Настоящее изобретение относится к способу культивирования бактерий Lawsonia intracellularis в клетках МсСоу, а также к применению клеток МсСоу для внутриклеточного культивирования бактерий Lawsonia intracellularis.
Бактерии Lawsonia intracellularis являются причинным агентом пролиферативной энтеропатии свиней (ПЭС) и действуют практически на все животные организмы, включая человека, кроликов, хорьков, хомяков, лис, лошадей и других животных, таких различных, как страусы и эму.
Бактерии Lawsonia intracellularis являются особенно значительной причиной потерь в свиных стадах. Оценки распространенности и заболеваемости ПЭС в США достигали 20 процентов свиного стада с номинальными потерями в 20 миллионов долларов ежегодно.
Характерным признаком ПЭС является обнаружение интрацитоплазматических не связанных с мембраной изогнутых палочковых бактерий в энтероцитах поврежденных областей кишечника. Бактерии, ассоциированные с ПЭС, были отнесены к "Campylobacter-подобным организмам". S.McOrist и др., Vet. Pathol., т.26, 260-64 (1989). Впоследствии причинные бактерии были идентифицированы как новый таксономический род и вид, общеупотребительно отнесенный к Ileal symbiont (IS) intracellularis. С.Gebhart и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.43, №3, 533-38 (1993). Позднее эти новые бактерии получили таксономическое название Lawsonia (L) intracellularis. S.McOrist и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.45, №4, 820-25 (1995). Эти три названия были использованы равнозначно для обозначения того же организма, что и идентифицированный и описанный в дальнейшем здесь. Заявитель стремился использовать таксономическое название, L. intracellularis, в ходе обсуждения настоящего изобретения.
L. intracellularis - это облигатная внутриклеточная бактерия, которая не может культивироваться нормальными бактериологическими методами на обычных бесклеточных средах и, как считалось, для роста ей необходимы прикрепленные эпителиальные клетки. S.McOrist и др., Infection and Immunity, т.61, №10, 4286-92 (1993) и G.Lawson и др., J. of Clinical Microbiology, т.31, №5, 1136-42 (1993) обсуждают культивирование L. intracellularis с использованием монослоев клеток кишечного эпителия крысы IEC-18 в обычных сосудах для культур тканей. Кроме того, Н.Stills, Infection and Immunity, т.59, №9, 3227-36 (1991) обсуждает использование монослоев клеток кишечника человеческого эмбриона Intestine 407 и монослоев клеток аденокарциномы ободочной кишки морской свинки в обычных сосудах для культур тканей. Эти прежние методы культивирования трудоемки и не пригодны для масштабирования.
Современному пониманию инфекции, вызываемой L. intracellularis, лечению и эффективному контролю заболевания серьезно препятствовали изощренные требования к in vitro культурам, L. intracellularis. В настоящее время необходим улучшенный способ культивирования L. intracellularis.
Следовательно, задачей данного изобретения является расширение технологических возможностей культивирования бактерий L. intracellularis.
Поставленная задача решается предлагаемым способом культивирования бактерий L. intracellularis в клетках McCoys, включающим стадии а) инфекции клеток McCoys бактериями L. intracellularis и б) культивирования упомянутых инфицированных клеток McCoys в условиях, позволяющих рост L. intracellularis в упомянутых инфицированных клетках McCoys.
Предлагаемый способ культивирования L. intracellularis можно проводить в больших масштабах, предпочтительно с целью получения вакцин и диагностических агентов.
Для достижения этих и других объектов и в соответствии с целью изобретения, как осуществлено и подробно здесь описано, настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования L. intracellularis и крупномасштабных поставок образующихся при этом бактерий.
Предпочтительно клетки McCoys культивируют в режиме адгезии, при этом более предпочтительно клетки McCoys инфицируют бактериями L. intracellularis при слиянии упомянутых клеток, равном примерно 30%.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения клетки McCoys культивируют в суспензии.
В основном инфицированные клетки инкубируют при температуре от примерно 36 до примерно 38°С. Предпочтительно инфицированные клетки культивируют при концентрации кислорода меньше примерно 18%, более предпочтительно при концентрации кислорода от примерно 0 процентов до примерно 8.0 процентов, в частности до тех пор, пока не произойдет слияние клеток. Затем инфицированные клетки и ростовую среду можно помещаться в ферментер, биореактор, вращающийся сосуд или в какой-либо другой сосуд, пригодный для поддержания клеток в суспензии. Инфицированные клетки инкубируют при перемешивании таким образом, чтобы культивировать бактерии L. intracellularis при поддержании инфицированных клеток в суспензии. Затем часть культивированных бактерий L. intracellularis пассируется в свежие культивируемые клетки для того, чтобы увеличить образование бактерий L. intracellularis.
Полученные предлагаемым способом культивирования бактерии L. intracellularis можно использовать для получения вакцины против L. intracellularis. Авирулентные бактерии L. intracellularis можно получить пассированием культивированных бактерий L. intracellularis достаточное число раз и отбором аттенуированного штамма или путем воздействия на культивированные бактерии химических способов аттенуации. Убитые вакцины L. intracellularis также можно получить с использованием методов культивирования данного изобретения. Бактерии можно непрерывно культивировать в течение, по крайней мере, около 6 и до 8 месяцев при пассировании, по крайней мере, около 7 и до 12 раз с целью получения аттенуированного штамма для использования его в качестве вакцины. Затем аттенуированные бактерии смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и в эффективном количестве вводят животному для того, чтобы получить иммунный ответ.
Дополнительные признаки и преимущества изобретения будут упомянуты далее в описании, которое следует, и станут очевидными при прочтении описания или могут быть поняты при практическом использовании изобретения.
Термин "L. intracellularis", как он используется здесь, означает внутриклеточные, изогнутые, грам-отрицательные бактерии, подробно описанные С.Gebhart и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.43, №3, 533-38 (1993) и S.McOrist и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.45, №4, 820-25 (1995) (каждый из которых включен здесь полностью в виде ссылки), и охватывает, но не только, бактерии, заложенные на хранение как АТСС 55672 в Американской Коллекции Типовых Культур (Роквилл, Мэриленд); бактерии, заложенные на хранение как NCTC 12656 и 12657 в Национальной Коллекции Типовых Культур (NCTC, Колиндейл, Лондон); причинные бактерии, которые повсеместно могут быть получены от свиней или других животных, инфицированных ПЭС, с учетом приведенных здесь специальных сведений и доктрин; варианты или мутанты любых из упомянутых выше бактерий независимо от того, получены они спонтанно или искусственно.
