ШТАММ PANDORA SP КР-2 ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, и которая может быть использована, например, для очистки загрязненных поверхностей.

Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ В-3077 (25) и Micrococcus flavus ВКПМ В-3079 (53) / ав. св. СССР №1493666, C02F 3/34, 1989 г.), используемая для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материальных и энергозатратах.

Известен штамм бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ас-1339Д, используемый для разложения нефти и нефтепродуктов, который применяется для очистки воды и почвы от указанных продуктов. Недостатком известного штамма является недостаточная скорость утилизации нефти и неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта.

Наиболее близким аналогом является штамм бактерий Arthrobacter sp. МИП-89 для разложения сырой нефти и нефтепродуктов (пат. РФ 2142997). Данный штамм выделен при воздействии космических излучений на штамм Arthrobacter sp. ОС-1 ВКПМ Ас-1576. Недостатком известного штамма является недостаточная эффективность при разложении нефти тяжелых фракций.

Целью данного изобретения является получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной цели предложен штамм Pandora sp KP-2 ВКПМ В-8271, выделенный при воздействии космических излучений на штамм ТСН-ОК (справка о депонировании прилагается).

Выделение штамма осуществлялось путем рассевов исходных образцов штамма ТСН-ОК после экспозиции в условиях космического полета.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Bergey /Bergey Smanual of Systematic Bacteriology vol.1. 1984 р./, а также на основании синквенса последовательности генов 16S рРНК по Edwards U. Et all.

Хранится штамм на агаризованных питательных средах при температуре 6-8°С в течение месяца. Более длительное хранение штамма осуществляется в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии. Составы среды для хранения штамма:

Мясо-пептонный агар (г/л):

Мясная вода100,0Агар20,0NaCl5,0Пептон10,0Глюкоза7,0Вода водопроводнаяДо 1 литра

Данный штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками.

Культура представляет собой подвижные, грамвариабельные короткие палочковидные мелкие клетки, расположенные хаотично. Культура полиморфна. Клетки подвижные, спор не образуют. Размер клеток в пределах (0,5-0,7)-(0,7-1,5) мкм.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2 суток роста при 30°С культура образует колонии неправильной формы, сероватого цвета не очень крупные, плоские масляничной консистенции. Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде образований сероватого цвета.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при Т=30-35°С).

На мясо-пептонном бульоне при 30°С через 3-е суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, слабая пленка на поверхности среды. Оптимум роста 28-30°С, рН 6,8-7,2.

Размножение культуры осуществляли путем пересева на мясо-пептонном агаре, состав которого представлен выше.

Условия культивирования на ферментационной питательной среде: температура 28-30°C, рН 6,8-7,2, продолжительность культивирования 22 часа.

Состав ферментационной питательной среды (вес.%):

Кормовые дрожжи БВК2Кукурузный экстракт1Вода водопроводнаяДо 100

Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели: на производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет (2-3)×10⁹ клеток/мл, активность на песке с нефтью - на 7-е сутки биодеградации нефти отмечается в разведении 10^-1-10^-8.

Активность определяли на песке с нефтью гравиметрическим методом и методом газожидкостной хроматографии по количеству остаточной нефти.

Результаты проведенных исследований заявляемого штамма показывают, что средневирулентная доза штамма при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам составила более 10⁹ клеток на животное.

Штамм не обладает способностью к транслокации и диссеминации во внутренние органы и кровь животных после 30-дневного наблюдения.

Штамм не обладает токсичными и токсигенными свойствами. Наблюдение за животными в течение 30-ти суток не выявило каких-либо клинических признаков заболевания, а изучение внутренних органов не выявило патологических изменений, регистрируемых морфологически.

Изучаемые микроорганизмы не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку глаза, не проникают через естественные барьеры верхних дыхательных путей, не диссемилируют во внутренние органы при интраназальном поступлении в организм.

Культура Pandora sp штамм КР-2 является непатогенной и может быть использована в биотехнологии при производстве биодеграданта нефти и нефтепродуктов.

Примеры конкретного использования.

Применение на практике данного штамма обуславливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения воды и почвы нефтью и нефтепродуктами. Продукт, синтезируемый штаммом, - ферментный комплекс, обеспечивающий разложение сырой нефти и нефтепродуктов.

Пример 1.

Культуру выращивали в колбах объемом 250 мл с рабочим объемом заполнения питательной средой 30 мл на качалке при 350 об/мин, что обеспечивает коэффициент массопередачи по кислороду K₁a=90 час^-1. Продолжительность культивирования составляет 22-24 часа, конечная концентрация клеток в культуральной жидкости составляет в среднем 3×10⁹ л/мл.

Пример 2

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях, в пилотных и полевых экспериментах комплексно по следующим показателям: убыли суммы углеводородов, изменению фракционного состава нефти в процессе биодеструкции, изменению площади остаточной нефти по отношению к общей площади загрязненной поверхности.

Культуральная жидкость после выращивания штамма бактерий-деструкторов нефти сгущали сепарированием до концентрации клеток 1x10⁹-10¹⁰ кл/мл.

