ШТАММ PSEUDOMONAS GRAMINIS ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, и которая может быть использована, например, для очистки загрязненных поверхностей.

Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ В-3077(25) и Micrococcus flavus ВКПМ В-3079 (53) (а.св. СССР №1493666, C 02 F 3/34, 1989), используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материально- и энергозатратах.

Известен штамм бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ас-1339Д, используемый для разложения нефти и нефтепродуктов, который применяется для очистки воды и почвы от указанных продуктов. Недостатком известного штамма является недостаточная скорость утилизации нефти и неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта.

Наиболее близким аналогом является консорциум микроорганизмов “Деворойл”, активно окисляющий нефтепродукты как в зоне контакта с водой, так и непосредственно в нефтяной пленке. В состав консорциума входят бактериальные и дрожжевые клетки. Композиция выделена из пластовых вод нефтяного месторождения (пат. РФ 2023686).

Целью данного изобретения является получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной цели предложен штамм Pseudomonas graminis T-7 ВКПМ В-8615, выделенный из образца загрязненной нефтью воды, полученной с Западно-сибирского месторождения (справка о депонировании прилагается).

Выделение штамма осуществлялось путем рассева исходного образца загрязненной нефтью воды на мясопептонный агар с 0,5% нефти и предварительным пассированием исходного образца через жидкую среду Раймонда с 0,5% нефти.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Bergey /Bergey Smanual of Systematic Bacteriology vol.1. 1984 р./, а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК по Edwards U. Et all.

Хранится штамм на агаризованных питательных средах при температуре 6-8°С в течение месяца. Более длительное хранение штамма осуществляется в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Составы среды для хранения штамма:

Мясопептонный агар (г/л):

Мясная вода - 100,0

Агар - 20,0

NaCl - 5,0

Пептон - 10,0

Глюкоза - 7,0

Вода водопроводная - до 1 литра

Агаризованная среда Раймонда с нефтью (г/л):

Nа₂СО₃ - 0,1

CaCl₂ - 0,01

MnSO₄ - 0,02

FeSO₄ - 0,01

MgSO₄ - 0,2

NH₄Cl - 0,2

NaCI - 3,0

Na₂HPO₄ - 1,5

КН₂РO₄ - 1,0

Агар - 20,0

Мясопептонный бульон - 500

Нефть - 0,5% об.

Вода дистиллированная - до 1 литра

Данный штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками.

Культура представляет собой подвижные, одиночные, палочковидные прямые или слегка изогнутые клетки размером (0,5-1,0)×(1,5-4,0) мкм. Грамотрицательные. Образуют капсулу. Аэроб.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 18-20 часов роста при 30°С культура образует колонии, округлой формы, плоские, с неровными краями, плотной консистенции с шероховатой поверхностью. R-формы.

Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при Т=30-35°С).

На мясопептонном бульоне при 30°С в стационарных условиях, через 18-20 часов наблюдается рост в виде пленки на поверхности среды. Оптимум роста 29-31°С, рН 6,8-7,2.

На минеральной среде Раймонда с глюкозой образует беловатый осадок, слегка опалесцирующую муть в толще среды и тонкое пристеночное кольцо.

На минеральной среде Раймонда с нефтью в качестве единственного источника углерода наблюдается слегка опалесцирующая муть в толще среды. Визуально нефть значительно деградировала - при встряхивании образуется взвесь в виде мелкодисперсной фазы коричневого цвета, что совершенно не характерно для нативной нефти.

Размножение культуры осуществляли путем пересева на мясопептонном агаре или агаризованной среде Раймонда, состав которых представлен выше.

Условия культивирования на ферментационной питательной среде: температура 29-31 град, рН 6,8-7,2, продолжительность культивирования 22-24 часа.

Состав ферментационной питательной среды (% вес.):

Кормовые дрожжи БВК - 2

Кукурузный экстракт - 1

Вода водопроводная - до 100

У штамма обнаружен высокий уровень сходства последовательностей 16S рРНК (99,3-99,6) с видом Pseudomonas graminis.

Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели: на производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет (2,5±0,5)×10⁹ клеток/мл, активность на среде Раймонда - на 5 сутки биодеградации нефти (при содержании нефти 10%) отмечается в разведении 10^-1-10^-8, степень нефтепотребления составляет 80%. Степень нефтепотребления при содержании в почве 10% нефти на 15 сутки составляет 65%.

Активность определяли на среде Раймонда с нефтью визуально по степени деградации нефти, а также гравиметрическим методом и методом газожидкостной хроматографии.

Результаты проведенных исследований патогенности заявляемого штамма показывают, что средневирулентная доза штамма при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам составила более 10⁹ клеток на животное.

Штамм не обладает способностью к транслокации и диссеминации во внутренние органы и кровь животных.

Штамм не обладает токсичными и токсигенными свойствами.

Наблюдение за животными в течение 30-ти суток не выявило каких-либо клинических признаков заболевания, а изучение внутренних органов не выявило патологических изменений, регистрируемых морфологически.