Термин "аттенуированный штамм", как он здесь используется, означает любой штамм L. intracellularis, который может быть получен в соответствии с приемами культивирования и пассирования, приведенными здесь, с целью достижения вирулентности при поддержании иммуногенных свойств при введении животному-хозяину. Различные несходные штаммы L. intracellularis могут быть культивированы и аттенуированы в соответствии с доктринами настоящего изобретения с целью получения аттенуированных иммуногенных штаммов, имеющих эффективность как вакцины для свиней, так и для других животных, чувствительных к инфекции, вызываемой L. intracellularis.
Предполагается, что соответствующие аттенуированные штаммы могут быть полезны в качестве иммуногенов в противомикробных вакцинах для животных, включая птиц, рыб, крупный рогатый скот, свиней, лошадей, вообще млекопитающих и приматов, и человека. Такие вакцины могут быть получены приемами, известными специалистам, с учетом доктрин, содержащихся здесь. Такая вакцина включала бы иммунологически эффективное количество аттенуированного штамма в фармацевтически приемлемом носителе. Вакцина могла бы быть введена в одной дозе или более. Иммунологически эффективное количество поддается определению способами, известными специалистам, без излишнего экспериментирования, с учетом содержащихся здесь доктрин. Количество авирулентных бактерий должно быть достаточным для того, чтобы стимулировать иммунный ответ у восприимчивых к заболеванию животных, оставаясь при этом авирулентным. Оно будет зависеть от конкретного животного, бактерий и вызванного ими заболевания. Рекомендованная доза для введения чувствительному животному составляет предпочтительно около 103 до 109 бактерий/кг веса тела и наиболее предпочтительно около 105 до 107 бактерий/кг веса тела. Носители известны специалистам и включают стабилизаторы и разбавители. Такая вакцина может содержать также соответствующий адъювант. Соответствующие вакцины могут использоваться в комбинации с другими вакцинами, например, в качестве разбавителя другой лиофилизированной вакцины или смешиваться с другой вакциной перед лиофилизацией. Препараты вакцин могут быть также высушены, например, лиофилизацией для целей хранения или последующего получения лекарственной формы жидких вакцин.
Кроме того, можно было бы осуществлять метод индукции иммунного ответа к вирулентным бактериям L. intracellularis дикого типа у животного-хозяина с целью защиты его от таких бактерий. Метод включает введение хозяину иммунологически эффективного количества аттенуированных бактерий или убитых бактерий этого изобретения и, предпочтительно, введение хозяину вакцины этого изобретения.
Термин "крупномасштабное культивирование", как он использован здесь, означает уровень культивирования L. intracellularis больше чем приблизительно от 2.0 до 3.0 литров и включает производство в масштабе 100 литров или более. Термин "культивирование", как он использован здесь, означает процесс промотирования роста, репродукции и/или пролиферации L. intracellularis.
При практическом применении способа культивирования по этому изобретению культивируемые клетки McCoys, например, (АТСС 1696) - мышиные (неспесифицированные клетки), могут сначала инокулироваться инокулятом, включающим бактерии L. intracellularis, таким образом, чтобы инфицировать клетки бактериями.
Перед инокуляцией предпочтительно, но не обязательно, культивируемые клетки должны быть в виде монослоя. Для образования монослоя клетки можно сеять в обычных сосудах. Каждый сосуд, как правило, засевается в интервале от примерно 1×105 до примерно 10×105 клеток на 25 см2 площади сосуда, смешанных с ростовой средой. Ростовой средой может служить любая среда для культивирования клеток, которая включает источник азота, необходимые ростовые факторы для выбранных культивируемых клеток и источник углерода, такой как глюкоза или лактоза. Предпочтительной средой является среда Игла в модификации Дюльбекко (МДСИ) с 2-5% эмбриональной бычьей сыворотки, хотя и различные другие коммерчески доступные среды могут использоваться с хорошими результатами.
Было обнаружено, что успешное культивирование L. intracellularis усиливается поддержанием культивируемых клеток в постоянном состоянии роста. Поэтому у монослоя культивируемых клеток во время инокуляции слияние должно быть примерно от 20 до 50%. Предпочтительно слияние клеток во время инокуляции должно быть примерно от 30 до 40%, причем 30% слияния являются наиболее предпочтительными.
Инокулят может быть чистой культурой L. intracellularis, полученной, например, из депозита АТСС 55672, депозитов NCTC 12656 либо 12657 или от инфицированных свиней или других животных с использованием доктрин выделения и очистки, обсужденных здесь.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения инокулят для практического применения изобретения представляет собой гомогенат кишечника, полученный соскабливанием слизистой оболочки подвздошной кишки свиньи или другого животного, инфицированного ПЭС. При получении гомогената кишечника отделы подвздошной кишки, выбранные для культивирования, должны иметь тяжелые повреждения с выраженным утолщением кишки. Вследствие недолговечности бактерий образцы должны сохраняться предпочтительно при -70°С как можно быстрее после аутопсии. К инокуляту предпочтительно добавляют антибиотик, к которому бактерии L. intracellularis устойчивы, такой как ванкомицин, амфотерицин В или члены группы аминогликозидных антибитиков, включающей, например, гентамицин и неомицин, для того чтобы подавить контаминирующие бактерии и дать возможность расти L. intracellularis. Независимо от того, является ли инокулят чистой культурой или гомогенатом кишечника, инокуляция культивируемых клеток может осуществляться различными приемами, известными специалистам, с учетом приведенных здесь доктрин.
Затем бактерии и/или инокулированные культивируемые клетки инкубируют при пониженной концентрации кислорода. При концентрации растворенного кислорода выше 18% рост L. intracellularis меньше оптимального и в конечном итоге рост прекращается, если концентрации кислорода выходят за пределы этого значения. Предпочтительно инокулированные культивируемые клетки инкубируют при концентрации растворенного кислорода меньше примерно 18%, в частности в интервале от примерно 0% до примерно 10%. Более предпочтительно клетки инкубируют при концентрации кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 8%, причем наиболее предпочтительной является концентрация кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 3.0%.
