СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АЛЛЕРГЕНА Российский патент 2007 года по МПК A61K39/35 G01N33/53 

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из дафний.

Известен способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья, в качестве которой используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус и водно-солевую экстракцию исходного сырья. (RU 2265450, А61К 39/00, 2005 г.)

Среди агентов, являющихся аллергизирующими факторами, выделяются различные виды рода Daphnia, так как они широко применяются для кормления рыб в аквариумах.

В результате контакта с дафнией чаще всего возникают аллергические заболевания респираторного аппарата (бронхиальная астма, аллергический ринит). Нередким клиническим проявлением аллергии к дафнии служит аллергический конъюнктивит. Аллергия к дафнии может осложнять течение других форм экзогенно- и эндогенно-аллергических заболеваний.

Для диагностики повышенной чувствительности к дафнии необходим аллерген, который можно использовать как для постановки кожных проб у больных, так и для использования в реакциях ин витро. Коммерческого аллергена из дафнии в нашей стране нет, поэтому разработка технологии этого препарата позволит проводить диагностику повышенной чувствительности к дафнии.

К препаратам, которые необходимы практическому здравоохранению, можно отнести аллерген из дафний.

Техническим результатом изобретения является расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностики заболеваний, вызванных сенсибилизацией к дафниям.

Для достижения указанного технического результата в способе получения диагностического аллергена, включающем щелочную экстракцию исходного сырья, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют дафнии, предварительно обезжиренные этиловым эфиром, высушенные и измельченные до порошкообразного состояния, экстрагирование обезжиренного порошка проводят 0,1 моль/л раствором гидроокиси натрия в течение 3 суток при температуре 4-8°С, после экстрагирования надосадочную жидкость сливают и производят осаждение белка из щелочного экстракта бензойнокислым натрием из расчета: на 1 л щелочного экстракта 20 г бензойнокислого натрия, снижают рН щелочного экстракта до 3,7, осаждают выпавшую в осадок бензойную кислоту с адсорбированным аллергеном центрифугированием в течение 5 минут при 2000 об/мин, производят десорбцию аллергена с бензойной кислоты добавлением к осадку ацетона, перемешивают до полного растворения бензойной кислоты, после чего помещают на 12-18 часов в холодильник с температурой -20°С, раствор фильтруют, выдерживают 18-20 часов до полного испарения следов ацетона, порошок аллергена экстрагируют в течение 3 суток, центрифугируют аллергенный экстракт при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей стерилизующей фильтрацией до получения готовой формы диагностического аллергена.

Сущность изобретения поясняется следующим примером.

Пример. Для получения диагностического аллергена в качестве исходного сырья используют смесь сухих дафний, применяемых для корма рыб. Обезжиривание сырья производят этиловым эфиром из расчета: 100 грамм сухих дафний на 400 мл эфира. Полностью обезжиренное сырье рассыпают на эмалированные лотки с фильтровальной бумагой и сушат в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Измельчение обезжиренного сырья дафний производят в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. Для получения щелочного экстракта обезжиренный порошок помещают в бутыль и заливают 5 литрами 0,1 моль/л гидроокиси натрия. Экстрагирование проводят в течение 3 суток в режиме: ежедневно содержимое бутыли перемешивают на аппарате для встряхивания при температуре от 15 до 26°С по 30-40 минут с интервалом 1-1,5 часа. Остальное время в холодильной камере с температурой от 2 до 10°С. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Осаждение белка из щелочного экстракта производят бензойнокислым натрием, для чего его взвешивают и вносят в щелочной экстракт из расчета: на 1 л щелочного экстракта 20 грамм бензойнокислого натрия. Затем снижают рН щелочного экстракта 2,0 моль/л раствором соляной кислоты до 3,7. При этом образуются кристаллы бензойной кислоты, на которых адсорбируется аллерген. Выпавшую в осадок бензойную кислоту с адсорбированным аллергеном осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 200 об/мин.

