1 без инфекции)4,57±1,53 (1 без инфекции)

Введение одного препарата: Aurograb, введенный один в дозе 2,0 мг/кг (группа 4), привел к результату, сопоставимому с введением одного ванкомицина (группа 3), каждый из которых освобождал от инфекции печень 8 мышей и селезенку 4 и 5 мышей, соответственно, по сравнению с освобождением от инфекции печени и селезенки у одной мыши в группе отрицательного контроля (группа 6). Освобождение от инфекции почек было лучше при применении ванкомицина по сравнению с Aurograb, хотя ни одна из мышей не была освобождена от почечной инфекции.

Мыши в синергичной группе (группа 1), получавшие 2,0 мг/кг Aurograb плюс ванкомицин (6 мг/кг), показали полное освобождение печени от стафилококков у всех 10 мышей и повышенное освобождение селезенки с отрицательной культурой у 9 мышей по сравнению с 4-5 освобожденными Aurograb или ванкомицином по отдельности или 1 освобожденной в необработанной группе. Число колоний в почках мышей получавших сочетанную терапию (группа 1) было снижено на величину 0,5 log по сравнению с мышами, получавшими только ванкомицин (группа 3), и снижена на 1,6 log по сравнению с мышами отрицательного контроля (группа 6). Это демонстрирует синергизм между Aurograb и ванкомицином.

Данные цикла 4: синергизм Aurograb с ванкомицином: летальная модель.

Цели: Демонстрация того, что Aurograb является антибактериальным агентом при введении его одного и синергичным в сочетании с ванкомицином при введении мышам, инфицированным летальной дозой S. aureus.

Задача: Демонстрация антибактериальной активности по снижению летальности в случае одного Aurograb. Демонстрация синергизма по большему снижению летальности при введении Aurograb в сочетании с ванкомицином, в отличие от введения одного ванкомицина.

Способ: 60 самок мышей CD-1 (22-24 г) получали S. aureus (свежий клинический изолят EMRSA-15) в дозе 8·10⁷ КОЕ в виде 100 мкл в/в болюса. Через 2 часа группы из 10 мышей получали в виде однократного 100 мкл в/в болюса:

Группа 1 - 4,0 мг/кг ванкомицин + 2,0 мг/кг Aurograb.

Группа 2 - 4,0 мг/кг ванкомицин.

Группа 3 - 2,0 мг/кг ванкомицин + 2,0 мг/кг Aurograb.

Группа 4 - 2,0 мг/кг ванкомицин.

Группа 5 - 2,0 мг/кг Aurograb.

Группа 6 - плацебо.

Всех мышей забивали через 48 часов для культивирования почек, печени и селезенки.

Смертельные случаи до 48 часов в выборке для подсчета колоний в органах не использовали.

Результаты: выражены в виде log КОЕ на грамм ткани, хотя большинство мышей (>5) погибло.

Таблица 8ГруппаВанкомицинAurograbВыжившие к 24 час (n=10)ПочкиПеченьСелезенка    Log КОЕ/г ткани14,0 мг/кг2,0 мг/кг87,25±1,324,55±1,434,24±0,9624,0 мг/кг-4Статистически слишком мало выживших32,0 мг/кг2,0 мг/кг67,66±1,475,55±1,415,16±1,0242,0 мг/кг-5Статистически слишком мало выживших5-2,0 мг/кг67,87±15,18±0,575,53±2,746--3Статистически слишком мало выживших

Смертность: Данный штамм S. aureus, возможно благодаря тому, что он являлся свежим клиническим изолятом, был более вирулентным на мышиной модели по сравнению с ранее применявшимся лабораторным штаммом EMRSA-15, и наблюдался больший уровень смертности. Введение одного Aurograb (2,0 мг/кг) было связано со снижением летальности (4 гибели) по сравнению с необработанной группой (7 гибелей), сопоставимым с летальностью при введении одного ванкомицина (6 и 5 гибелей). Это позволяет предполагать, что Aurograb обладает сопоставимой с ванкомицином в дозе 4,0 мг/кг внутренней антистафилококковой активностью.

Синергизм: Мыши, получавшие сочетанное лечение (Aurograb 2,0 мг/кг и ванкомицин 4,0 мг/кг), обладали большей выживаемостью по сравнению с получавшими один ванкомицин или один Aurograb, что предполагает синергизм действия двух лекарств.