Для правильного роста L. intracellularis необходима также надлежащая концентрация двуокиси углерода. При концентрациях двуокиси углерода более 10% и менее 4% наблюдается неоптимальный рост и в конечном итоге - прекращение роста, если концентрации двуокиси углерода выходят за пределы этого интервала. Предпочтительно концентрация двуокиси углерода составляет примерно 10%, в частности данная концентрация находится в интервале от примерно 6% до примерно 9%, причем наиболее предпочтительная концентрация двуокиси углерода составляет 8.8%.
Кроме того, клетки предпочтительно инкубируются при концентрации водорода в интервале от примерно 73% до примерно 94%. Более предпочтительно концентрация водорода составляет 82%. Вместо некоторого количества или всего водорода может быть использован азот. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения клетки инкубируют примерно в около 8.0% кислорода, около 10% двуокиси углерода и примерно 82% водорода.
Далее, предлагаемый способ культивирования предпочтительно включает дополнительную стадию сбора бактерий L. intracellularis из инфицированных клеток McCoys.
Дальнейшим объектом данного изобретения является применение клеток McCoys для внутриклеточного культивирования бактерий Lawsonia intracellularis, при этом предпочтительно данные клетки McCoys инфицированы бактериями Lawsonia intracellularis, и инфицированные клетки культивируют при концентрации кислорода меньше примерно 18%.
Данное предложение включает и любые комбинации предпочтительных вариантов соответствующих объектов.
Инокулированные клетки можно инкубировать в двойном газовом инкубаторе или другой газовой камере, которая содержит надлежащие концентрации кислорода и двуокиси углерода и которая позволяет клеткам находиться в суспендированном состоянии во время инкубации. Камера должна включать средства для поддержания инокулированных клеток в суспензии и газовый монитор и источник подачи газа для подведения и поддержания газа в надлежащей концентрации. Температура инкубации должна поддерживаться в интервале от 30 до 45°С и более предпочтительно в интервале от 36°С до примерно 38°С. Самой предпочтительной является температура около 37°С. Необходимое оборудование для способов культивирования и аттенуации данного изобретения является общедоступным для обычных специалистов с учетом приведенных здесь доктрин. Одним из примеров оборудования, пригодного для осуществления на практике настоящего изобретения, является двойной газовый инкубатор, например, модель 480, поставляемая фирмой Лэб-Лайн (Мельроуз Парк, Иллинойс), в сочетании с вращающимися сосудами для поддержания клеток в суспензии. Предпочтительное современное оборудование включает ферментер, биореактор или роторное встряхивающее устройство, вмещающее, по меньшей мере, 2 литра среды и способное поддерживать культивируемые клетки в суспензии посредством барботирования газа в соответствующей концентрации, или другие средства механического перемешивания и постоянного мониторинга уровней кислорода, растворенного в среде. Подходящие для этой цели ферментеры и биореакторы производят Нью-Брунсвик, Браун и другие компании.
Согласно предпочтительному варианту предлагаемого способа поддержанием инокулированных клеток в суспендированном состоянии в ходе инкубации достигается максимальный рост клеток и, следовательно, L. intracellularis путем увеличения контакта каждой клетки в отдельности со средой и надлежащей смесью кислорода и двуокисью углерода. Культивируемые клетки могут перемешиваться и поддерживаться в суспензии разнообразными методами, известными специалистам, включая, например, сосуды для культивирования, вращающиеся бутыли, полупроницаемые мембраны для культивирования и вращающиеся сосуды. При инкубации клетки могут поддерживаться в суспендированном состоянии посредством инкубации их во вращающемся сосуде внутри двойного газового инкубатора или подобного аппарата. Термин "вращающийся сосуд", как он использован здесь, означает сосуд или какой-либо другой контейнер, снабженный лопастью, пропеллером или другими средствами для перемешивания культуры и поддерживающий содержащиеся в нем клетки в суспендированном состоянии.
В особо предпочтительном варианте осуществления изобретения инокулированные клетки инкубируют до тех пор, пока они не достигнут слияния, а затем клетки помещают во вращающийся сосуд с ростовой средой и инкубируют в двойном газовом инкубаторе при вращении сосуда. Предпочтительно инокулированные клетки соскабливают во вращающийся сосуд. Это может быть достигнуто разнообразными способами, известными специалистам, таким, например, как использование клеточного скребка для отделения клеток. Как только клетки вводят во вращающийся сосуд, лопасть в нем вращается со скоростью в интервале от примерно 30 до примерно 60 об/мин для того, чтобы поддерживать клетки в суспензии.
Часть культивированных бактерий L. intracellularis затем пассируется в свежую культуру с целью повышения образования бактерий L. intracellularis. Термин "пассируется" или его вариации, как они здесь используются, означают процесс перенесения части культивированных бактерий L. intracellularis в свежие культивируемые клетки с целью инфицирования свежих клеток бактериями. Термин "свежие", как он использован здесь, означает клетки, которые еще не инфицированы L. intracellularis. Предпочтительно возраст таких клеток в среднем не более примерно одних суток.
Пассаж L. intracellularis в суспензионные культуры можно выполнить удалением части исходной культуры и добавлением ее в новый сосуд, содержащий свежие культивируемые клетки. Если исходная культура имеет высокое значение количества бактерий/мл, например более примерно 104 бактерий/мл, предпочтительно добавлять в новый сосуд, содержащий свежие клетки, примерно от 1 до 10% (объемных) культуры из инфицированного сосуда. Предпочтительно осуществлять это, когда 50-100% клеток инфицированы. Если инфицировано менее 50% клеток, предпочтительно проводить пассаж разделением культуры в соотношении 1:2 в новом сосуде и доведением объема путем добавления свежей среды. В любом случае не нужен лизис клеток и другие этапы, в отличие от пассажа монослойных культур по прототипу.