Десорбцию аллергена с бензойной кислоты производят добавлением к осадку ацетона, в котором происходит растворение бензойной кислоты, аллерген при этом выпадает в осадок. Десорбцию аллергена производят следующим образом: в бутыль вместимостью 5 литров переносят осадок из центрифужных пробирок, затем вливают туда 3,0 литра охлажденного ацетона. Перемешивание производят до полного растворения бензойной кислоты, после чего бутыль помещают на ночь в холодильную камеру с температурой -20°С.

На следующий день работу производят в вытяжном шкафу. На дно воронки Бюхнера укладывают фильтр, вырезанный из фильтровальной бумаги по диаметру воронки. Подключают колбу Бунзена к вакууму, смачивают фильтр ацетоном и при вакууме 0,06·10⁶ Па начинают фильтрацию. Аллерген, сорбированный на фильтровальной бумаге после полного отсоса ацетона, промывают чистым ацетоном в количестве 2,0 литров и отключают вакуум. Фильтр с порошкообразным аллергеном для полного испарения ацетона оставляют между листами фильтровальной бумаги в вытяжном шкафу при температуре от 16 до 26°С на 18-20 часов.

Водно-солевая экстракция.

Порошок аллергена помещают в фарфоровую ступку и добавляют 100 мл жидкости для экстрагирования, перемешивая пестиком до гомогенной суспензии. Затем переносят в бутыль емкостью 10,0 литров, в которую добавляют еще 4,9 литра жидкости для экстрагирования. Содержимое бутыли осторожно перемешивают, исключая сильное вспенивание. Бутыль оставляют на 30-40 минут при температуре от 16 до 26°С, после чего контролируют значение рН. Далее бутыль с раствором аллергена помещают в холодильную камеру с температурой от 2 до 10°С.

В последующие три дня для более полного извлечения белково-полисахаридных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом в 1,5 часа. В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться при температуре от 2 до 10°С. В конце рабочего дня ежедневно контролируют рН раствора и проводят коррекцию рН до значения 7,0±0,2 добавлением 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты.

После окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование на рефрижераторной центрифуге при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр.

Проводят стерилизующую фильтрацию.

В день проведения названной операции необходимо проконтролировать рН приготовленного аллергена.

Стабилизация маточного раствора.

Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических и биологических свойств выдерживают от 3 до 5 месяцев при температуре от 2 до 10°С

В тех случаях, когда содержание белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 7000⁺2000 PNU/мл, маточный раствор аллергена в период стабилизации разводят стерильной экстрагирующей жидкостью до содержания 5000-2000 PNU/мл.

После разлива аллергена получают готовую форму препарата.

Полученный препарат изучали с использованием методов, позволяющих оценить физико-химические свойства, а также его специфическую активность. Специфическую активность полученных препаратов изучали в реакции непрямой дегрануляции тучных клеток крыс (РНДТК) и путем определения электрофоретической подвижности клеток (ЭФП), в реакциях использовали сыворотки больных, имеющих в анамнезе контакт с дафниями и связывающих свое заболевание с ними. Средний показатель (РНДТК) (из 25 определений) с сыворотками сенсибилизированных морских свинок и аллергеном из дафний составил 26,84+1,6%. Эти данные свидетельствуют о том, что сенсибилизация аллергеном из дафний сопровождается появлением в сыворотке животных реагиновых антител, которые участвуют в реакциях немедленного типа.

Контроль сенсибилизирующих свойств диагностической дозы аллергена проведен в соответствии с "Методическими указаниями к первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов". Были испытаны две дозы аллергена: 10000 PNU и 5000 PNU. Установлено, что аллерген в этих дозах не обладает сенсибилизирующими свойствами, повторные кожные пробы оставались отрицательными.

Далее испытание диагностической ценности препарата проводили по программе, утвержденной Комитетом по медицинским иммунобиологическим препаратам на взрослых (от 15 лет и старше) в трех медицинских учреждениях города Москвы. Испытание диагностической ценности аллергена проводили путем постановки скарификационных кожных проб. Было обследовано 33 человека, из них положительная кожная проба была у 18 человек (54%). Общих токсических и местных гиперергических реакций не наблюдали.