5. Фармакокинетика и метаболизм продукта у животных

5.1 Фармакокинетика

Фармакокинетические (PK) свойства Aurograb исследовали на мышах. Мышиную модель применяли, поскольку исследования эффективности и диапазона доз проводили на данном виде, а также были проведены повторные токсикологические исследования. Мышам вводили однократную высокую дозу в виде в/в болюса и затем обследовали в двух параллельных определениях на предмет содержания в крови и распределения по органам. Анализировали также образцы мочи. Образцы анализировали на функциональную активность, измеряемую с помощью ELISA (только образцы крови), и концентрацию лекарства (иммуноблотты SDS PAGE).

Результаты: Результаты показаны на чертеже. Мыши, получавшие однократную внутривенную болюсную инъекцию Aurograb (10 мг/кг), показали удовлетворительный уровень в крови.

Все органы (легкие, мозг, печень, селезенка, сердце, почки и кровь) освобождались к 24 часам.

6.2 Исследование совместимости с кровью

Данное исследование проводилось департаментом биохимической фармакологии Inveresk Research, Шотландия, для оценки пригодности Aurograb для внутривенного введения.

Образцы крови от здоровых добровольцев переносили в пробирки, содержащие Aurograb, носитель Aurograb, сапонин или физиологический раствор и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После центрифугирования оценивали количество гемоглобина в супернатанте для определения гемолиза. В соответствии с системой классификации (ASTM F756-93, 1993) Американского общества тестирования и материалов результаты показали, что 0,1 мг/мл Aurograb и носитель Aurograb не были гемолитическими. Это было сопоставимо с физиологическим раствором, который не был гемолитическим, и было полной противоположностью положительному референтному соединению (сапонину), который, как было обнаружено, является сильным гемолитиком.

7. Получение антитела Aurograb

7.1 Введение

Aurograb получают в E. coli в форме включенных тел. Выделение, солюбилизация, денатурация и повторная укладка включенных тел были ранее хорошо документированы (см. 'Antibodies: A Laboratory Manual'. Harlow, E. and Lane, D. 1988. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 'Inclusion bodies and purification of proteins in biologically active forms'. Mukhopadhyay A. 1997. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 56: 61-109). Пример такой процедуры описан в данной заявке. Вкратце, включенные тела экстрагировали из клеточной массы, солюбилизировали/денатурировали, подвергали повторной укладке и очищали с помощью хроматографии. Гиперэкспрессию Aurograb обеспечивает сильный промотор T7 в векторе pET29b (Novagen). Клеточную массу производят в виде контролируемой по качеству, чистой культуры, получаемой в стерильном ферментере (1000 л) с применением среды, свободной от животных продуктов. Применяемый штамм E. coli является генетически модифицированным (не способным к колонизации/существованию в окружающей среде) и авирулентным. Загрязнениями, удаляемыми в ходе последующей обработки, являются таким образом (1) белки клетки хозяина и E. coli (HCP), (2) пирогены E. coli (преимущественно эндотоксин), (3) добавки для культивирования (антибиотики), (4) добавки последующей обработки (буферы и NiSO₄).

Большое количество загрязнений из E. coli и практически все загрязнения, происходящие из среды культивирования, удаляются в процессе экстракции белка из включенных тел. Для этого клеточную массу выделяют центрифугированием и разрушают с помощью микрофлюидизатора. Включенные тела Aurograb отделяют от клеточной массы с помощью трех стадий центрифугирования-ресуспендирования-микрофлюидизации, в результате чего производится интенсивная промывка включенных тел. Включенные тела солюбилизируются и подвергаются повторной укладке на протяжении двух дней в присутствии хлорида меди, который служит в качестве катализатора окисления, в результате чего устанавливается правильная биологически активная структура молекулы Aurograb. Для удаления малых молекул из реакционной смеси повторной укладки и следовых остатков канамицина (из реакционной смеси культивирования) производят интенсивную диафильтрацию. Оставшиеся белки клетки-хозяина удаляют с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном металлическом никеле (IMAC) и анионообменной хроматографии. В частности, эндотоксин, который представляет собой значительную проблему для безопасности для лекарств, полученных из E. coli, эффективно удаляется при IMAC добавлением дезоксихолевой кислоты. Последние следы HCP E. coli удаляются на стадии анионообменной хроматографии. Следы никеля со стадии IMAC удаляются с помощью аффинной колонки для никеля. Наконец, малые молекулы из хроматографической буферной системы удаляются с помощью диафильтрации против буфера для состава. Основную массу продукта лиофилизируют в сосудах для применения больным. Перечисленные ниже параграфы конкретно детализируют получение антитела Aurograb.