После достаточного роста культивируемых клеток и последующего заражения бактериями L. intracellularis до уровня клеточной инфективности более примерно 70%, что определяется иммунно-ферментным анализом (ИФА), 50%-ной инфекционной дозой тканевой культуры (ТКИД50) или другим сопоставимым методом, собирают, по крайней мере, часть культивированных бактерий L. intracellularis. Этап сбора может осуществляться выделением бактерий, например, из суспензии, различными приемами, известными обычным специалистам, с учетом приведенных здесь доктрин. Предпочтительно бактерии L. intracellularis собирают центрифугированием содержимого всей или части суспензии с образованием осадка культивируемых клеток, ресуспендированием образующихся клеточных осадков и лизисом инфицированных клеток. Обычно, по меньшей мере, часть содержимого центрифугируется при примерно 3000 g в течение примерно 20 минут для того, чтобы осадить клетки и бактерии. Затем осадок ресуспендируют, например, в растворе сахароза-фосфат-глутамат (СФГ) и пассируют примерно четыре раза через иглу калибра 25 для того, чтобы лизировать клетки. Если желательна дальнейшая очистка, образцы могут быть центрифугированы при примерно 145 g в течение примерно пяти минут для того, чтобы удалить клеточные ядра и осколки. Затем можно центрифугировать супернатант при примерно 3000 g в течение примерно двадцати минут и образующийся осадок ресуспендировать в соответствующем растворителе, таком как СФГ с эмбриональной бычьей сывороткой (чтобы получить собранные бактерии, пригодные для замораживания или использования в качестве инокулята) или ростовой средой (чтобы получить собранные бактерии, более пригодные для пассирования в свежие клетки).
Как упоминалось ранее, эффективный рост L. intracellularis для крупномасштабного производства усиливается содержанием культивируемых клеток в состоянии активного роста. В монослоях, когда культуры становятся сливающимися, скорость деления клеток существенно снижается. Попытки вырастить L. intracellularis на монослойных культурах тканей имели ограниченный успех, и масштабирование не было возможным. Однако предпочтительное использование суспензионных культур очень благоприятствует содержанию клеток в состоянии активного роста и позволяет продолжать развитие культуры и проводить масштабирование. Используя ферментер и растворенный кислород в количестве около 0-3%, мы смогли вырастить до 108 бактерий/мл. Мы смогли также держать культивируемые бактерии в состоянии активного роста в течение многих месяцев и ожидаем, что сможем сделать это в течение неограниченного времени.
До настоящего изобретения обычно считалось, что клетки должны прикрепляться к поверхности для того, чтобы инфицироваться L. intracellularis. Предпочтительные клеточные суспензии настоящего изобретения уникальны и противоречат этой теории. При использовании клеток McCoys, наряду со средой, предпочтительно добавить желатин, агарозу, коллаген, акриламидные или кремнийсодержащие гранулы, такие как пористые микроносители Cultisphere-G, производимые фирмой ХайКлон Лэборэтрис (Логан, Юта).
В случае клеточных культур с микроносителями или бусами предпочтительно 25-50% культуры удаляется 1-2 раза в неделю и заменяется свежими микроносителями или бусами и свежей средой. В целях масштабирования к культуре могут быть добавлены дополнительные 25-50% среды или среды с микроносителями.
В зависимости от скорости, с которой культивируемые клетки становятся инфицированными, пассаж в свежие клетки обычно проводят в интервале между примерно каждой 2 и примерно каждой 5 неделями. Полагая, что культивируемые клетки за 2-3 недели становятся инфицированными, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно проводить пассаж примерно между каждой 3-4 неделями.
После поддержания инфицированных клеток, например, в суспензии в течение продолжительного времени (например, 6-8 месяцев), по меньшей мере, часть культивированных бактерий L. intracellularis можно собирать и проверять на возможную аттенуацию. Такой мониторинг предпочтительно выполняется с помощью животного-хозяина или моделей животных-мишеней для того, чтобы отобрать аттенуированный штамм. Такие аттенуированные штаммы можно использовать в вакцинах.
Настоящее изобретение дает возможность культуре быстро развиваться (100-1000-кратное увеличение выходов) и снижает затраты. В итоге обильные запасы бактерий L. intracellularis, произведенные в соответствии с методом культивирования этого изобретения, легко аттенуируются в целях производства вакцины. Аттенуация в монослойных культурах затруднена из-за низкого выхода бактерий, полученных с использованием обычных приемов культивирования монослоев. В противоположность этому способ культивирования L. intracellularis настоящего изобретения значительно легче, быстрее и увеличивает количество бактерий, необходимых для этой цели. Чем больше клеток и происходящих клеточных делений, тем выше уровень наблюдающихся мутаций, которые имеют преимущественное значение в создании вакцины. Предпочтительное культивирование в суспензиях в соответствии с этим изобретением повышает экспрессию важных иммуногенов, контролируемых экологически регулируемыми генами и продуктами их экспрессии.
Образующиеся аттенуированные штаммы могут культивироваться в монослойных тканевых культурах, как описано ниже в примере 1, но предпочтительно культивируются в суспензионных культурах в соответствии со способом этого изобретения. Другие способы аттенуации могут включать химическую аттенуацию с использованием, например, N-метилнитрозогуанидина и других соединений, известных специалистам. Независимо от того, используются ли множественные пассажи или химические способы, продуцируются аттенуированные бактерии L. intracellularis и отбираются для получения вакцины.
При получении вакцины антиген можно собирать центрифугированием или микрофильтрацией, как описано выше. Затем антиген можно стандартизировать на определенном уровне, основанном на оптимальном иммунном ответе животного-хозяина, определяемом титрованием дозы у видов животного-хозяина. Бактерии могут быть инактивированы продолжительной экспозицией, например в течение одной недели, с кислородом окружающей среды или применением 0.3% формалина или других инактивирующих агентов с целью получения убитой вакцины. Затем антиген включается в соответствующий адъювант, такой как гидроксид алюминия или минеральное масло, для усиления иммунного ответа. После этого антиген можно использовать для вакцинации хозяина посредством внутримышечной или подкожной инъекции, в случае свиней в возрасте около 3-4 недель, при необходимости с усиливающей иммунизирующей дозой.