Таким образом, аллерген из дафний (по результатам испытаний на ограниченных контингентах) является специфичным, не обладает побочным действием.

В контрольной группе (не сенсибилизированных к дафниям) - 10 человек - результаты отрицательные.

Исследования аллергена из дафний методом твердофазного иммуноферментного анализа показали его высокую специфическую активность. Специфическую активность аллергена из дафний трех серий изучали в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием конъюгата моноклональных анти-Ig-E -антител с пероксидазой корня хрена.

Группу исследования составили 40 атопических больных в возрасте 15 лет и старше с клинически выявленной сенсибилизацией к сухому корму рыб (дафния).

Результаты исследования показали, что аллергенспецифические IgE-антитела к аллергену из дафний выявлялись у 60% обследованных больных, что свидетельствует о высокой специфической активности разработанного аллергена из дафний.

В настоящее время подготовлена "Программа Государственных испытаний аллергена из дафний".

Полученный препарат был изучен в соответствии с "Методическими указаниями к первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов".

Таким образом, получен препарат, не вызывающей сенсибилизации животных в диагностической дозе, обладающей специфической активностью в реакции НДТК крыс.

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из дафний. Сущность изобретения: способ получения диагностического аллергена включает щелочную экстракцию исходного сырья. Согласно изобретению в качестве исходного сырья используют дафнии, предварительно обезжиренные этиловым эфиром, высушенные и измельченные до порошкообразного состояния. Экстрагирование обезжиренного порошка проводят 0,1 моль/л раствором гидроокиси натрия в течение 3 суток при температуре 4-8°С. После экстрагирования надосадочную жидкость сливают и производят осаждение белка из щелочного экстракта бензойнокислым натрием из расчета: на 1 л щелочного экстракта 20 г бензойнокислого натрия, снижают рН щелочного экстракта до 3,7. Осаждают выпавшую в осадок бензойную кислоту с адсорбированным аллергеном центрифугированием в течение 5 минут при 2000 об/мин. Производят десорбцию аллергена с бензойной кислоты добавлением к осадку ацетона. Перемешивают до полного растворения бензойной кислоты, после чего помещают на 12-18 часов в холодильник с температурой -20°С. Раствор фильтруют, выдерживают 18-20 часов до полного испарения следов ацетона. Порошок аллергена экстрагируют в течение 3 суток. Центрифугируют аллергенный экстракт при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей стерилизующей фильтрацией до получения готовой формы диагностического аллергена. Полученный препарат был изучен в соответствии с "Методическими указаниями к первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов". Таким образом, получен препарат, не вызывающий сенсибилизации животных в диагностической дозе, обладающий специфической активностью в реакции НДТК крыс. Испытание диагностической ценности препарата, проведенное по программе, утвержденной Комитетом по медицинским иммунобиологическим препаратам на ограниченных контингентах, показало, что аллерген из дафний является специфически активным и не обладает побочным действием.

Способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют дафнии, предварительно обезжиренные этиловым эфиром, высушенные и измельченные до порошкообразного состояния, экстрагирование обезжиренного порошка из дафний проводят 0,1 моль/л раствором гидроокиси натрия в течение 3 сут при температуре 4-8°С, после экстрагирования надосадочную жидкость сливают и производят осаждение белка из щелочного экстракта бензойнокислым натрием из расчета: на 1 л щелочного экстракта 20 г бензойнокислого натрия, снижают рН щелочного экстракта до 3,7, осаждают выпавшую в осадок бензойную кислоту с адсорбированным аллергеном центрифугированием в течение 5 мин при 2000 об./мин, производят десорбцию аллергена с бензойной кислоты добавлением к осадку ацетона, перемешивают до полного растворения бензойной кислоты, после чего помещают на 12-18 ч в холодильник с температурой -20°С, раствор фильтруют, выдерживают 18-20 ч до полного испарения следов ацетона, порошок аллергена экстрагируют в течение 3 сут, центрифугируют аллергенный экстракт при 5000-6000 об./мин в течение 30-40 мин с последующей стерилизующей фильтрацией до получения готовой формы диагностического аллергена.