7.2 Протокол получения Aurograb

Культивирование и последующую обработку проводили в общей сложности с помощью следующих девяти стадий:

1. Культивирование.

2. Сбор и выделение включенных тел.

3. Повторная укладка.

4. Концентрирование и диафильтрация.

5. Фильтрация и стерильная фильтрация.

6. Очистка - аффинная хроматография на иммобилизованном металлическом никеле (Ni²⁺) (IMAC).

7. Очистка - удаление никеля с помощью хроматографии на хелатирующей сефарозе.

8. Очистка - анионообменная хроматография.

9. Диафильтрация и заготовка в объеме.

7.3 Ферментация

Замороженный запас экспрессирующей Aurograb E. coli (клон JM109 DE3)(pSaABC4)) инокулировали в конические стеклянные сосуды 4·500 мл для получения инокулята перед переносом в 1000-л перемешиваемый ферментер (MBR). Предварительные культуры (с добавкой канамицина) инкубировали при 37°С при встряхивании в течение 15-20 час до достижения предварительной культурой ОП₅₇₈=4,0-8,0, что соответствует 7-8 делениям клеток. В промышленном масштабе предварительные культуры переносили в 1000-л ферментер (MBH), содержащий 1000 л питательного бульона. Продуцирующую культуру инкубировали при 37°С в общей сложности в течение 14-18 час, что соответствует 7 делениям клеток. Приблизительно через 10-13 час после инокуляции, когда ОП₅₇₈=5-8, продуцирующую культуру индуцировали посредством добавления 23,8 г IPTG (100 мкМ).

7.4 Сбор и выделение включенных тел

Клетки собирали центрифугированием (через 4 час после индукции) при 12800 g на центрифуге Alfa Laval BTPX 205 при скорости потока приблизительно 400 л/час. Собранную клеточную массу E. coli хранили при -50°С в мешках PE (Kendro). Последующая обработка 100% клеточной массы из одной партии культивирования, которая хранилась при -50°С, состояла в однократной очистке партии. Клеточную массу оттаивали и ресуспендировали в 1000 л буфера для лизиса. Ресуспендированные бактериальные клетки обрабатывали в гомогенизаторе высокого давления (APV Gaulin MC15) при приблизительно 1000 бар (15000 фунтов на кв.дюйм) со скоростью потока приблизительно 500 л/час. Включенные тела осаждали центрифугированием при приблизительно 12800 g при скорости потока приблизительно 400 л/час. Включенные тела затем промывали 400 л буфера для лизиса и осаждали центрифугированием при приблизительно 12800 g при скорости потока приблизительно 400 л/час в общей сложности три раза. Промытые включенные тела хранили в виде суспензии при -70°С перед стадией повторной укладки. Включенные тела солюбилизировали интенсивным перемешиванием в течение 5-10 минут в 40 л 6 М мочевины/100 мМ Трис рН 12,5 при комнатной температуре.

7.5 Повторная укладка

Для повторной укладки раствор включенных тел доводили до 560 л с помощью буфера для повторной укладки и добавляли CuCl₂.2 H₂O до конечной концентрации 100 мкМ. Препарат инкубировали в течение 48 час при 2-8°С при интенсивном перемешивании. Включенные тела фильтровали (Sartorius GF 30", 3,0/0,8 мкм) и затем стерилизовали фильтрованием (Seitz Supradisc SDPEK 1, объемный фильтр).

7.6 Концентрирование и диафильтрация

Стадии концентрирования и диафильтрации проводили с применением кассет (15 м²) проточных пластин Omega с исключением 10 кДа (Pall), установленных в держателе из нержавеющей стали "Centrasette" (Pall), под контролем 1000-мембранного поршневого насоса (четырехтактного насоса). Препарат повторно уложенного белка концентрировали до 150 л с последующей диафильтрацией с 3000 литров 10 мМ аммоний-ацетатного буфера, рН 9,5. Препарат доводили до 6 М мочевины, 50 мМ Трис, 10 мМ DCA, 1 М NaCl и доводили до конечного объема 300 л воды квалитета для RO. Диафильтрованный повторно уложенный белок хранили в течение ночи при 2-8°С. Затем рН доводили до 8,0 путем добавления HCl.