Для биообработки водных поверхностей культуральную жидкость заявляемого штамма разводили до конечной концентрации клеток 1×10⁶ кл/мл в пресной воде, добавляли 0,2% нитроаммофоски. Наносили готовый раствор из расчета 10 л/м² поверхности почвы. Через 10-15 дней проводили повторную биообработку загрязненной поверхности. При необходимости, в случае высокого уровня загрязнения, проводили третью биообработку через 10-15 дней после второй. На почвах при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление, если это было возможно. Обработку почвы и воды в пилотных испытаниях осуществляли из садовых леек, в полевых - с помощью поливальной или пожарной машины вместимостью 5-10 м³.

В лабораторных условиях обработку почвы, искусственно загрязненной нефтью, осуществляли в лабораторной посуде объемом 0,25-0,50 л. Лабораторные эксперименты проводили при комнатной температуре.

Пилотные испытания проводили на поверхности водоемов площадью 1-2 м² и более или на аварийно загрязненных почвах, где предварительно определяли уровень загрязнения.

Полевые испытания проводили на природных объектах после аварийных разливов нефти на них. И пилотные и полевые испытания проводили в летне-осенний период.

Пробы для анализов изначально и в динамике отбирали по пятиточечной схеме стандартным пробоотборником.

Массовый анализ исходного уровня загрязнения и дальнейший мониторинг процесса очистки почвенных объектов и воды от нефтяных загрязнений проводили гравиметрическим методом. Качественный состав загрязняющего агента проводили методами газожидкостной хроматографии. Количественный состав нефтяных фракций определяли с помощью площади пиков, качественный - по времени удержания. В качестве контроля использовали нативную нефть, не подвергавшуюся биодеградации.

Эффективность биодеградации загрязнения оценивали по убыли углеводородов нефти в процессе проведения биообработок, принимая за 100% исходную концентрацию загрязнения.

Учет численности живых клеток микроорганизмов во всех экспериментах проводили общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.

В табл.1, 2, 3 приведены результаты тестирования биодеградирующей способности штамма в лабораторных условиях, полевых и пилотных экспериментах.

В табл.1 приведены результаты сравнительного тестирования деградирующей способности штамма Pandora sp КР-2 ВКПМ В-8271 и препарата Деворойл на модели почвы в лабораторных условиях. В качестве модели был использован образец загрязненной почвы республики Башкортостан предприятия по обеспечению нефтепродуктами. Контролем служил загрязненный углеводородами образец почвы с того же участка без внесения каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов.

Таблица 1Название препаратаИсходная конц- ция углевод-ов Через 1 месяц УВЧерез 2 месяца УВСтепень очистки Г/кг%Г/кг%Г/кг%%Деворойл18,81009,651,18,947,352,7штамм,
Pandora sp КР-2 ВКПМ В-827118,81006,534,62,710,792,3Контроль18,810012,566,511,661,738,3

В табл.2 представлены результаты полевых тестов биодеградирующей способности штамма Pandora sp КР-2 ВКПМ В-8271 на природном объекте (река Черная), загрязненном углеводородами (УВ) в результате аварийных разливов нефти.

Таблица 2Объект, суткиСодержание нефтепродуктовСтепень очистки, г/л%%0191,4210001017,69,290,8245,93,0796,93500,090,04799,95

В табл.3 представлены результаты тестирования штамм Pandora sp КР-2 ВКПМ В-8271 в сравнении с отечественным препаратом в пилотных экспериментах, которые были поставлены на застарелом нефтяном загрязнении

Таблица 3№суткиСодержание нефтепродуктовСтепень очистки, Г/кг%%10178,21000Деворойл15131,274263088,347532 штамм Pandora sp КР-2 ВКПМ В-82710178,210001565,936,563,53038,221,478,6        

Преимущество заявленного штамма по сравнению с аналогом заключается в том, что заявленный штамм является более эффективным при разложении нефти тяжелых фракций (см. табл.4).

Таблица 4
Количественное содержание углеводородов в экспериментальных образцах почв, полученное методом гравиметрического анализаВид загрязнителяСодержание углеводов до обработки, г/кг почвыСодержание углеводов после 3-й обработки штаммом КР-2, г/кг почвыСодержание углеводов после 3-й обработки штаммом МИП-89, г/кг почвыНефть - 1%10,02,52,6Нефть - 1%13,59,710,1Нефть - 10%14724,224,4Нефть - 10%10440,435,0Дизельное топливо - 1%27,05,85,8Дизельное топливо - 1%13,53,03,1Дизельное топливо - 10%14013,013,3Дизельное топливо - 10%73,536,035,9Мазут - 1%10,02,58,1Мазут - 1%103,48,5Мазут - 10%11733,790,0Мазут - 10%1216,590,7

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Pandora sp КР-2 ВКПМ В-8271 может быть достигнута интенсивная деградация при высоком содержании ее в объекте загрязненного субстрата и он может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.

Штамм Pandora sp KP-2 ВКПМ В-8271 выделен при воздействии космических излучений на штамм ТСН-ОК. Штамм характеризуется высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов. Степень очистки загрязненных нефтью поверхностей составляет 78,6% за 30 суток. 4 табл.

Штамм Pandora sp ВКПМ В-8271 для разложения нефти и нефтепродуктов.