ШТАММ Candida albicans var. stellatoidea ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АЛЛЕРГЕНА Российский патент 2016 года по МПК C12N1/14 A61K39/35 C12R1/725 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к микологии, фармакологии и медицине, и может быть использовано при получении Candida albicans var. stellatoidea №295 для производства диагностических препаратов.

Повсеместное распространение плесневых и дрожжевых грибов в среде обитания делает неизбежным контакт человека со спорами грибов и продуктами их жизнедеятельности. Микромицеты являются одними из наиболее распространенных в окружающей среде источников аллергенов. По литературным данным от 3 до 10% взрослых и детей во всем мире имеют аллергию к грибам. С патологическим воздействием грибов рода Candida связаны преимущественно поражения кожи и внутренних органов.

Известно использование Candida albicans для получения антигенов при диагностических исследованиях (а.с. СССР 1827632 по кл. G01N 33/53, опубл. 15.07.93). Однако данный штамм синтезирует антигены, влияющие на СОЭ (скорость оседания эритроцитов). В другом патенте штамм Candida albicans НКМ 9656, который депонирован в Немецкой Коллекции Микроорганизмов, используется для получения полисахарида. Однако этот штамм, обладающий антиаллергенной активностью, предназначен для лечения млекопитающих (см. Заявка РФ 98104502 по кл. C12P 21/00, опубл. 20.02.2000 г.).

Для полноценной диагностики микогенной аллергии необходимы различные наборы аллергенов, состоящие из большого количества наименований микромицетов. В настоящее время отечественными и зарубежными фирмами («Вектор Бест» РФ; «Dr Fooke» и «R-Biopharm», Германия, «Sevapharma», Чехия и др.) разработан ряд диагностических панелей, включающих, помимо других грибковых аллергенов, аллергены грибов Candida albicans и Candida krusei. Однако эффективность предлагаемых диагностических аллергенов Candida spp. не всегда высока вследствие различий в антигенном составе возбудителей, циркулирующих в данном регионе.

Наиболее близким к заявленному является штамм Candida albicans 253, обладающий высоким спорообразованием, иммуногенностью, отсутствием токсичности и патогенности (патент РФ, RU 2209243, C12N 1/02, A61K 39/00). Однако главный признак данного штамма - высокое спорообразование и иммуногенность, и он предназначен для получения высокоиммуногенного антигена.

Штамм Candida albicans var. stellatoidea 295 выделен из мокроты 15-летнего подростка, больного кандидозом, депонирован и хранится в коллекции ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под номером 295.

Техническим результатом изобретения является расширение номенклатуры диагностических аллергенов. Штамм Candida albicans var. stellatoidea №295 используется для получения антигенов, применяемых для диагностических препаратов при кандидозе. Штамм обладает способностью продуцировать высокоаллергенный антиген (аллерген), является нетоксичным, условно патогенным, не образует гемолизина.

Изобретение заключается в том, что биомассу микромицета выделяют из культуры С.albicans var. stellatoidea, полученной из мокроты 15-летнего подростка, больного кандидозом.

Порядок действия включает следующую схему выращивания: получение посевной культуры в пробирках, матрацах и выращивание биомассы в бутылях (с жидкой и плотной, агаризованной средой-фазой) при 20-37°С (оптимально при 30°С) в течение 7-14 суток (оптимально 10 суток), смыв биомассы той же, но жидкой солевой безуглеводной средой, извлечение биомассы с помощью стерильных пипеток Мора (объемом на 200-250 мл), слив излишнего декантата над биомассой, традиционная лиофильная сушка биомассы до порошка.

Культуру выращивают в течение 7-14 суток при 20-37°С на сконструированной 2-фазной (в соотношении жидкая и твердая фаза 1:10-1:50) солевой питательной среде, не содержащей чужеродного белка, включающей неочищенный агар-агар, а также 0,25-4% глюкозы, добавляемой ex tempore методом орошения поверхности среды и обеспечивающей наличие у микроорганизма совокупных свойств, которые присущи клеткам после выращивания на плотных и жидких средах.

