Lawsonia intracellularis ЕВРОПЕЙСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ВАКЦИНЫ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ НА ЕЕ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США серийный номер 60/490001, поданной 25 июля 2003 г., содержание которой включено в настоящее описание во всей полноте в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцинам на основе Lawsonia intracellularis (вакцинам Lawsonia intracellularis) и к способам защиты от инфекции, вызываемой L.Intracellularis, и диагностики указанной инфекции. Продукты и способы, предлагаемые в изобретении, можно реализовывать на практике, в частности, в результате разработки усовершенствованного способа крупномасштабного культивирования L.intracellularis, включая новый изолят L.intracellularis европейского происхождения, и способа получения лиофилизированного продукта, представляющего собой вакцину, который содержит ослабленный европейский изолят.

L.intracellularis, возбудитель пролиферативной энтеропатии свиней ("ПЭС"), поражает практически всех животных, включая кроликов, хорьков, хомяков, лис, лошадей и различных представителей других классов животных, таких как страусы и эму. L.intracellularis является наиболее распространенной причиной потерь поголовья свиней в Европе, а также в Соединенных Штатах.

Характерной особенностью ПЭС является присутствие интрацитоплазматических несвязанных с мембраной изогнутых бацилл внутри энтероцитов в инфицированных областях кишечника. Бактерии, связанные с ПЭС, были названы "Campylobacter-подобными организмами" (S.McOrist и др., Vet. Pathol., том 26, 1989, сс.260-264). Затем бактерии-возбудители были охарактеризованы в качестве нового таксономического рода и видов под общеупотребительным названием Ileal symbiont (IS) intracellularis (C.Gebhart и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том. 43(3), 1993, сс.533-538). В последние годы этим новым бактериям было дано таксономическое название Lawsonia (L.) intracellularis (S.McOrist и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том 45 (4), 1995, сс.820-825). Эти три названия использовали взаимозаменяемо для обозначения одного и того же организма, как он идентифицирован и описан далее в настоящем описании.

L.intracellularis является облигатной внутриклеточной бактерией, которую нельзя культивировать с помощью обычных бактериологических методов на стандартных бесклеточных средах, и предполагается, что для своего роста они должны присоединиться к эпителиальным клеткам. У S.McOrist и др., Infection and Immunity, том 61 (19), 1993, сс.4286-4292 и G.Lawson и др., J. of Clinical Microbiology, том 31 (5), 1993, сс.1136-1142 описано культивирование L.intracellularis с использованием монослоев крысиных эпителиальных клеток кишечника линии IEC-18 в стандартных колбах для культуры ткани. Кроме того, у Н.Stills, Infection and Immunity, том 59 (9), 1991, сс.3227-3236 описано применение монослоев человеческих эмбриональных клеток кишечника линии Intestine 407 и монослоев клеток аденокарциномы ободочной кишки линии GPC-16 морской свинки для культивирования в стандартных колбах для культуры ткани.

В последние годы в Соединенных Штатах было разрешено применение вакцины L.intracellularis, где вакцина основана на изолятах L.intracellularis, описанных и заявленных в US 5714375 и 5885823, оба патента включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте. Указанная выше вакцина поступает в продажу от фирмы Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., 2621 North Belt Highway, Сент-Джозеф, шт.Миссури, 64506-2002, под товарным знаком ENTERISOL^® Ileitis.

Краткое изложение сущности изобретения

Одной из целей изобретения является создание усовершенствованной вакцины L.intracellularis с использованием изолята европейского происхождения.

Другой целью изобретения является разработка усовершенствованного способа крупномасштабного культивирования L.intracellularis и усовершенствованного способа производства вакцины L.intracellularis.

Для достижения этих и других целей и в соответствии с задачей изобретения, как оно представлено и подробно описано в настоящем описании, в настоящем изобретении предложен новый выделенный изолят L.intracellularis европейского происхождения, способ ослабления такого изолята и его ослабленный изолят. В настоящем изобретении предложена также вакцина, содержащая ослабленный изолят. В настоящем описании предложен также способ получения вакцины, содержащей ослабленный изолят в лиофилизированной форме, предназначенной для восстановления при введении, и лиофилизированный продукт, представляющий собой указанную вакцину.

