СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА Российский патент 1999 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к способам получения аллергенов, в частности к получению туберкулина для аллергической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Известен способ получения альттуберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза на мясо-гидролизатно-пептонном-картофельно-глицериновом бульоне, температурное воздействие на биомассу в процессе стерилизации при 1 атмосфере в течение 1 - 3 часов и выпаривание культуральной жидкости при 100^oC в течение 20 - 24 часов до активности 90 тысяч туберкулиновых единиц /Т.Е/ в 1 мл.

Недостатком вышеуказанной технологии является длительное температурное воздействие на биомассу микобактерий туберкулеза в процессе стерилизации и выпаривания, что приводит к высокой концентрации балластных веществ среды, на которой выращивались микробы, в первую очередь пептона и продуктов гидролиза белков мяса в конечном продукте, т.к. очистка туберкулина по технологии не предусмотрена.

За прототип взят способ получения очищенного туберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида на жидкой синтетической среде, стерилизацию при 1 атм в течение 30 мин, отделение фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы, концентрацию вакуумным выпариванием, осаждение и очистку аллергеноактивных веществ дегидратантом-трихлоруксусной кислотой, сернокислым аммонием, диализ и лиофйилизацию. При этом выход конечного продукта с 1 литра синтетической среды составляет 500 - 600 диагностических доз/ А.С. N 431877 "Способ получения очищенного туберкулина", авт. Н.С.Шевырев, А.61 К 23/00, 72 г/.

Недостатком указанного способа получения туберкулина является необходимость выпаривания культуральной жидкости, использование ядовитой трихлоруксусной кислоты и сернокислого аммония, проведение диализа и лиофилизация препарата. При этом выход конечного продукта составляет в среднем 20%. Кроме того, физико-химическое воздействие на культуральную жидкость указанных средств и методов нарушает структуру белка, изменяет конфигурацию аллергенных детерминант, это снижает специфичность аллергена и, как следствие, может служить причиной появления неспецифических реакций на туберкулин у животных, сенсибилизированных атипичными микобактериями. В то же время следует отметить, что попытка очистить белок от полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот с помощью трихлоруксусной кислоты и сернокислого аммония не достигает цели, т.к. очищенный туберкулин РРД-млекопитающих содержит 4 - 7% полисахаридов, 1 - 7% нуклеиновых кислот, 2,4 - 12% липидов/ В.М.Безгин. "Совершенствование промышленной технологии /ППД/ туберкулина и его биохимическая характеристика". Автореф. дис. канд.биол.наук. Москва, 1990. С. 12 - 13, 23, 25/. Чрезмерная очистка туберкулина от полисахаридов, нуклеиновых кислот и особенно липидов приводит к снижению активности препарата. Использование всех известных методов "очистки" туберкулина не повышает их специфичность и диагностическую эффективность.

Для устранения вышеперечисленных недостатков разработан экономически выгодный, технологически простой, экологически безопасный способ получения туберкулина.

Способ включает выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида/бовис/ на синтетической среде, стерилизацию, отделение фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы. Стерилизацию биомассы проводят при 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч обеспечивающую выход 0,8 - 0,9 мг/мл белка при аллергенной активности до 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл, затем добавляют деминерализованную воду в количестве 20 - 25% к исходному объему, проводят гидролиз в режиме 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч до аллергенной активности 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости, а после отделения фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы к полученному фильтрату добавляют деминерализованную воду до активности препарата 50 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл. Выход с 1 литра синтетической среды нативного синтетического туберкулина составляет до 10 тысяч диагностических доз.

Следует отметить, что попытки увеличить выход аллергеноактивных веществ за счет увеличения продолжительности времени стерилизации до 2 ч 30 мин - 3 ч, равно как и усиление температурного режима гидролиза биомассы до 1,5 атм, приводило к частичной термоденатурации белков, которые выпадают в осадок.

Таким образом, при обеспечении вышеуказанного режима и последовательности проведения операций в наибольшей степени сохраняются первоначальные свойства аллергена, а содержание солевых остатков среды в конечном продукте снижается с 12 - 13 г/л до 8 - 9 г/л, что позволяет обойтись без диализа культурального фильтрата.