Посевная культура, как указано в описании, готовится или на безбелковой среде с минимальным количеством углеводов (0,25-1%, оптимум 0,75%), или на среде Сабуро, куда входит 4% глюкозы, или на безуглеводном триптиказо-солевом агаре.

Новшеством в процессе культивирования являются:

- Очень низкий уровень глюкозы в среде или ее отсутствие, т.к. наличие углеводов может увеличивать в биомассе уровень аллергенов с неспецифической активностью;

- Оригинальная авторская солевая среда не содержит белка, т.к. любой белок также является аллергеном и, соответственно, повышает неспецифическую аллергенную активность;

- Среда 2-фазная вследствие присутствия жидкой фазы, образующейся из жидкой посевной культуры, внесенной на поверхность скошенной в бутыли той же авторской агаризованной безбелковой среды. Перед внесением посевной культуры поверхность среды орошается сверху (это новшество) 0,25-1% глюкозы, увеличивая объем жидкой фазы и создавая соотношение объема жидкой среды (фазы) к объему плотной фазы 1:10-1:50 (оптимум около 1:30). Далее культивирование 7-14 суток (оптимум 10 суток) при 20-37°С (оптимум 30°С). Выращивание Candida происходит как в жидкой фазе (т.е. та же среда), так и на поверхности агара. Этот элемент новизны позволяет получать более широкий набор белков (аллергенов), что важно при создании диагностических средств, выявляющих в сыворотках людей антитила к аллергенам Candida (т.е. лиц, имеющих повышенную чувствительность к Candida как аллергену).

Штамм Candida albicans var. stellatoidea 295 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Морфология культуры Candida albicans var. stellatoidea 295 под микроскопом после 72 ч культивирования: на среде Сабуро - истинные гифы и псевдогифы с бластоконидиями. На гифах формируются терминальные толстостенные овальные хламидиоспоры (хламидоконидии). При добавлении к средам сыворотки или плазмы через 4-5 ч образуются ростовые трубки, из которых затем формируются гифы.

Культуральные признаки.

Морфология колоний Candida albicans var. stellatoidea 295 после 48-72 часов культивирования при 35С: на агаре Сабуро - беловато-кремовые, выпуклые, гладкие, сметанообразной консистенции, диаметром 3-5 мм; на среде Никерсона - колонии шоколадно-коричневого цвета; на хромогенном агаре - колонии голубовато-зеленой окраски около 3 мм в диаметре. На Сабуро агаре с добавлением хлорамфеникола и 2,3,5-трифенилтетразоляхлорида колонии окрашиваются в беловато-кремовый цвет, размером около 2 мм в диаметре. На агаре с добавлением 5% крови штамм не производит гемолиза. При культивировании штамма на жидкой среде Сабуро через 48 часов при 35С появляется помутнение с образованием компактного осадка.

Ферментативные признаки.

Штамм ферментирует: глюкозу и мальтозу, галактозу - вариабельно, не ферментирует сахарозу, лактозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу, трегалезу, раффинозу, целлобиозу, инозит, сорбит, салицин. Не утилизирует мочевину. Прототроф.

Чувствительность к лекарственным препаратам:

- Флуконазол (10 мкг) - 12±1 мм;

- Интраконазол (10 мкг) - 17±1 мм;

- Амфотерицин В (20 мкг) - 10±1 мм;

- Кетоназол (10 мкг) - 18±1 мм;

- Миконазол (30 мкг) - 20±1 мм.

Вирулентные свойства.

При введении белым мышам 48-часовой культуры штамм Candida albicans var. stellatoidea 295 внутрибрюшинно в дозе 1×10⁹ клеток/мл в объеме 0,5 мл гибели животных не отмечено в течение 8 суток. При подкожном введении белым крысам и морским свинкам этой культуры в дозе 2×10⁹ клеток/мл отмечена гиперемия и отек тканей в месте введения, исчезавшие к 4-5 суткам. Изменений общего состояния всех видов животных не было.