7.7 Стадии фильтрации и стерильной фильтрации

Диафильтрованный повторно уложенный белок фильтровали (Seitz Supradisc SDPEK1, объемный фильтр) и затем стерилизовали фильтрованием (Millipore Opticap 10', 0,2 мкм). Стерильный продукт хранили при 2-8°С.

7.8 Аффинная хроматография на иммобилизованном металлическом Ni²⁺ (IMAC)

Стадию IMAC проводили на колонке BPG300/500 (Amersham Pharmacia). Стерилизация хроматографических колонок происходила во время очистки смолы на месте (CIP). Хроматографическую смолу IMAC (18 л) сначала загружали 2 объемами колонки (CV) 100 мМ NiSO₄.6H₂O. При хроматографии применяли 5,5 (CV) уравновешивающего буфера (IMAC A); 5,5 CV буфера для промывки I (IMAC B); 3,3 CV буфера для промывки II (IMAC C); 5,5 CV буфера для элюции (IMAC D). Собранные фракции элюата стерилизовали фильтрацией (Millipore Opticap 10", 0,2 мкм) и хранили в течение ночи при 2-8°С.

7.9 Хроматография для удаления никеля

Хроматографию для удаления никеля проводили на колонке BPG 140/500 (Amersham Pharmacia) с применением 2 л хелатирующей смолы сефарозы. Колонку уравновешивали и промывали 5 CV буфера (IMAC D), наносили раствор, содержащий антитело Aurograb, колонку промывали 2 CV анион/кондиционирующего буфера (50 мМ Трис, 6 М мочевины, рН 8,7), элюат сохраняли до анионообменной хроматографии.

7.10 Анионообменная хроматография

Стадию анионообменной хроматографии проводили на колонке BPG 300/500 (Amersham Pharmacia) с применением 18 л смолы (Q-сефароза FF). Колонку уравновешивали с применением буфера для уравновешивания и затем анион/кондиционирующего буфера. Наносили раствор, содержащий антитело Aurograb, промывали 2 CV анион/кондиционирующего буфера, незадерживаемую фракцию стерилизовали фильтрованием (Millipore Opticap 10", 0,2 мкм) и хранили в течение ночи при 2-8°С.

7.11 Диафильтрация и заполнение объема

рН стерильной незадерживаемой фракции (содержащей антитело Aurograb) доводили до 9,5 и затем диафильтровали против 10 обратных объемов (TOV) 10 мМ ацетата аммония; 0,5 М мочевины, рН 9,5. После этого проводили другую стадию диафильтрации против 5 TOV 0,5 М мочевины, 0,2 М аргинина, рН 9,5. Белок концентрировали до 2 мг/мл, стерилизовали фильтрацией (Millipore Opticap 10", 0,2 мкм) в пакете Stedim и хранили в течение ночи при 2-8°С.

7.12 Состав буферов, сред и растворов

Среды роста:

Среды контролировали на предмет микробного загрязнения перед инокуляцией.

Для 2,5 л предварительной культуры:

Пептон A3 из соевых бобов (Organotechnie)67,5 гАутолизат дрожжей (KAV; Deutsche Hefewerke)35,0 гХлорид натрия (Ph. Eur, E. Merck)12,5 гГлицерин (Ph. Eur, E. Merck)75,0 гДикалийфосфат (Ph. Eur, E. Merck)11,5 гДигидрофосфат калия (Ph. Eur, E. Merck)7,5 гГептагидрат сульфата магния (Ph. Eur, E. Merck)1,25 гКанамицина сульфат (Sigma)62,5 мгВода квалитета RO I2,5 литрарН7,1±0,1

Предварительно взвешенные вещества указанной выше таблицы растворяют в 2,5 л воды RO I. После стерилизации бульона добавляли 10 мл канамицина сульфата (62,5 мг в 50 мл WFI).