Полученный таким способом нативный синтетический туберкулин сохраняет первоначальные физико-химические и аллергеные свойства в течение 3-х лет при хранении в режиме 5 + 20^oC /срок наблюдения/.

Пример осуществления способа. Для получения нативного синтетического туберкулина использовали биобутыли с объемом культуральной жидкости 1,2 л после двухмесячного выращивания микобактерий туберкулеза бовис, штамм N 8 на жидкой синтетической среде Курской биофабрики. Выращенную культуру микобактерий туберкулеза подвергли стерилизации при 1 атмосфере в течение 2 ч до выделения 0,9 мг/мл белка и аллергенной активности до 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости, после чего в культуральную жидкость добавили 25% дименирализованный воды и провели гидролиз биомассы при 1 атм в течение 2 ч до аллергенной активности 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости. Затем культуральную жидкость отделили фильтрацией от автоклавированной биомассы микобактерий туберкулеза в стерильную стеклянную бутыль. В полученный культуральный фильтрат добавили необходимое количество деминерализованной воды, с тем чтобы аллергенная активность конечного продукта-туберкулина находилась в пределах требуемой и составляла не менее 50 тыс. туберкулиновых единиц в 1 мл.

При биохимическом исследовании полученного туберкулина установлено, что содержание белка в нем составляет в среднем 0,7 мг/мл, полисахаридов - 0,06 ± 0,01 мг/мл, нуклеиновых кислот - 0,025 ± 0,01 мг/мл, липидов - 0,06 ± 0,01 мг/мл, т.е. он не имел достоверных различий по их количественному содержанию с так называемым очищенным туберкулином. Содержание солевых остатков синтетической среды в полученном туберкулине составляло в среднем 0,9 мг/мл, что было на уровне концентрации хлористого натрия в физиологическом растворе.

Специфические свойства нативного синтетического туберкулина нами были испытаны в экспериментальных опытах на искусственно аллергизированных разными видами микобактерий морских свинках и молодняке крупного рогатого скота и приведены в таблицах N 1 и N 2 (см. в конце описания). В опытах, для сравнения результатов исследований, использовали серийный очищенный туберкулин РРД-млекопитающих Курской биофабрики.

Таким образом, преимущество нативного синтетического туберкулина перед очищенным туберкулином РРД проявилось в том, что в отличие от прототипа, при внутрикожном методе туберкулинизации на моделях гетерологичной аллергизации/ авиум, scrofulaceum, nonchromogenicum/ выявлялось достоверно меньшее количество реагирующих животных, что свидетельствует о повышенной специфичности данного диагностикума.

Изобретение относится к получению аллергенов для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Микобактерии туберкулеза бычьего вида выращивают на синтетической среде. Проводят стерилизацию биомассы при 1 атм в течение 1,5-2 ч до выделения 0,8-0,9 мг/мл туберкулопротеина и аллергенной активности до 70 тысяч Т.Е. в 1 мл. После чего добавляют деминерализованную воду и проводят водно-температурный гидролиз биомассы. Затем отделяют фильтрацией культуральную жидкость. К полученному фильтрату снова добавляют деминерализованную воду до активности препарата 50 тысяч Т.Е. в 1 мл. Выход с 1 л синтетической среды нативного туберкулина составляет до 10 тыс. диагностических доз. Изобретение позволяет максимально сохранить первоначальные свойства аллергена и снизить содержание солевых остатков в продукте, что позволяет обойтись без диализа культурального фильтрата. 2 табл.

Способ получения туберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида на синтетической среде, стерилизацию, отделение фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы, отличающийся тем, что стерилизацию проводят при 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч до выделения 0,8 - 0,9 мг/мл белка и аллергенной активности до 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл, затем добавляют деминерализованную воду в количестве 20 - 25% к исходному объему и проводят гидролиз при 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч до аллергенной активности 70 тыс. туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости, а после отделения фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы к полученному культуральной фильтрату добавляют деминерализованную воду до активности препарата 50 тыс. туберкулиновых единиц в 1 мл.