В одном из вариантов осуществления изобретения новый выделенный изолят DK 15540 L.intracellularis европейского происхождения представляет собой изолят, депонированный в АТСС (Американская коллекция типовых культур) под регистрационным номером РТА-4927. В другом варианте осуществления изобретения ослабленный изолят, выведенный из изолята DK 15540, представляет собой изолят, обозначенный как В3903, регистрационный номер АТСС РТА-4926.

Подробное описание изобретения

В контексте настоящего описания понятие "L.intracellularis" обозначает внутриклеточные искривленные грамотрицательные бактерии, подробно описанные у С.Gebhart и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том. 43 (3), 1993, сс.533-538 и S.McOrist и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том 45 (4), 1995, сс.820-825, каждая публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте, и включает (но, не ограничиваясь ими) изолят, обозначенный DK 15540, который был депонирован в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, 9 января 2003 г. под регистрационным номером АТСС РТА-4927; бактерии-возбудители, которые можно получать из зараженной ПЭС свиньи или других животных, обитающих во всем мире, на основе знаний в данной области и указаний, приведенных в настоящем описании; и варианты или мутанты любой из указанных выше бактерий, полученные спонтанно или искусственным путем.

В контексте настоящего описания понятие "ослабленный изолят" обозначает любой изолят L.intracellularis, полученный с помощью методов культивирования и пересева, приведенных в настоящем описании, для достижения авирулентности при сохранении иммуногенных свойств при введении животному-хозяину, включая (но, не ограничиваясь им) ослабленный изолят, обозначенный В-3903, который был депонирован в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, 9 января 2003 г. под регистрационным номером АТСС РТА-4926.

Ослабленный изолят, предлагаемый в изобретении, можно применять в качестве иммуногена в антимикробных вакцинах для животных, включая птиц, рыб и млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади и приматы. Такие вакцины можно получать методами, известными специалистам в данной области, с использованием указаний, приведенных в настоящем описании. Такая вакцина должна содержать иммунологически эффективное количество ослабленного изолята в фармацевтически приемлемом носителе. Вакцину можно вводить в виде одной или нескольких доз. Иммунологически эффективное количество определяют методами, известными в данной области, без проведения дополнительных экспериментов, руководствуясь указаниями, приведенными в данном описании. Количество авирулентных бактерий должно быть достаточным для стимуляции иммунного ответа у чувствительных к заболеванию животных, оставаясь при этом авирулентным. Это зависит от конкретного животного, бактерий и рассматриваемого заболевания. Рекомендованная доза, предназначенная для введения чувствительному животному, предпочтительно составляет от примерно 3,0 TCID₅₀ (конечное значение инфицирующей дозы, способной вызывать заражение 50% тканевой культуры)/дозу до примерно 6,0 TCID₅₀/дозу и более предпочтительно от примерно 4,0 TCID₅₀/дозу до примерно 5,0 TCID₅₀/дозу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения титр вакцины составляет примерно 4,9 TCID₅₀/дозу согласно методу разведении для определения значения инфицирующей дозы, способной вызывать заражение 50% тканевой культуры (TCID₅₀). Носители известны специалистам в данной области, и они включают стабилизаторы и разбавители. Такая вакцина может содержать также соответствующий адъювант. Вакцины, предлагаемые в изобретении, можно применять также в сочетании с другими вакцинами, например, в качестве разбавителя для другой вакцины. Препараты вакцин можно сушить, например, с помощью сушки вымораживанием, для целей хранения или для последующего приготовления препаратов в виде жидких вакцин.

Таким образом, под объем изобретения подпадает способ индукции иммунного ответа на вирулентные бактерии L.intracellularis дикого типа у животного-хозяина с целью защиты хозяина от таких бактерий. Способ заключается в том, что хозяину вводят иммунологически эффективное количество ослабленных бактерий или убитых бактерий, предлагаемых в изобретении, и предпочтительно хозяину вводят вакцину, предлагаемую в изобретении.

В контексте настоящего изобретения понятие "крупномасштабное культивирование" обозначает уровень культивирования L.intracellularis, превышающий примерно 2,0-3,0 л, и включает производство в масштабе 100 л или более. "Культивирование" в контексте настоящего описания обозначает процесс стимуляции роста, репродукции и/или пролиферации L.intracellularis.