Состав для 1000 л культуры:

Пептон из соевых бобов (Organotechnie)27,0 кг Аутолизат дрожжей (KAV; Deutsche Hefewerke)14,0 кгХлорид натрия (Ph. Eur, E. Merck)5,0 кгГлицерин (Ph. Eur, E. Merck)30,0 кгДинатрийфосфат (Ph. Eur, E. Merck)4,6 кгДигидрофосфат натрия (Ph. Eur, E. Merck)3,0 кгГептагидрат сульфата магния (Ph. Eur, E. Merck)0,5 кгСтруктол (пеногаситель, Sichler)600 млКанамицина сульфат (USP, Sigma)25,0 гВода квалитета RO I1000 литроврН7,0±0,2

1000-л ферментер стерилизовали в течение 30 минут при 121°С.

IPTG:

23,8 г IPTG (Sigma) растворяли в 200 мл WFI и стерилизовали фильтрованием (0,2 мкм).

Буфер для лизиса клеток

Трис (Ph. Eur, E. Merck)6,06 г·л^-1ЭДТА (Ph. Eur, E. Merck)0,37 г·л^-1Хлорид калия (DAB, E. Merck)7,46 г·л^-1Вода квалитета RO I вода 1000 литроврН8,0±0,1

Буфер для повторной укладки

Трис (DAB, E. Merck)5,96 г·л^-1Хлорид меди II (например, E. Merck)0,018 г·л^-1Вода квалитета RO I (1000-л контейнер из нержавеющей стали)600 литроврН9,0±0,1

Буфер для диафильтрации:

Ацетат аммония (E. Merck)0,77 г·л^-1Вода квалитета RO I1000 литроврН9,0±0,1

Буферы IMAC:

Получение образца

Трис 1,82 кгМочевина108 кгХлорид натрия17,5 кгДезоксихолевой кислоты натриевая соль1,30 кг

Состав 150-л реакционной смеси после диафильтрации и повторной укладки доводили указанными выше реагентами.

Буферы для IMAC хроматографии:

Раствор никеля: 100 мМ NiSO₄.6 H₂O (2 CV)

IMAC A/уравновешивающий буфер: 100 мМ Трис; 6 М мочевина; 1 М NaCl; 10 мМ DCA, pH 8,0

IMAC B/буфер для промывки: 100 мМ Трис; 6 М мочевина; 1 М NaCl; 50 мМ имидазол; 10 мМ DCA, pH 8,0

IMAC C/буфер для элюции I: 100 мМ Трис; 6 М мочевина; 1 М NaCl; 150 мМ имидазол, pH 8,0 (10-15 CV)

IMAC D/буфер для элюции II: 100 мМ Трис; 6 М мочевина; 1 М NaCl; 300 мМ имидазол, pH 8,0 (7 CV)

CIP: 1 М NaOH (3 объема колонки, время инкубации 1 час)

Буферы получали с применением Трис (USP, E.Merck), мочевины (USP, E.Merck или Riedel de Haen), NaCl (Ph. Eur, E.Merck), имидазола (например, Fluka), DCA (моногидрат натриевой соли дезоксихолевой кислоты, Microselect, Fluka), NiSO₄.6 H₂O (например, E.Merck)

Буферы для удаления Ni²⁺ хроматографией:

Уравновешивающий буфер: 100 мМ Трис; 6 М мочевина; 50 мМ NaCl; 300 мМ имидазол, pH 8,0 (5 CV)

Буферы для анионообменной хроматографии:

Уравновешивание: 100 мМ Трис; 6 М мочевина; 50 мМ NaCl; 300 мМ имидазол, pH 8,7

CIP: 1 М NaOH (3 CV, время инкубации 1 час)

Буфер диафильтрации и состава

Для стерилизации и хранения кассеты для диафильтрации споласкивали водой RO, подвергали рециркуляции в течение, по меньшей мере, 45 минут c 0,5 М NaOH и хранили с 0,1 М NaOH.

Буфер для диафильтрации: 0,5 М мочевина; 10 мМ ацетат аммония, рН 9,5

Буфер для диафильтрации (состава): 0,5 М мочевина; 0,2 М аргинин, рН 9,5

Диафильтрация и концентрирование (2 кассеты, Omega проточные пластины, 10 KD, Pall)

8. Определение синергетического эффекта Aurograb и ванкомицина

8.1 Способ

Для определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC), долевой ингибирующей концентрации (FIC) и FIX (долевого индекса ингибирования) применяли следующий способ.