Альтернативно, бактерии с использованием ранее описанных методов культивирования можно пассировать по сериям с целью индукции и отбора аттенуированной, авирулентной живой культуры. Культуру можно тестировать на признаки аттенуации на животном-хозяине (предпочтительно после роста, например, суспензионной культуры в течение, по крайней мере, 6 и до 8 месяцев или более). При этом культуру собирают, как описано ранее, и разбавляют. Например, свиней вакцинировают, вводя перорально от 1×105 до 1×106 бактерий. Примерно через двадцать восемь дней после вакцинации свиней инокулировают, вводя перорально по 1×107 бактерий из вирулентной культуры L. intracellularis с меньшим числом пассажей (время жизни около 30-45 дней). Инфицированных животных вскрывают через 21 день после введения и исследуют тонкий кишечник на большие поражения, а также на микроскопические поражения. Должен быть проведен также анализ с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и флуоресцирующих антител (ФА). Анализом методами ПЦР и ФА примерно у 80% контрольных животных обнаружены большие или микроскопические поражения и положительная проба на присутствие L. intracellularis в клетках слизистой оболочки кишечника. У вакцинированных животных при гистологическом анализе будет нормальная слизистая оболочка и отрицательный анализ методом ПЦР.
Аттенуированный иммуногенный штамм L. intracellularis можно получать после продолжительного культивирования в течение, по меньшей мере, примерно 150 и 250 суток, в ходе которых культуру пассируют, по меньшей мере, от примерно 7 до примерно 12 раз. Другие аттенуированные культуры могут быть продуцированы путем изменения этих параметров до таких пределов, которые используются в приведенных здесь способах мониторинга и селекции.
После этого можно получать вакцину, включающую иммунологически эффективное количество аттенуированных бактерий L. intracellularis в фармацевтически приемлемом носителе. Соединенные вместе иммуноген и носитель могут быть в виде водного раствора, эмульсии или суспензии. Иммунологически эффективное количество определяется способами, известными специалистам, без чрезмерного экспериментирования с учетом содержащихся здесь доктрин. В общем, при использовании очищенных бактерий количество иммуногена будет находиться в интервале 50-500 микрограмм, предпочтительно в интервале 107-109 ТКИД50.
Вакцины обычно вводят чувствительным животным, предпочтительно свиньям, в одной дозе или более. Живую или убитую вакцину можно вводить 1 или 2 раза с двухнедельными интервалами. Для аттенуированной, живой вакцины предпочтительной является одна доза. Предпочтительными путями введения живых, аттенуированных штаммов являются пероральный или интраназальный, но используется также внутримышечная или подкожная инъекция. Внутримышечная и подкожная инъекция являются предпочтительными путями введения убитой вакцины.
Эффективный диагноз ПЭС был также затруднен из-за времени, которое требовалось для того, чтобы культивировать причинные бактерии. Итогом настоящего изобретения является то, что теперь стало возможным создать диагностические средства, способствующие быстрому и точному определению наличия L. intracellularis в биологических образцах, взятых у свиней и других животных, чувствительных к ПЭС.
Бактерии L. intracellularis, выросшие в соответствии со способом настоящего изобретения, или компоненты, полученные из таких бактерий, могут использоваться в качестве антигена в иммуноферментном анализе (ELISA-тест) или в другом иммунотесте, таком как анализ с использованием иммунофлуоресцирующего антитела (ИФА), с целью определения антител к L. intracellularis в сыворотке и других жидкостях организма животных, подозреваемых в инфицировании бактериями. В настоящее время предпочтительным иммуноанализом является ИФА, как описано в примере ниже. Альтернативно, бактерии, выросшие в соответствии с данным изобретением, могут использоваться в анализе методом Вестерн-блоттинга.
Предпочтительный протокол ELISA-теста в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения следующий:
1. Добавить 0.1 мл/ячейку антигена, разведенного покрывающим буфером. Инкубировать в течение 18 часов при 4°С.
2. Промыть 3 раза ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором).
3. Добавить 25 мл блокирующего буфера в каждую ячейку планшета. Инкубировать от 1 часа до 2 часов при 37°С.
4. Промыть 3 раза водным буфером.
5. Развести сыворотку в блокирующем буфере и добавить 0.1 мл в первые ячейки планшета. Сделать серийные разведения 1:2 по ширине планшета. Инкубировать в течение 1 часа при 37°С.
6. Промыть 3-5 раз водным буфером.
7. Развести конъюгат в блокирующем буфере, добавить по 0.1 мл в ячейки планшета и инкубировать 1 час при 37°С.
8. Промыть 3-5 раз водным буфером.
9. Добавить субстрат.
10. Измерить поглощение света на спектрофотометре.
11. Ячейки, в которые не был добавлен антиген, использовать как слепой опыт.
12. В каждом опыте должна быть использована свиная сыворотка в качестве положительного и отрицательного контроля.
Предпочтительный протокол Вестерн-блоттинга следующий:
1. Подвергнуть антиген электрофорезу в полиакриламидном геле в 12% додецилсульфате натрия (ДСН-ПАГЭ) и перенести на нитроцеллюлозную мембрану.
2. Поместить мембрану в блокирующий буфер на 2 часа.
3. Удалить блокирующий буфер и промыть ЗФР в течение 1 минуты.
4. Развести сыворотку в блокирующем буфере и добавить к мембране. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
5. Промыть 3 раза водным буфером (5 минут на каждую промывку).
6. Развести конъюгат в блокирующем буфере и добавить к мембране. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
7. Промыть 3 раза водным буфером.
8. Добавлять субстрат в течение 10 минут или до тех пор, пока не появится сильная полоса.
9. Промыть ЗФР.
10. Сушить на воздухе и хранить в темноте.
Далее настоящее изобретение описывается следующими примерами, которые представлены только в иллюстративных целях и не должны интерпретироваться как ограничивающие.