L.intracellularis можно культивировать с помощью методов, известных в данной области, предпочтительно согласно методу, описанному в патентах US 5714375 и 5885823. Например, клеточную культуру можно сначала инокулировать инокулятом, содержащим бактерии L.intracellularis так, чтобы осуществить заражение клеток бактериями. Для осуществления на практике изобретения можно использовать многие клеточные линии, включая (но, не ограничиваясь ими) IEC-18 (АТСС 1589) - эпителиальные клетки кишечника крысы, НЕр-2 (АТСС 23) - клетки плоскоклеточного рака человека, McCoys (АТСС 1696) - мышиные неспецифические клетки, BGMK (Biowhittaker №71-176) - клетки почки зеленой мартышки-буффало и эпителиальные клетки кишечника свиньи. Предпочтительными клеточными культурами являются клетки линии НЕр-2, McCoys или IEC-18.

Если используют клеточную культуру, то перед инокуляцией клетки могут находиться в форме монослоя. Для образования монослоя клетки можно высевать в стандартные колбы. В каждую колбу высевают от примерно 1×10⁵ до примерно 10×10⁵ клеток на колбу или роллер-флакон площадью 25, 75, 150, 850 см², смешанных с питательной средой. Питательные среды могут представлять собой любые среды для культивирования клеток, которые содержат источник азота, необходимые факторы роста для выбранной клеточной культуры и источник углерода, такой как глюкоза или лактоза. Предпочтительной средой является DMEM, обогащенная средой Хэма F 12, содержащей 1-5% фетальной бычьей сыворотки, хотя можно применять также другие поступающие в продажу среды, позволяющие получать хорошие результаты.

Эффективность культивирования L.intracellularis усиливают, поддерживая клеточную культуру на стационарной фазе роста. Следовательно, монослой клеточной культуры должен обладать в момент инокуляции от примерно 20 до примерно 50%-ной конфлюэнтностью. Предпочтительно клетки должны обладать в момент инокуляции от примерно 30 до примерно 40%-ной конфлюэнтностью, наиболее предпочтительно примерно 30%-ной конфлюэнтностью.

В альтернативном варианте клетки перед инокуляцией можно выращивать в суспензии, как описано ниже. Предпочтительно клетки сначала выращивают до 100%-ной конфлюэнтности в форме монослоя в системе адгезивного слоя, например в системе роллер-флаконов, и затем переносят в сосуд объемом 3-3000 л и выращивают в суспензии. В альтернативном варианте клетки можно выращивать перед инокуляцией в суспензии до достижения требуемой плотности клеток, например 2×10⁵ клеток/мл, в сосуде объемом 3-3000 л (биореактор, ферментер, вращающаяся колба и т.д.) с использованием параметров, пригодных для роста в такой системе.

Инокулят может представлять собой чистую культуру L.intracellularis, полученную из инфицированной свиньи или других животных. Предпочтительно инокулят может представлять собой чистую культуру L.ilntracellularis, полученную из культуры, находящейся в АТСС под регистрационным номером РТА-4927.

Инокулят может представлять собой кишечный гомогенат, полученный путем соскабливания слизистой оболочки подвздошной кишки свиньи или другого животного, зараженного ПЭС. Когда приготавливают кишечный гомогенат, срезы подвздошной кишки, выбранные для получения культуры, должны иметь серьезные повреждения, характеризующиеся большим утолщением кишки. Вследствие недолговечности бактерий образцы после осуществления аутопсии предпочтительно следует как можно быстрее помещать на хранение при -70°С. К инокуляту добавляют антибиотик, к которому L.intracellularis обладает устойчивостью, такой как ванкомицин, амфотерицин В или представителей антибиотиков, несущих аминогликозидную группу, включая указанные в качестве примера гентамицин и неомицин, для подавления загрязняющих бактерий при сохранении роста L.intracellularis. Независимо от того, является ли инокулят чистой культурой или кишечным гомогенатом, инокуляцию клеточной культуры можно осуществлять различными методами, известными в данной области, с использованием указаний, приведенных в настоящем описании.

Затем бактерии и/или инокулированные клеточные культуры инкубируют при пониженной концентрации растворенного О₂. При концентрации растворенного кислорода выше 10% рост L.intracellularis происходит с меньшей скоростью по сравнению с оптимальной, причем, в конце концов, прекращается, когда концентрация кислорода выходит из указанного диапазона. Предпочтительно бактерии и/или инокулированную клеточную культуру инкубируют при концентрации растворенного кислорода в диапазоне от примерно 0 до примерно 10%. Более предпочтительно бактерии и/или клетки инкубируют при концентрации кислорода в диапазоне от примерно 0 до примерно 8%, причем наиболее предпочтительной является концентрация кислорода от примерно 0 до примерно 3,0%.