Представители каждого из наиболее обычных штаммов EMRSA, ряда субпопуляций, устойчивых к ванкомицину, и три устойчивых к линзолиду штамма выращивали в течение ночи в питательном бульоне. Клетки разбавляли в бульоне Isosensitest (Oxoid, UK) с получением конечного посевного материала 1·10³ клеток на мл. 100-мкл аликвоты культуры помещали в микропланшеты с плоским дном для микротитрования и добавляли ванкомицин в диапазоне 0,125-250 мкг/мл. Туда добавляли экзогенный Aurograb в диапазоне 0,3-25 мкг/мл в шахматном порядке. Готовили также серии отрицательного контроля, содержащие лишь буфер для состава Aurograb. Культуры инкубировали в течение 48 часов при 37°С.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) определяли как наименьшую концентрацию агента, при которой не происходил бактериальный рост, и определяли с помощью спектрофотометрической оценки отсутствия помутнения (роста) в культуре. Данное оптическое осветление было эквивалентно гибели >99% стафилококков.

8.2 Результаты

Величины MIC были получены для ванкомицина и Aurograb (зарегистрированная товарная марка) раздельно и в сочетании. Рассчитывали величины долевых ингибирующих концентраций (FIC) и FIX. Синергетическую активность между двумя агентами определяли как величину FIX<0,5. Принимали, что индифферентная активность составляет величину 0,5-4, а величина ≥4 определяет антагонизм.

Результаты эксперимента представлены ниже в таблицах 9 и 10. VAN обозначает ванкомицин. Колонка MIC (отдельно) обозначает минимальную ингибирующую концентрацию агента при изолированном введении. Колонка MIC (в сочетании) обозначает минимальную концентрацию каждого лекарства при применении в сочетании.

8.3 Заключение

Как можно видеть из таблиц 9 и 10, введение Aurograb с ванкомицином приводит к синергетическому терапевтическому действию с существенно сниженными уровнями MIC, что в свою очередь указывает на то, что лечение больных может быть достигнуто с применением меньших доз антибиотиков при увеличенном терапевтическом эффекте при ожидаемом снижении возможных побочных эффектов, вызываемых антибиотиком. Результаты показывают, что даже в тех случаях, когда больной инфицирован устойчивым к ванкомицину S. aureus, его можно успешно лечить антителом настоящего изобретения, и его применение в сочетании с антибиотиками, такими как ванкомицин, может обеспечивать лечение при ранее показанных неэффективных, нетоксичных уровнях дозы антибиотика.

Таблица 9Штамм EMRSAСредствоMIC (мкг/мл) каждого средстваFIC (мкг/мл)FIXРезультат  Раздель-ноВ сочетании   1VAN0,50,030,060,066Синергизм Aurograb1250,750,006  1АVAN810,1250,17Синергизм Aurograb25012,50,05  2VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb1250,750,006  2АVAN810,1250,17Синергизм Aurograb25012,50,05  3VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb25030,012  4VAN0,50,030,060,06Синергизм Aurograb1250,3250,0026  5VAN0,50,030,060,06Синергизм Aurograb2500,3250,001  6VAN0,50,1250,0250,03Синергизм Aurograb1250,3250,0026  7VAN0,50,030,060,06Синергизм Aurograb1250,3250,0026  8VAN0,50,030,0250,06Синергизм Aurograb2500,3250,0013  8АVAN0,50,030,060,11Синергизм Aurograb25012,50,05  9VAN0,50,01250,0250,03Синергизм Aurograb1250,750,006  10VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb1251,50,012  11VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb1250,750,006  11АVAN410,250,30Синергизм Aurograb25012,50,05  12VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb2500,3250,0013  12АVAN0,50,030,060,06Синергизм Aurograb2500,750,003  13VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb2501,50,006  14VAN0,50,030,060,08Синергизм Aurograb1251,50,012  15VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb1251,50,012  15АVAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb2500,750,006  16VAN0,50,030,060,07Синергизм Aurograb2501,50,012  17VAN410,250,25Синергизм Aurograb2500,750,006  Таблица 10Штамм EMRSAСредствоMIC (мкг/мл) каждого средстваFIC (мкг/мл)FIXРезультат  Раздель-ноВ сочетании   NARSA 1 (Hiramatsu)VAN820,250,25Синергизм Aurograb2500,3250,001  NARSA 2 (Hiramatsu)VAN30,50,170,17Синергизм Aurograb2500,3250,001  NARSA 12 (France)VAN810,120,12Синергизм Aurograb2500,750,003  NARSA 17 (New York)VAN820,250,25Синергизм Aurograb2500,3250,001  NARSA 119 (Linezolid R)VAN410,250,27Синергизм Aurograb12530,02  NARSA 120 (Linezolid R)VAN410,250,27Синергизм Aurograb12530,02  NARSA 121 (Linezolid R)VAN410,250,27Синергизм Aurograb12530,02  