Пример 1
Рост L. intracellularis в суспензионных культурах клеток McCoys
Материалы и методы:
Отбор образцов инокулята:
Образец №24912 был получен от стада на ферме в Айове, где у пятнадцати из 300 пятимесячных откормленных свиней наблюдался устойчивый кровавый стул, несмотря на лечение пенициллином. При вскрытии свиней кишечник (подвздошная кишка) имел(а) утолщенную слизистую оболочку. Гистопатологические исследования с серебряным окрашиванием демонстрировали наличие изогнутых внутриклеточных палочковых бактерий и криптовую энтероцитнуго гиперплазию, подтверждающую диагноз ПЭС. Образец №72994 был получен от полуторагодовалой второго помета свиноматки SPF с фермы из Миннесоты. Поголовье стада составило примерно 70-80 свиноматок, лечение антибиотиком не проводилось. После вскрытия слизистая оболочка подвздошной кишки была утолщенной с признаками геморрагии. Окрашивание слизистой оболочки по Гиминезу демонстрировало много изогнутых палочковых бактерий. Образец №101494 был получен от 12-недельной взрослой свиньи на ферме в Индиане с 600 свиноматок различной упитанности (от морщинистой до откормленной). Свинью лечили тиланом, вводимым при появлении признаков геморрагической диареи, но животное погибло вскоре после обработки.
Приготовление полученного от свиньи бактериального инокулята:
Кишечные образцы выдерживали при -70°С. Кишечники вскрывали и промывали ЗФР. Образец слизистой оболочки в количестве 1 г соскребали в раствор натрий-калийглутамата (НКГ) и гомогенизировали в течение 30 секунд с 4.0 мл 1% трипсина (ДжРХ Биосайенсис, Ленекса, Канзас) в НКГ. Суспензии инкубировали в течение 35 минут при 37°С. Добавляли 10 мл смеси 10 мл СФГ/10% ЭБС (эмбриональной бычьей сыворотки) и образцы измельчали в течение 1 минуты в измельчителе тканей. Прибавляли дополнительно 10 мл СФГ/10% ЭБС, фильтровали через бумажный фильтр (Ватман V113, фирма Ватман Лэбсэйлс, Хиллсборо, Орегон) и последовательно через мембранные фильтры 5.0, 1.0 и 0.65 микрон. Фильтраты разделяли на аликвоты по 1.0 мл и замораживали при -70°С. Мазок из слизистой оболочки наносили на предметное стекло для окрашивания по Гименезу. Отдельные мазки фильтратов красили ИФА с использованием специфичного моноклонального антитела к L. intracellularis. S.McOrist и др., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) (включена здесь полностью в виде ссылки).
Образец бактерий L. intracellularis, культивированных в соответствии со способом следующего примера, по Будапештскому Соглашению от 19 мая 1995 года был помещен на хранение в АТСС (12301 Парклоун Драйв, Роквилл, Мерилэнд США) и обозначен вступительным номером 55672.
Инфицирование клеточной культуры:
Два обычных сосуда на 25 см2 каждый засевали 1.25×105 клеток McCoys в ДМСИ/10% ЭБС, давали клеткам расти в течение 18-24 часов. Во время инокуляции слияние клеток составляло 30%. Инокулят разводили в ДМСИ/5% ЭБС. В случае инокулята из гомогената кишечника среда содержала также ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин В (2.0 мкг/мл). Культуры помещали в газовые камеры, камеры эвакуировали и регазировали водородом и двуокисью углерода для того, чтобы получить смесь, состоящую из 8.0% O2, 10% СО2 и 82% Н2. Культуру инкубировали в течение 3 часов при 37°С, затем добавляли неомицин и гентамицин. Через 24 часа культуру вновь заливали ДМСИ/5% ЭБС с L-глутамином, ванкомицином (100 мкг/мл), неомицином (50 мкг/л), гентамицином (50 мкг/л) и амфотерицином (2.0 мкг/мл). Антибиотики не требовались, когда инокулят представлял собой чистую культуру. Культуру инкубировали в течение 6 дней или до слияния. Клетки выскабливали из сосудов и прибавляли во вращающийся сосуд на 100 мл, содержащий 50 мл ДМСИ/5% ЭБС и 0.05 г микроносителя Cultisphere-G. Содержимое сосудов перемешивали при вращении со скоростью 40-50 об/мин. Культуру разводили в соотношении 1:2 каждые 2-3 дня либо путем выращивания половины культуры и добавления свежей среды и гранул Cultisphere-G, либо путем перенесения культуры в больший вращающийся сосуд и добавления среды и гранул Cultisphere-G. Окончательная концентрация гранул в культуре составила примерно 0.001 г гранул/мл.
Пассаж культуры:
Культуру пассировали в свежие клетки McCoys путем высевания 1×107 новых клеток McCoys в ДМСИ/2% ЭБС и 0.05 г гранул Cultisphere-G. Новую культуру инкубировали в течение ночи при 8.0% O2, 8.8% CO2 и 83.2% H2. Затем новую культуру инокулировали 25 мл инфицированной культуры и инкубировали при пониженной концентрации О2, как описано ранее.
Сбор и хранение культур:
Культуры собирали накоплением желаемого количества с помощью центрифугирования при 3000 g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Культуры разделяли на аликвоты и замораживали при -70°С. Для дальнейшей очистки образец центрифугировали при 145 g в течение 5 минут с целью удаления клеточных ядер и осколков. Затем центрифугировали супернатант при 3000 g в течение 20 минут. После этого осадок ресуспендировали в разбавителе.
Определение жизнеспособных бактерий L. intracellularis в тканевой культуре:
Количественную оценку жизнеспособных бактерий L. intracellularis проводили, как описано в Примере 2, с помощью иглы калибра 22 для того, чтобы лизировать клетки, и с использованием клеток McCoys в количестве 1250 клеток/ячейку для того, чтобы засеять планшеты для микротитрования.
Результаты:
Результаты определения ТКИД50 указывали на то, что культуры содержали до 1×106 бактерий/мл. На это потребовалось менее одного месяца. За то же время культивируемый объем увеличился до 3.0 л.
Пример 2
Эксперимент по определению эффективности свиной вакцины
Цель:
Объектом этого исследования явилась оценка безопасности, персистенции колоний и эффективности авирулентной живой культуры и авирулентной убитой культуры бактерий L. intracellularis у свиней 2-3-недельного возраста. Проведено исследование с животным-хозяином, в ходе которого свиней трехмесячного возраста вакцинировали, затем подвергали вирулентной вакцинации штаммом №343 бактерий L. intracellularis для того, чтобы сравнить различия в защитном действии вакцин.