Оптимальная концентрация диоксида углерода также является важной для требуемого роста L.intracellularis. При концентрации диоксида углерода от 0 до 4% происходит неоптимальный рост, причем рост в конце концов прекращается, когда концентрация диоксида углерода находится в указанном диапазоне. Предпочтительно концентрация диоксида углерода находится в диапазоне от примерно 6 до примерно 10%, причем наиболее предпочтительной является концентрация диоксида углерода примерно 8,8%.

Кроме того, клетки предпочтительно инкубируют при концентрации водорода в диапазоне от примерно 4 до примерно 10%. Наиболее предпочтительно клетки инкубируют при концентрации О₂ от примерно 0 до примерно 8,0%, концентрации СО₂ примерно 8,8% и концентрации Н₂ примерно 4%. Азот применяют для роста рассматриваемого организма в качестве "баланса" в газовой смеси, содержащей азот (96%) и водород (4%) или азот (80%), диоксид углерода (10%) и водород (10%). Клетки предпочтительно инкубируют при концентрации азота в диапазоне от примерно 80 до 96%. Таким образом, клетки наиболее предпочтительно инкубируют при концентрации О₂ от примерно 0 до примерно 8,0%, концентрации СО₂ примерно 8,8%, концентрации Н₂ примерно 4%, концентрации N₂ примерно 96%.

Инокулированные клетки можно инкубировать в двойном газовом инкубаторе или иных газовых камерах, которые содержат необходимые концентрации водорода, кислорода и диоксида углерода и которые позволяют поддерживать клетки в суспендированном состоянии в процессе инкубации. Камера должна иметь устройства для поддержания инокулированных клеток в суспензии и газовый монитор, и источник питания для подачи и поддержания необходимых газовых концентраций. Температура инкубации должна находиться в диапазоне от 30 до примерно 45°С и более предпочтительно в диапазоне от примерно 36 до примерно 38°С. Наиболее предпочтительно температура составляет примерно 37°С. Необходимое оборудование для культивирования и ослабления хорошо известно и доступно специалистам в данной области и оно указано в настоящем описании. Одним из примеров оборудования, пригодного для осуществления настоящего изобретения, является двойной газовый инкубатор, например модель 480 (Lab-Line, Мелрозе Парк, шт.Иллинойс) в сочетании с вращающимися колбами для поддержания клеток в суспензии. Предпочтительное в настоящее время оборудование включает ферментер, биореактор, шейкер с перемешивающей пластиной или роторный шейкер, вмещающий по меньшей мере примерно 2 л сред, и способный поддерживать клеточную культуру в суспензии посредством продувки газом соответствующей концентрации или с помощью иных средств механического перемешивания, и позволяющий осуществлять непрерывный мониторинг уровней растворенного О₂ в средах. Фирма New Brunswick, Braun и другие компании изготавливают пригодные для этой цели ферментеры и биореакторы.

Максимального роста клеток и следовательно L.intracellularis достигают путем поддержания инокулированных клеток в суспендированном состоянии в процессе инкубации за счет увеличения контакта индивидуальных клеток с питательной средой и присутствия необходимой смеси водорода, кислорода и диоксида углерода. Клеточные культуры можно перемешивать и поддерживать в суспензии разнообразными методами, известными в данной области, с использованием, например, колб для культур, роллер-флаконов, мембранных культур, биоконтейнеров, биореакторных систем WAVE™, ферментеров и вращающихся колб. Клетки можно поддерживать в суспензии в процессе инкубации путем инкубации клеток во вращающейся колбе внутри двойного газового инкубатора или аналогичного устройства. Понятие "вращающаяся колба" в контексте настоящего изобретения обозначает колбу или иной контейнер, в котором для перемешивания культуры и поддержания ее в суспензии используется лопастная мешалка, пропеллерная мешалка или иные средства.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инокулированные клетки инкубируют до достижения конфлюэнтности клеток, и затем клетки помещают во вращающуюся колбу, содержащую питательные среды, и инкубируют в двойном газовом инкубаторе при вращении колбы. Предпочтительно инокулированные клетки соскабливают или трипсинизируют и пересевают во вращающуюся колбу. Это можно осуществлять различными методами, известными в данной области, например, с использованием скребка для клеток для отделения клеток. После внесения клеток во вращающуюся колбу лопасть вращающейся колбы, как правило, вращается со скоростью от примерно 5 до примерно 500 об/мин на магнитной перемешивающей пластине для поддержания инфицированных клеток в суспензии.

