ШТАММ RHODOCOCCUS GLOBERULUS ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, и которая может быть использована, например, для очистки загрязненных поверхностей.

Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ В-3077 (25) и Micrococcus flavus ВКПМ В-3079 (53) (ав. св. СССР №1493666, C02F 3/34, 1989), используемая для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материально и энергозатратах.

Известен штамм бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ас-1339Д, используемый для разложения нефти и нефтепродуктов, который применяется для очистки воды и почвы от указанных продуктов. Недостатком известного штамма является недостаточная скорость утилизации нефти и неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта.

Наиболее близким аналогом является консорциум микроорганизмов "Деворойл", активно окисляющий нефтепродукты как в зоне контакта с водой, так и непосредственно в нефтяной пленке. В состав консорциума входят бактериальные и дрожжевые клетки. Композиция выделена из пластовых вод нефтяного месторождения (пат. РФ 2023686).

Целью данного изобретения является получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной цели предложен штамм Rhodococcus globerulus ВКПМ Ac-1640, выделенный из образца, загрязненного нефтью вод, полученного с западно-сибирского месторождения.

Выделение штамма осуществлялось путем рассева исходного образца, загрязненного нефтью воды, на мясопептонный агар с 0,5% нефти и предварительным пассированием исходного образца через жидкую среду Раймонда с 0,5% нефти.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Bergey /Bergey Smanual of Syste matic Bacteriology vol.1. 1984 р. /, а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК по Edwards U. Et all.

Хранится штамм на агаризованных питательных средах при температуре 6-8°С в течение месяца. Более длительное хранение штамма осуществляется в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Составы среды для хранения штамма:

Мясопептонный агар, г/л:

Мясная вода100,0Агар20,0NaCl5,0Пептон10,0Глюкоза7,0Вода водопроводнаяДо 1 литра

Агаризованная среда Раймонда с нефтью, г/л:

Na₂СО₃0,1CaCl₂0,01MnSO₄0,02FeSO₄0,01MgSO₄0,2NH₄Cl0,2NaCl3,0Na₂HPO₄1,5KH₂PO₄1,0Агар20,0Мясопептонный бульон500Нефть, об.%0,5Вода дистиллированнаяДо 1 литра

Данный штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками.

Культура представляет собой подвижные, грамвариабельные короткие палочковидные мелкие клетки и клетки округлой формы, расположенные преимущественно парами, а также поодиночке, реже соединенные в цепочки по 3 и более клеток. Культура полиморфна. Встречаются ветвящиеся цепочки и парочки, расположенные под углом друг к другу, а также отдельные кокковидные клетки. Клетки подвижные, спор не образуют. Размер клеток в пределах (0,7-0,8)×(0,8-2,5) мкм.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2 суток роста при 30°С культура образует колонии круглые с матовым слегка приподнятым центром и полупрозрачным ровным опалесцирующим на свету краем, с розовым пигментом. На МПА, содержащем вместо глюкозы 0,5% нефти, образует сильно выпуклые, круглые блестящие колонии с пигментом от бледно-розового до кремового цвета.

Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде выпуклых слизистых образований беловато-кремового цвета с маслянистым блеском.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при Т=30-35°С).

На мясопептонном бульоне при 30°С через 3-е суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, пленка на поверхности среды. Оптимум роста 28-30°С, рН 6,8-7,2.

На минеральной среде Раймонда с нефтью в качестве единственного источника углерода наблюдается слегка опалесцирующая муть в толще среды. Визуально нефть значительно деградирована - при встряхивании образуется взвесь в виде мелкодисперсной фазы коричневого цвета, что совершенно не характерно для нативной нефти.

Размножение культуры осуществляли путем пересева на мясопептонном агаре или агаризованной среде Раймонда, состав которых представлен выше.

Условия культивирования на ферментационной питательной среде: температура 28-30°С рН 6,8-7,2, продолжительность культивирования 22 часа.

Состав ферментационной питательной среды, вес.%:

Кормовые дрожжи БВК2Кукурузный экстракт1Вода водопроводнаяДо 100

У штамма обнаружен высокий уровень сходства последовательностей 16S рРНК (99,3-99,6) с видом Rhodococcus globerulus.

Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели: на производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет (2,5±0,5)×10⁹ клеток/мл, активность на среде Раймонда - на 5 сутки биодеградации нефти (при содержании нефти 10%) отмечается в разведении 10^-1-10^-8, степень нефтепотребления составляет 75%. Степень нефтепотребления при содержании в почве 10% нефти на 10 сутки составляет 56%.

Активность определяли на среде Раймонда с нефтью визуально по степени деградации нефти, а также гравиметрическим методом и методом газожидкостной хроматографии

Результаты проведенных исследований заявляемого штамма показывают, что средневирулентная доза штамма при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам составила более 10⁹ клеток на животное.

Штамм не обладает способностью к транслокации и диссеминации во внутренние органы и кровь животных после 30-дневного наблюдения.