Штамм Candida albicans var. stellatoidea 295 принадлежит к III группе патогенности с признаками условно патогенного микроорганизма.

Аллергенные свойства.

Штамм Candida albicans var. stellatoidea 295 продуцирует антиген, который может быть использован в качестве аллергена для выявления специфических антител.

Сущность изобретения поясняется следующим примером.

Пример. Диагностический аллерген из Candida albicans var. stellatoidea 295 разработан в ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Подготовка посевной культуры: штамм выращивается в пробирках или матрацах на:

1) агаризованной солевой безбелковой среде с добавлением 0,25-4% глюкозы (перед стерилизацией) в среду ML, разработанную по оригинальной авторской рецептуре (г/л):

K₂HPO₄ 6,0-10,5 KH₂PO₄ 3,0-4,5 (NH₄)₂SO₄ 0,5-1,0 MgSO₄ 0,01-0,05 Na цитрат 0,5-0,97; агар-агар 25-30 (в т.ч. 30-100% неочищенного агар-агара) глюкоза 2,5-40 рН среды 7,1±0,2

Стерилизация при 121°С - 15 мин.

2) или на среде Сабуро;

3) или на коммерческом триптиказо-солевом агаре без дополнительных углеводов.

Через 18-20 ч выращивания при 37°С производится смыв С. albicans 295 жидкой (неагаризованной) средой ML, без содержания глюкозы, из расчета 0,5-1 мл среды для смыва на 1 мл среды для культивирования.

Посев штамма С.albicans var. stellatoidea 295 для получения биомассы осуществляется на 2-фазную среду (плотная и жидкая среда ML) в количестве 2,5-5 литров агаризованной среды, предварительно скошенную в 5-10-литровых бутылях с содержанием воздушного объема не менее $$\raisebox{1ex}{$1$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$2$}\right.$$ бутыли. Методом орошения плотной поверхности среды вносится стерильный раствор глюкозы из расчета конечной концентрации на 1 л среды 0,25-4%. Затем вносится подготовленная посевная культура из расчета 250-500 млн клеток на 1 л среды выращивания.

На дне каждой бутыли совместно с посевной культурой, конденсатом питательной среды и не впитавшимся раствором глюкозы должна образоваться жидкая фаза в отношении к твердой фазе 1:10-1:50. После инокулирования среды проводится инкубация посева в бутыли при 20-37°С в течение 7-14 суток. На поверхности агара (твердая фаза) образуется «газонный» рост культуры серовато-белого цвета. В жидкой фазе на дне бутыли образуется мутная суспензия с концентрацией не менее 1×10⁹ клеток/мл. Жидкая фаза набирается в стерильную пипетку Мора {объемом на 200-250 мл) и ею производится смыв культуры С.albicans var. stellatoidea 295 с поверхности твердой фазы. Концентрация клеток С.albicans var. stellatoidea 295 в 1 мл смыва составляет не менее 10-20×10⁹ клеток/мл.

Затем препарат, представляющий собой смыв с полученными клетками лиофильно высушивается.

Для получения диагностического аллергена в качестве исходного сырья используют полученную ранее лиофильно высушенную биомассу гриба, которую заливают раствором Эванса-Кока или боратным буфером в соотношении 1:20. Это соотношение экстрагирующей жидкости и сухой биомассы гриба оптимально и позволяет наиболее полно экстрагировать из сырья белково-полисахаридные комплексы. В состав жидкости Эванса-Кока входят хлорид натрия, гидрофосфат калия и натрия и фенол 4%, значение рН - 7,2. В последующие три дня для более полного извлечения белково-полисахаридных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа. В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться в холодильной камере при температуре от +4°С до +8°С. Ежедневно проводят коррекцию рН аллергенного экстракта до величины 7,0-7,2. Затем экстракт центрифугируют на рефрижераторной центрифуге при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр и стерилизующей фильтрацией. Стерилизующая фильтрация проводится через фильтры типа «Миллипор», благодаря которым не происходит снижение содержания белкового азота в стерилизуемом препарате. Для монтажа стерилизующей фильтрации используют стеклянные бутыли, канюли, шарики и тройники, резиновые трубки и пробки, фильтр Ф-130 или установку фирмы «Миллипор».

