Способ получения аллергена Советский патент 1993 года по МПК A61K39/38 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в аллергологии и иммунологии для диагностики аллергических заболеваний и выявления сенсибилизации в лабораторных условиях при использовании в иммунологических тестах у работающих в контакте с волокнистой растительной пылью.

Цель изобретения - повышение специфичности целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что по способу получения аллергена из смешанной растительной пыли (джута, льна, кенафа) путем экстракции исходного сырья в 2,5% раствор хлорида натрия при температуре от 4 до 10°С в течение 5-7 сут при соотношении сырья/экстрагирующий раствор 1:20, прессования, фильтрации экстрата, выдерживание экстракта при температуре от 4 до 10°С, центрифугировании и фильтрации,обработки экстракта бензойно-кислым натрием- и 0,1 нормальным раствором соляной кислоты, обработкой ацетоном, охлажденным до -20°С в течение 18-24 ч при этой температуре, отделением целевого продукта от ацетона фильтрацией, подсушиванием целевого продукта, экстрагированием высушенного целевого продукта нейтральным фосфатным буфером, содержащим 0,2-0,4% фенола в течение 3-4 сут при температуре от 4доЮ°С.

Пример. Исходное сырье экстрагируют 2,5%-ным раствором хлорида натрия в течение 5-7 сут при соотношении сырье/экстракт 1:20. Полученную смесь фильтруют через два слоя батиста, осадок

00 О О

VJ ел

N)

прессуют и удаляют, экстракт повторно фильтруют, выдерживают при температуре от 4 до 10°С в течение 16-20 ч и затем центрифугируют при 25000Д, осадок удаляют. К экстракту добавляют бензойно-кислый натрий из расчета 20 г/л, устанавливают РН в пределах 3,3-3,7 внесением HCI.

В результате образуется бензойная кислота, на которой адсорбируется аллерген.

Для отделения аллергена от бензойной кислоты осадок растворяют в ацетоне, охлажденным до минус 10-20°С и выдерживают 18-20 ч при этой температуре. При этом бензойная кислота растворяется в ацетоне, целевой продукт выпадает в виде хлопьев в осадок. Аллерген отделяют от ацетона фильтрованием, фильтрат удаляют, а осадок промывают охлаждением до -20°С ацетоном, подсушивают при комнатной температуре не менее 24 ч, после чего обрабатывают нейтральным фосфатным буферным раствором с 0,2-0,4% фенолом в течение 3-4 сут при температуре от 4 до 10°С при периодическом встряхивании для лучшего растворения осадка, затем экстракт центрифугируют при 6000 об/мин, осадок удаляют, экстракт фильтруют через бумажный фильтр, проводят диализ, коррекцию РН.

Анализ предполагаемого технического решения по критериям Новизна и Существенные отличия показал следующее: новым является использование в качестве исходного сырья смешанной растительной пыли из джута, льна, кенафа и льна, а также использование для первичного экстрагирования раствора хлорида натрия, получение очищенного препарата, освобожденного от балластных веществ, высокоспецифичного, который может быть использован как in vitro так и In vivo, что расширит диагностические возможности в клинике и лабораторных исследованиях в клинической иммунологии. .

П р и м е р: в результате обследования работающих в контакте со смешанной растительной пылью (джута, льна, кенафа) при кожном тестировании с аллергеном, приготовленным по известному способу выявлен одинаковый процент положительных реакций с аллергеном, приготовленным по заявляемому способу. В то же время in vitro процент выявленных сенсибилизированных лиц по заявленному способу значительно более высокий, чем при тестировании in vivo по известному способу, приготовленного аллергена.

Положительный эффект полученного новым заявленным способом аллергена из смешанной растительной пыли был установлен при использовании его в НСТ-тесте

для выявления сенсибилизации к производственной пыли в инвитровой лабораторной методике.

НСТ - тест заключается в том, что бесцветный раствор красителя нитросинего те- разолия (НСТ) при инкубации со взвесью лейкоцитов фагоцитируется активными ней- трофилами и под влиянием лизосомного фермента НАДФ - оксидазы восстанавливается в нерастворимый формазан темно- синего цвета, который легко идентифицировать в нейтрофилах визуаль- но цит, ко К.А.Лебедев, И.Д.Понякина Им- мунограмма в клинической практике, М.

Наука, 1990, с. 76).

Постановку метода осуществляют обычно в цельной крови по методу Park B.N. и соавт., (1968), мы проводили ее с включением модификации Ю.И.Бажора и соавт.

(1981), см. монографию Лабораторные методы исследования в клинике под ред. В.В.Меньшикова, М., Медицина, 1987, с.135 (в нашей модификации. - изобретение подтверждено на уровне государственной

патентной экспертизы № 4675777) 30-14 (051990 от 21.04.89 г).

. Каплю крови смешивают на предмет- о ном стекле с раствором НСТ, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем в предварительно окрашенном мазке просчитывают количество нейтрофилов, содержащих гранулы формазана. НСТ - тест до настоящего времени применялся для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, мы его использовали и для лабораторной диагностики сенсибилизации к приготовленному заявленным способом аллергену, добавляя его к крови обследованных кон- тингентов. Забор крови проводили из пальца у рабочих длительно контактирующих с волокнистой растительной пылью джута, льна, кенафа (более 10-15 лет) из них 24 чел. с профессиональным заболеванием текстильщиков - биссинозом в фазе ремиссии,

42 етажированных рабочих из цехов обработки текстильного сырья. .

Все они были предварительно обследованы клинически и иммунологически с применением различных методов

функциональной диагностики (ЭКГ. Эхо КС, спирбграфия, пневмотахометрия, спирове- лоэргометрия) рентгенологических и имму- нологических «-тестов I и II уровня. Полученные данные сопоставлены с результатами обследования 30 здоровых лиц (доноры) однородных по полу и возрасту е обследованными контингентами рабочих. В таблице представлены результаты в тесте специфической стимуляции нейтрофилов (НСТ - тест в собственной модификации) к смешанной растительной пыли.

Формула изобретения Способ получения аллергиона путем экстракции растительной пыли в течение 5-7 сут, фильтрации экстракта, осаждения примесей, обработки экстракта бензойно-кислым натрием и его подкислением соляной кислотой, обработки образовавшегося осадка охлажденным до (-20)°С ацетоном, фильтрации, промывки осадка охлажден0

ным ацетоном его сушки, обработки нейтральным фосфатным буфером, содержащем фенол в течение 72-96 ч при температуре 2-10°С, удалении образовавшегося осадка и фильтрации целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности, в качестве растительной пыли используют смешанную растительную пыль из джута, льна и кенафа, а экстракцию проводят 2,5%-ным раствором хлористого натрия при соотношении сырье:раствори- тель1:20.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в аллергологии и иммунологии для диагностики аллергических заболеваний и выявления сенсибилизации в лабораторных условиях при использовании в иммунологических тестах в контакте с волокнистой растительной пылью. Целью изобретения является повышение специфичности целевого продукта. Сущность изобретения заключается в экстракции смешанной растительной пыли из джута, льна и кенафа 2,5%-ным раствором хлористого натрия при соотношении сырье:растворитель 1:20. в течение 5-7 суток, прессования осадка, фильтрации экстракта, осаждении примесей, обработки экстракта бензойно-кислым натрием и его подкислении соляной кислотой, обработке образовавшегося осадка охлажденным ацетоном, его промывке, сушке, обработке ней- тральным фосфатным буфером, содержащем фенол, удалении образовавшегося осадка и фильтрации, Положительный эффект заключается в повышении специфической активности в тестах специфической стимуляции нейт- рофилов. 1 табл. ел