Затем часть культивированных L.intracellularis пересевают на свежую культуру для увеличения производства бактерий L.intracellularis. Понятие "пересев" или его варианты в контексте настоящего описания обозначает процесс переноса части культивированных L.intracellularis на свежую клеточную культуру для осуществления заражения свежих клеток бактерией. Понятие "свежий" в контексте настоящего описания обозначает клетки, которые еще не были заражены L.intracellularis. Предпочтительно возраст таких клеток в среднем составляет не более примерно одного дня.

Пересев L.intracellularis в суспензионных культурах можно осуществлять путем изъятия части исходной культуры и внесения ее в новую колбу, содержащую свежую клеточную культуру. Если исходная культура имеет большое количество бактерий/мл, например более примерно 10⁴ бактерий/мл, ее предпочтительно добавляют в количестве от примерно 1 до 10 об.% культуры из зараженной колбы по отношению к культуре свежих клеток, находящихся в новой колбе. Это предпочтительно осуществляют, когда заражено 50-100% клеток. Если заражено менее 50% клеток, то пересев предпочтительно осуществляют путем разделения культуры в соотношении 1:2 в новой колбе и увеличения объема с помощью добавления свежей тканевой клеточной культуры и сред. В любом случае не требуется осуществлять лизис клеток и другие стадии в полной противоположности от пересева монослойных культур, применяемого в прототипах.

После достижения достаточного увеличения клеточной культуры и последующего заражения L.intracellularis, что определяют с помощью окрашивания согласно методу непрямой иммунофлуоресценции (антител) (IFA), оценки значения TCID₅₀ или с помощью любого сопоставимого метода, собирают по меньшей мере часть культивированных бактерий L.intracellularis. Сбор, как правило, осуществляют при клеточной инфицированности, составляющей примерно 60% или более; однако специалисту в данной области известно, что сбор можно осуществлять при клеточной инфицированности менее 60%. Стадию сбора можно осуществлять путем отделения бактерий от суспензии с помощью различных методов, известных обычным специалистам в данной области, с использованием указаний, приведенных в настоящем описании. Предпочтительно бактерии L.intracellularis собирают путем центрифугирования всего содержимого или части суспензии с образованием дебриса клеточной культуры, ресуспендирования образовавшихся дебрисов клеток и лизиса инфицированных клеток. Как правило, по меньшей мере часть содержимого центрифугируют при примерно 3000×g в течение примерно 20 мин для того, чтобы получить дебрис клеток и бактерий. Затем дебрис можно ресуспендировать, например в сахарозо-фосфат-глутаматном (СФГ) растворе, и пропускать примерно 20 раз через иглу 25 размера для осуществления лизиса клеток. Если требуется дополнительная очистка, то образцы можно центрифугировать при примерно 145×g в течение примерно пяти минут для удаления клеточных ядер и дебриса. Затем супернатант можно центрифугировать при примерно 3000×g в течение примерно двадцати минут и образовавшийся дебрис ресуспендировать в соответствующем растворителе, таком как СФГ, дополненном фетальной бычьей сывороткой (чтобы сделать собранные бактерии пригодными для лиофилизации, замораживания или использования в качестве инокулята), или в питательных средах (чтобы сделать собранные бактерии пригодными для пересева на свежие клетки).

Как указывалось ранее, эффективный рост L.intracellularis для крупномасштабного производства усиливается при поддержании активного роста тканевых клеток. В случае монослоев, когда культуры становятся конфлюэнтными, скорость деления клеток существенно уменьшается. Попытки выращивать L.intracellularis на монослойных тканевых культурах не имели большого успеха и в этом случае увеличение масштаба производства оказывалось невозможным. Однако использование суспензионных культур значительно облегчает поддержание активного роста клеток и позволяет осуществлять непрерывное увеличение объема культуры и повышение масштаба производства. При использовании ферментера и концентрации растворенного О₂ от примерно 0 до 3%, как это указано выше, оказывается возможным достигать концентрации вплоть до 10⁸ бактерий/мл и выше.