В день проведения данной операции необходимо отконтролировать значение рН аллергенного экстракта. Контроль маточного раствора аллергена проводят по схеме: в тот же или на следующий день с соблюдением всех правил асептики отбирают из бутыли пробы для контроля стерильности, значения рН, который должен иметь величину 7,0-7,2. Визуально оценивают физические свойства: препарат должен быть прозрачным, без посторонних включений, светло-желтого цвета. Содержание белкового азота определяют по методу Несслера или Брэдфорд. Определение содержания нуклеиновых кислот проводят по методу Спирина, концентрацию углеводов - методом Дюбуа.

Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических и биологических свойств выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от +2°С до +10°С. В тех случаях, когда содержание единиц белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 10000 PNU/мл, маточный раствор аллергена разводят стерильной экстрагирующей жидкостью.

После разлива аллергена получают готовую форму препарата.

Полученный препарат изучали с учетом поставленных целей и задач.

Изучение физико-химических свойств полученных препаратов выявило, что полученные аллергенные экстракты варьировали по содержанию белкового азота от 1500 до 14000 PNU, нуклеиновых кислот - от 2,4 до 2,8 мг/мл, углеводов от 0,051 до 0,068 мг/мл, что вероятно связано с различным составом сред и условий культивирования.

Оценку специфической активности экстракта проводили в непрямом тесте дегрануляции тучных клеток (РНДТК) перитонеальной жидкости крыс с сыворотками больных, сенсибилизированных к грибу С.albicans var. stellatoidea 295. Сыворотки были отобраны методом ELISA (Dr. Fooke Laboratorien GmWH, Германия).

Средний показатель РНДТК с сыворотками сенсибилизированных крыс и препаратом аллергена С.albicans var. stellatoidea 295 различных серий представлены в таблице 1.

Эти данные свидетельствуют о том, что сенсибилизация аллергеном Candida albicans var. stellatoidea 295 сопровождается появлением в сыворотке животных реагиновых антител, которые участвуют в реакциях немедленного типа.

Структурный состав полученного препарата аллергена Candida albicans var. stellatoidea 295 изучался методом электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli. Результаты электрофореза показали, что исследуемые препараты представляют гетерогенную смесь различных белков и содержат белковые фракции с молекулярным весом от 32 до 97 кДа.

Для изучения специфической активности полученных препаратов аллергенов использовали коллекцию сывороток пациентов с сенсибилизацией к грибковым аллергенам, обратившихся в Консультативно-поликлиническое отделение ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова». Сыворотки были проверены методом RIDA AllergyScreen, «R-Biopharm», Германия. Результаты исследования показали, что аллергенспецифические IgE-антитела к аллергенам из гриба Candida albicans var. stellatoidea 295 выявлялись у 30% обследованных больных, что свидетельствует о высокой специфической активности разработанного препарата аллергена Candida albicans var. stellatoidea 295.

Таким образом, предлагаемый штамм Candida albicans var. stellatoidea 295 обладает в выбранных условиях 2-фазного культивирования высокой биомассообразующей способностью, а продуцируемые штаммом аллергены обладают достаточно выраженными иммуногенными свойствами.

К заявке «Candida albicans var. stellatoidea 295 для получения диагностического аллергена»

Изобретение относится к микробиологии, фармакологии и медицине и может быть использовано для получения диагностического аллергена. Штамм Candida albicans var. stellatoidea, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов 111-1V групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под номером 295, продуцирует аллергены, обладающие достаточно выраженными иммуногенными свойствами. 1 табл., 1 пр.

Штамм Candida albicans var. stellatoidea №295, коллекция ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, используемый для получения диагностического аллергена.