Изучаемые микроорганизмы не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку глаза, не проникают через естественные барьеры верхних дыхательных путей, не диссемилируют во внутренние органы при интраназальном поступлении в организм.

Примеры конкретного использования

Применение на практике данного штамма обуславливается его физиолого-биохимическими особенностями. Заявляемый штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения воды и почвы нефтью и нефтепродуктами.

Пример 1

Культуру выращивали в колбах объемом 250 мл с рабочим объемом заполнения питательной средой 30 мл на качалке при 350 об/мин, что обеспечивает коэффициент массопередачи по кислороду K_1a=90 час^-1. Продолжительность культивирования составляет 22-24 часа, конечная концентрация клеток в культуральной жидкости составляет в среднем 3×10⁹ кл/мл.

Пример 2

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях, в пилотных и полевых экспериментах комплексно по следующим показателям: убыли суммы углеводородов, изменению фракционного состава нефти в процессе биодеструкции, изменению площади остаточной нефти по отношению к общей площади загрязненной поверхности.

Культуральная жидкость после выращивания штамма бактерий-деструкторов нефти сгущали сепарированием до концентрации клеток 1×10⁹-10¹⁰ кл/мл. Для биообработки водных поверхностей культуральную жидкость заявляемого штамма разводили до конечной концентрации клеток 1х10⁶ кл/мл в пресной воде, добавляли 0,2% нитроаммофоски. Наносили готовый раствор из расчета 10 л/м² поверхности почвы. Через 10-15 дней проводили повторную биообработку загрязненной поверхности. При необходимости, в случае высокого уровня загрязнения, проводили третью биообработку через 10-15 дней после второй. На почвах при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление, если это было возможно. Обработку почвы и воды в пилотных испытаниях осуществляли из садовых леек, в полевых - с помощью поливальной или пожарной машины вместимостью 5-10 м³.

В лабораторных условиях обработку почвы, искусственно загрязненной нефтью, осуществляли в лабораторной посуде объемом 0,25-0,50 л. Лабораторные эксперименты проводили при комнатной температуре.

Пилотные испытания проводили на поверхности водоемов площадью 1-2 м² и более или на аварийно загрязненных почвах, где предварительно определяли уровень загрязнения.

Полевые испытания проводили на природных объектах после аварийных разливов нефти на них. И пилотные, и полевые испытания проводили в летне-осенний период.

Пробы для анализов изначально и в динамике отбирали по пятиточечной схеме стандартным пробоотборником.

Массовый анализ исходного уровня загрязнения и дальнейший мониторинг процесса очистки почвенных объектов и воды от нефтяных загрязнений проводили гравиметрическим методом. Качественный состав загрязняющего агента проводили методами газожидкостной хроматографии. Количественный состав нефтяных фракций определяли с помощью площади пиков, качественный - по времени удержания. В качестве контроля использовали нативную нефть, не подвергавшуюся биодеградации.

Эффективность биодеградации загрязнения оценивали по убыли углеводородов нефти в процессе проведения биообработок, принимая за 100% исходную концентрацию загрязнения.

Учет численности живых клеток микроорганизмов во всех экспериментах проводили общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.

В таблицах 1-3 приведены результаты тестирования биодеградирующей способности штамма в лабораторных условиях, полевых и пилотных экспериментах.

В таблице 1 приведены результаты сравнительного тестирования деградирующей способности штамма Pseudomonas graminis T-7 и препарата Деворойл на модели почвы в лабораторных условиях. В качестве модели был использован образец загрязненной почвы Павелецкого предприятия по обеспечению нефтепродуктами. Контролем служил загрязненный углеводородами образец почвы с того же участка без внесения каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов.

В таблице 2 представлены результаты полевых тестов биодеградирующей способности штамма Pseudomonas graminis T-7 на природном объекте (река Черная), загрязненном углеводородами (УВ) в результате аварийных разливов нефти.

В таблице 3 представлены результаты тестирования штамма Pseudomonas graminis T-7 в сравнении с отечественным препаратом в пилотных экспериментах, которые были поставлены на застарелом нефтяном загрязнении.

Табл.3№суткиСодержание нефтепродуктовСтепень очистки,  г/кг%%10178,21000Деворойл15131,27426 3088,3475320178,21000Pseudomonas1555,930,573,5graminis T-73042,219,380,7

Таким образом полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Pseudomonas graminis T-7 может быть достигнута интенсивная деградация при высоком содержании ее в объекте загрязненного субстрата и он может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов. Штамм депонирован как Pseudomonas graminis ВКПМ В-8615. Штамм выделен из образца загрязненной нефтью воды, полученной с Западно-сибирского месторождения, растет на многих натуральных и синтетических средах. Штамм Pseudomonas graminis обладает высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов. 3 табл.

Штамм Pseudomonas graminis ВКПМ В-8615 для разложения нефти и нефтепродуктов.