Методы:
11 Декабря 1995 года от фирмы Х и К Фармс было получено всего 45 свиней трехнедельного возраста. Они были перевезены в Ветеринери Рисорсис, Инк., в исследовательский объект, расположенный рядом с Кембриджем, Айова, где они были снабжены бирками, удостоверяющими каждую свинью. Свиней выдерживали на этом объекте в течение двух дней до начала исследования с целью адаптации и на протяжении всего исследования давали корм, не содержащий антибиотиков.
13 Декабря всех свиней взвесили, собрали образцы крови для приготовления сыворотки, оцененной клинически, и ректальные мазки. Затем свиней произвольно разделили на группы по пять животных и поместили в ванны. Двадцать свиней поместили в отдельное помещение и обозначили как контрольную и строго контрольную группу. Пятнадцать свиней поместили во второе помещение для введения вакцины ISi-1. В третьем помещении было десять свиней для введения вакцины ISi-2.
Живую вакцину получали в НОБЛ Лаборейториз Рисеч и Девелопмент Фэсилити и идентифицировали как экспериментальную серийную вакцину ISi-1. Вакцину ISi-1 (штамм №343) выделяли от свиньи и непрерывно выращивали в чистой культуре в течение 29 недель. Вакцину выращивали в клетках McCoys во вращающихся сосудах при пониженном содержании кислорода до тех пор, пока не наблюдалось примерно 100% заражение. Образец высокопассированного штамма №343, использованный для получения ISi-1, пассировали дополнительные 11 недель ("N343NP40wk") и в соответствии с Будапештским Соглашением от 22 мая 1996 года сдали на хранение в АКТК (12301 Парклоун Драйв, Роквилл, Мерилэнд, США, 20852) под вступительным номером 55783. Культуры собирали центрифугированием при 3000 g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ с 10% ФБС и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Лизаты центрифугировали при 500 g в течение 5 минут с целью осаждения клеточных осколков и гранул микроносителя. Супернатант отделяли и хранили при -70°С, примерно за час до вакцинации его помещали на лед и хранили до введения.
Убитую вакцину (ISi-2) выращивали, пассировали в течение 12.5 недель, собирали таким же образом, как описано выше, и очищали путем перколяционного градиента. Очищенные бактерии затем хранили при -70°С, примерно за неделю до вакцинации хранили при 4°С и при нормальной атмосферной концентрации кислорода, которая является токсичной для бактерий L. intracellularis. К бактериям добавляли AlOH до конечной концентрации 10%. Концентрацию белка определяли по методу Биуретта.
Количественная оценка живой культуры IS intracellularis:
Количественную оценку жизнеспособных бактерий L. Intracellularis проводили определением ТКИД50. Образец по сериям разбавляли в соотношении 1:10 с ДМСИ/5% ЭБС с ванкомицином (100 мкг/мл) и амфотерицином (2.0 мкг/мл). Планшеты для микротитрования с 96-ячейками засевали клетками McCoys в количестве 1250 клеток/ячейку и инкубировали в течение 18-24 часов до начала инфицирования. Образцы по сериям разбавляли в соотношении 1:10 с ДМСИ/5% ЭБС, содержащей ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин В (2 мкг/мл). Разведения добавляли в 96-ячеечный планшет для микротитрования в количестве 0.1 мл/ячейку. Использовали 12 ячеек/разведение. Планшет инкубировали в течение 6 дней при 37°С и при концентрации газов: 8.0% О2, 8.8% CO2 и 83.2% N2. Клетки фиксировали охлажденным 50% ацетоном и 50% метанолом в течение 2 минут. В ячейки добавляли 0.03 мл/ячейку моноклонального антитела против L. intracellularis (полученного д-ром Steven McOrist), разбавленное ЗФР в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали 30 минут при 37°С и затем трижды промывали с ЗФР. Конъюгат антимышиного иммуноглобулина G с флуорохромом ФИТЦ, разбавленный в соотношении 1:30, добавляли в количестве 0.03 мл/ячейку и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем планшет трижды промывали бидистиллятом и сушили. Образцы наблюдали под флуоресцентным микроскопом и определяли ТКИД50/мл, используя для расчета методику Рееда-Менша.
Результаты, полученные определением ТКИД50, указывали на то, что культура ISi-1 содержала 1.8×105 бактерий/мл. Четвертым инокулятом было плацебо, полученное из клеток культуры, обработанных так же, как и при получении вакцины.
Убитая вакцина была исследована на содержание тотального белка с использованием метода Биуретта и содержала 0.311 мг/мл.
Свиней вакцинировали 13 декабря 1995 года. Живую вакцину вводили всем интраназально в дозе 2 мл по 1 мл/ноздрю. Убитую вакцину (ISi-2) вводили внутримышечно по 1.5 мл/свинью и снова через 14 дней. Всем контрольным животным вводили неинфицированные клетки таким же образом, как и живые вакцины.
Условия наблюдения и образцы:
Фекальные мазки и сыворотки собирали с семидневными интервалами на протяжении всего исследования. Фекальные мазки готовили для исследования методом ПЦР с использованием набора праймеров, включающего 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' и 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3', использующихся для амплификации ДНК. Для первого цикла параметры составляли 93°С в течение 5 минут, 55°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 45 секунд. Проводили 33 цикла при ранее упомянутых температурах в течение 45 секунд на каждую температуру. Заключительный цикл проводили при 93°С в течение 45 секунд, при 55°С в течение 45 секунд и при 72°С в течение 2 минут, праймеры определяли по Jones и др.
Контрольное заражение:
Всем животным, за исключением группы строгого контроля, на 26 и 27 день после вакцинации давали контрольную культуру, включающую низкопассированные культуральные штаммы бактерий L. intracellularis №343 и №72994, которые выращивали непрерывно между 8 и 12 неделями. Культуру собирали центрифугированием при 3000 g в течение 20 минут. Осадки ресуспендировали в растворе СФГ, содержащем 10% ЭБС, и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Часть собранной культуры хранили при -70°С, оставшуюся часть выращивали до начала контрольного заражения и собирали. Инокуляты контрольного заражения объединяли и определяли ТКИД50 культуры. До начала введения образцы хранили на льду.