Изобретение относится к медицине и касается антитела, лекарства на его основе для лечения или диагностики инфекции, вызываемой микроорганизмом, экспрессирующим гомолог белка GrfA. Изобретение также раскрывает способ получения указанного лекарства, а также фармацевтическую упаковку для лечения указанного заболевания. Описанное антитело имеет установленную аминокислотную последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO:2, приведенную в описании, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом, предоставляемым пептидом с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:3, раскрытой в описании. Использование изобретения позволяет повысить терапевтическую эффективность гликопептидного антибиотика по сравнению с использованием одного антибиотика. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 10 табл.

1. Антитело, имеющее последовательность SEQ ID NO:2, или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с эпитопом, предоставляемым пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.2. Лекарство, включающее терапевтически эффективное количество гликопептидного антибиотика и антитела, специфичного в отношении эпитопа, предоставляемого пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, где лекарство применяется при лечении или диагностике инфекции, вызываемой микроорганизмом, который экспрессирует гомолог белка GrfA.3. Лекарство по п.2 для лечения инфекции, вызываемой грамположительными бактериями.4. Лекарство по п.2, где указанное антитело имеет последовательность SEQ ID NO:2.5. Лекарство по п.2, где указанный гликопептидный антибиотик выбран из группы, состоящей из ванкомицина, тейкопланина и даптомицина.6. Лекарство по п.5, где указанный гликопептидный антибиотик выбран из группы, состоящей из ванкомицина, тейкопланина и даптомицина.7. Способ получения лекарства для лечения инфекции, вызываемой микроорганизмом, который экспрессирует гомолог белка GrfA, отличающийся тем, что применяется терапевтически эффективное количество гликопептидного антибиотика и антитела, специфичного в отношении эпитопа, предоставляемого пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.8. Способ по п.7, где указанное антитело имеет последовательность SEQ ID NO: 2.9. Способ по п.7, где указанный гликопептидный антибиотик выбран из группы, состоящей из ванкомицина, тейкопланина и даптомицина.10. Способ по п.8, где указанный гликопептидный антибиотик выбран из группы, состоящей из ванкомицина, тейкопланина и даптомицина.11. Фармацевтическая упаковка для лечения инфекции, вызываемой микроорганизмом, который экспрессирует гомолог белка GrfA, где фармацевтическая упаковка включает терапевтически эффективное количество гликопептидного антибиотика и антитела, специфичного в отношении эпитопа, предоставляемого пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.12. Фармацевтическая упаковка по п.11, где указанное антитело имеет последовательность SEQ ID NO:2.13. Фармацевтическая упаковка по п.11, где указанный гликопептидный антибиотик выбран из группы, состоящей из ванкомицина, тейкопланина и даптомицина.14. Фармацевтическая упаковка по п.12, где указанный гликопептидный антибиотик выбран из группы, состоящей из ванкомицина, тейкопланина и даптомицина.15. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по любому из пп.2, 4-6, или 7-10, или 11-14, где указанная инфекция вызывается грамположительной бактерией.16. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по п.15, где указанная бактерия представляет собой стафилококк.17. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по п.16, где указанная бактерия представляет собой негативный в отношении коагулазы стафилококк.18. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по п.17, где указанный стафилококк выбран из группы, состоящей из S. haemolyticus, S. epidermidis и S. saprophyticus.19. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по п.17, где указанная бактерия представляет собой позитивный в отношении коагулазы стафилококк.20. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по п.19, где указанный стафилококк представляет собой S. aureus.21. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по п.15, где указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Enterococcus sp., Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Corynebacterium sp., Corynebacterium jeikeium и Corynebacterium xerosis.22. Лекарство или способ его получения или фармацевтическая упаковка по п.15, где указанная бактерия устойчива к лечению одним указанным гликопептидным антибиотиком.