Штамм не обладает токсичными и токсигенными свойствами. Наблюдение за животными в течение 30-ти суток не выявило каких-либо клинических признаков заболевания, а изучение внутренних органов не выявило патологических изменений, регистрируемых морфологически.

Изучаемые микроорганизмы не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку глаза, не проникают через естественные барьеры верхних дыхательных путей, не диссемилируют во внутренние органы при интраназальном поступлении в организм.

Примеры конкретного использования.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения воды и почвы нефтью и нефтепродуктами. Продукт, синтезируемый штаммом, - ферментный комплекс, обеспечивающий разложение сырой нефти и нефтепродуктов.

Пример 1.

Культуру выращивали в колбах объемом 250 мл с рабочим объемом заполнения питательной средой 30 мл на качалке при 350 об/мин, что обеспечивает коэффициент массопередачи по кислороду K₁a=90 час^-1. Продолжительность культивирования составляет 22-24 часа, конечная концентрация клеток в культуральной жидкости составляет в среднем 3×10⁹ л/мл.

Пример 2

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях, в пилотных и полевых экспериментах комплексно по следующим показателям: убыли суммы углеводородов, изменению фракционного состава нефти в процессе биодеструкции, изменению площади остаточной нефти по отношению к общей площади загрязненной поверхности.

Культуральная жидкость после выращивания штамма бактерий-деструкторов нефти сгущали сепарированием до концентрации клеток 1×10⁹-10¹⁰ кл/мл.

Для биообработки водных поверхностей культуральную жидкость заявляемого штамма разводили до конечной концентрации клеток 1×10⁶ кл/мл в пресной воде, добавляли 0,2% нитроаммофоски. Наносили готовый раствор из расчета 10 л/м² поверхности почвы. Через 10-15 дней проводили повторную биообработку загрязненной поверхности. При необходимости в случае высокого уровня загрязнения проводили третью биообработку через 10-15 дней после второй. На почвах при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление, если это было возможно. Обработку почвы и воды в пилотных испытаниях осуществляли из садовых леек, в полевых - с помощью поливальной или пожарной машины вместимостью 5-10 м³.

В лабораторных условиях обработку почвы, искусственно загрязненной нефтью, осуществляли в лабораторной посуде объемом 0,25-0,50 л. Лабораторные эксперименты проводили при комнатной температуре.

Пилотные испытания проводили на поверхности водоемов площадью 1-2 м² и более, или на аварийно загрязненных почвах, где предварительно определяли уровень загрязнения.

Полевые испытания проводили на природных объектах после аварийных разливов нефти на них. И пилотные, и полевые испытания проводили в летне-осенний период.

Пробы для анализов изначально и в динамике отбирали по пятиточечной схеме стандартным пробоотборником.

Массовый анализ исходного уровня загрязнения и дальнейший мониториг процесса очистки почвенных объектов и воды от нефтяных загрязнений проводили гравиметрическим методом. Качественный состав загрязняющего агента проводили методами газожидкостной хроматографии. Количественный состав нефтяных фракций определяли с помощью площади пиков, качественный - по времени удержания. В качестве контроля использовали нативную нефть, не подвергавшуюся биодеградации.

Эффективность биодеградации загрязнения оценивали по убыли углеводородов нефти в процессе проведения биообработок, принимая за 100% исходную концентрацию загрязнения.

Учет численности живых клеток микроорганизмов во всех экспериментах проводили общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.

В таблицах 1, 2, 3 приведены результаты тестирования биодеградирующей способности штамма в лабораторных условиях, полевых и пилотных экспериментах.

В табл.1 приведены результаты сравнительного тестирования деградирующей способности штамм Rhodococcus globerulus ВКПМ Ac-1640 и препарата Деворойл на модели почвы в лабораторных условиях. В качестве модели был использован образец загрязненной почвы республики Башкортостан предприятия по обеспечению нефтепродуктами. Контролем служил загрязненный углеводородами образец почвы с того же участка без внесения каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов.

В таблице 2 представлены результаты полевых тестов биодеградирующей способности штамма Rhodococcus globerulus ВКПМ Ac-1640 на природном объекте (река Черная), загрязненном углеводородами (УВ) в результате аварийных разливов нефти.

В таблице 3 представлены результаты тестирования штамма Rhodococcus globerulus ВКПМ Ac-1640 в сравнении с отечественным препаратом в пилотных экспериментах, которые были поставлены на застарелом нефтяном загрязнении

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Rhodococcus globerulus ВКПМ Ac-1640 может быть достигнута интенсивная деградация при высоком содержании ее в объекте загрязненного субстрата и он может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты. Штамм Rhodococcus globerulus TCH-OK, выделенный из образца загрязненных нефтью вод, полученного с западно-сибирского месторождения, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1640. Изобретение позволяет повысить скорость утилизации нефти и нефтепродуктов. 3 табл.

Штамм Rhodococcus globerulus ВКПМ АС-1640 для разложения нефти и нефтепродуктов.