Контрольная культура, введенная 8 января 1996 года, включала 104 бактерий/мл, контрольная культура, введенная 9 января 1996 года, включала 3×104 бактерий/мл. Свиньям вводили по 15 мл контрольной культуры через желудочный зонд в каждый из двух дней. Таким образом, 8.01.96 и 9.01.96 животные получали по 6×105 бактерий/свинью и 4.7×105 бактерий/свинью соответственно.
Результаты:
Безвредность вакцины:
Результаты, полученные при исследовании фекальных мазков с помощью ПЦР: определение бактерий L. intracellularis с использованием ПЦР показало, что ни одна свинья не была бактерионосителем в начале исследования. На седьмой день после вакцинации пробы у всех свиней были отрицательными. На четырнадцатый день после вакцинации у 3 свиней в группе, получавшей штамм ISi-1, пробы были положительными. На двадцать первый день после вакцинации у двух животных в этой группе пробы были положительными, у остальных животных - отрицательными. На двадцать шестой день после вакцинации по данным ПЦР не было ни одного животного-бактерионосителя. На двадцать шестой день после вакцинации 5 свиней из группы, получавшей ISi-1, и контрольных групп, а также 4 свиньи из группы, получавшей ISi-2, были вскрыты. Собранные образцы включали подвздошную кишку, ободочную кишку, лимфатический узел брыжейки, миндалину, а также образцы легкого у свиней с поражениями от предполагаемой пневмонии.
Тестирование методом ПЦР проводили с индивидуальными образцами подвздошной кишки и легкого. Миндалины, ободочную кишку и лимфатические узлы объединяли по группам и проводили ПЦР. Результаты тестирования, полученные с помощью ПЦР, приведены ниже.
Гистологические срезы подвздошной кишки окрашивали с использованием моноклонального антитела, специфичного к бактериям L. intracellularis, в качестве первичного антитела и конъюгата антимышиного иммуноглобулина G с флуорохромом в качестве вторичного антитела. Бактерии L. intracellularis наблюдали у 3 из 5 свиней из группы, получавшей ISi-1. У остальных животных пробы при окрашивании с помощью флуоресцирующего антитела были отрицательными.
Оставшихся свиней вскрывали на 21 день после контрольного заражения и собирали для оценки такие же образцы. Данные ПЦР приведены ниже.
В контрольной группе у 7 из 10 животных окрашивание срезов подвздошной кишки с помощью ФА, как отмечено выше, было положительным.
Сыворотки исследовали на образование антител к IgG у свиней после воздействия бактерий L. intracellularis. Опыт проводили путем высевания в планшеты Терасаки для обработанных тканевых культур клеток McCoys в количестве 125 клеток/ячейку и инкубации в течение 18-24 часов перед заражением. Чистую культуру L. intracellularis разбавляли в ДМСИ, содержащей 5% ЭБС, до содержания 1000-3000 бактерий/мл, затем добавляли в ячейки по 0.01 мл/ячейку. Планшеты инкубировали в течение 6 дней при концентрациях газов 8.0% O2, 8.8% CO2 и 83.2% N2. Клетки фиксировали охлажденным 50% ацетоном и 50% метанолом в течение 2 минут. Сыворотки свиней разбавляли в соотношении 1:75 стерильным ЗФР. Разбавленную сыворотку добавляли в ячейки по 0.01 мл/ячейку. Планшеты инкубировали в течение 30-60 минут при 37°С. Планшеты пятикратно промывали стерильньм ЗФР. В ячейки добавляли по 0.01 мл/ячейку конъюгата антисвиного иммуноглобулина G с флуорохромом. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Планшеты пятикратно промывали бидистиллятом и высушивали. Образцы просматривали под флуоресцентным микроскопом и ячейки с наблюдаемыми бактериями считали меченными положительно, а ячейки без бактерий - меченными отрицательно.
Результаты:
Животные, давшие положительную пробу в нулевой день, тестировались снова с недельными интервалами. Результаты продемонстрировали, что все животные дали серологически отрицательные пробы на 14 день после вакцинации. Это явилось неожиданностью, поскольку в нулевой день возраст свиней составлял три недели, и положительные пробы в этом возрасте могут быть связаны с присутствием материнских антител.
Сыворотки сравнивали с положительной контрольной сывороткой, полученной путем гипериммунизации свиньи введением выросших в чистой культуре бактерий L. intracellularis. Использованная отрицательная контрольная сыворотка была получена от гнотобиотической свиньи из Государственного Университета Южной Дакоты.
Приведенные выше описание и примеры являются всего лишь иллюстрацией предпочтительных вариантов осуществления изобретения, которые успешно выполняются с помощью объектов, характерных признаков и преимуществ настоящего изобретения, и это не означает, что настоящее изобретение ограничено ими. Любые модификации настоящего изобретения, которые соответствуют сущности и сфере действия нижеследующей формулы изобретения, считаются его частью.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ культивирования бактерий Lawsonia intracellularis в клетках McCoys. Способ предусматривает инфекцию клеток McCoys бактериями Lawsonia intracellularis и культивирование их при концентрации кислорода от 0 до 18%. Предложено также применение клеток McCoys для внутриклеточного культивирования бактерий Lawsonia intracellularis. Изобретение позволяет расширить технологические возможности культивирования бактерий Lawsonia intracellularis. Изобретение может быть использовано в вирусологии и ветеринарии. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 табл.
а) инфекции клеток McCoys бактериями L. intracellularis;
б) культивирования упомянутых инфицированных клеток McCoys при концентрации кислорода от 0 до примерно 18%.
Приоритет по пунктам и признакам:
| STILLS H.F | |||
| Jr., Isolation of an intracellular bacterium from hamsters (Mesocricetus auratus) with proliferative ileitis and reproduction of the disease with a pure culture | |||
| Infection Immunity, 1991, vol.59, no.9, p.3227-3236 | |||
| MCORIST S | |||
| et | |||
| al., Entry of the bacterium ileal symbiont intracellularis into cultured enterocytes and its subsequent |