Когда используют клетки линии IEC-18, то наряду с питательными средами предпочтительно добавляют желатин, агарозу, коллаген, акриламид или кремниевые гранулы, такие как пористые микроносители типа Cultisphere-G (фирма HyClone Laboratories, Логан, шт.Юта). Однако для клеток линии НЕр-2 и других линий клеток не требуются микроносители при использовании способов, предлагаемых в изобретении.

При использовании культур клеток линии НЕр-2 для поддержания культуры предпочтительно 25-50% культуры удаляют с недельными интервалами и заменяют свежими средами. Для клеточных культур с микроносителями или гранулами предпочтительно удаляют 25-50% культуры и заменяют свежими средами 1-2 раза в неделю. Для повышения масштаба производства к культуре можно дополнительно добавлять 25-50% сред или сред с микроносителями.

В зависимости от скорости, с которой происходит заражение клеточной культуры, пересев на свежие клетки, как правило, осуществляют с интервалом времени от примерно 2 до примерно 7 дней. Принимая во внимание, что клеточная культура становится зараженной по меньшей мере на 70% в течение 2-7 дней, пересев предпочтительно осуществляют примерно через каждые 5-7 дней.

В настоящем изобретении предложены также вакцины и способы получения вакцин против нового изолята L.intracellularis европейского происхождения. Предпочтительно после поддержания зараженных клеток в суспензии в течение продолжительного периода времени (например в течение 6-8 месяцев) собирают по меньшей мере часть культивированных бактерий L.intracellularis и осуществляют мониторинг возможного ослабления. Такой мониторинг предпочтительно осуществляют с использованием контрольного заражения животного-хозяина или на модели контрольного заражения с использованием животного для отбора ослабленного изолята. Такие ослабленные изоляты используют в вакцинах, согласно способам, представленным в настоящем описании.

Настоящее изобретение позволяет осуществлять быстрое размножение культуры, увеличивать выход в 100-1000 раз и уменьшать стоимость производства L.intracellularis европейского происхождения. В результате большое количество продуцируемых бактерий L.intracellularis легко можно ослаблять с целью получения вакцины. Способ выращивания L.intracellularis в суспензии позволяет значительно облегчать получение, повышать скорость и количество бактерий, пригодных для этой цели. Чем больше количество клеток и происходящих делений клеток, тем выше уровень возникающих мутаций, что является благоприятным с точки зрения создания вакцины. Так выращивание в суспензии повышает экспрессию важных иммуногенов, контролируемых регулируемыми окружающей средой генами, и продуктов их экспрессии.

Образовавшиеся ослабленные изоляты можно культивировать в монослоях тканевых культур, но предпочтительно их культивируют в суспензионных культурах. В качестве других методов ослабления можно применять химическое ослабление с использованием, например, N-метилнитрозогуанидина, или другие методы, известные в данной области. Как с помощью многократных пересевов, так и с помощью химических средств получают ослабленную L.intracellularis и осуществляют селекцию для получения вакцины. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полученный ослабленный изолят представляет собой изолят с регистрационным номером АТСС РТА-4926.

Антиген, используемый для приготовления вакцины, можно собирать путем центрифугирования или микрофильтрации, как описано выше. Затем антиген стандартизуют до определенного уровня на основе оптимального иммунного ответа животного-хозяина, что определяют титрованием доз для различных видов животных-хозяев. Бактерии можно инактивировать методами, известными в данной области, например, путем использования 0,3%-ного формалина или других инактивирующих агентов для получения убитой вакцины. Затем антиген вносят в пригодный адъювант, такой как гидроксид алюминия или минеральное масло, для усиления иммунного ответа. После этого антиген применяют для вакцинации хозяина (в случае свиней опыты проводят на особях возрастом 3-4 недели) путем внутримышечного или подкожного заражения, используя при необходимости бустер-дозу.

Предпочтительно осуществляют серийные пересевы бактерий для индукции и селекции ослабленной авирулентной живой культуры. Культуру тестируют на животном-хозяине для выявления признаков ослабления. Культуру собирают согласно описанному выше методу и лиофилизируют. Свиней, например, подвергают вакцинации оральным путем с использованием 1×10⁴ - 1×10⁶ бактерий. Примерно через 28 дней после вакцинации свиней инокулируют оральным путем, используя примерно 1×10⁷ организмов, полученных после небольшого количества пересевов (менее 30 пересевов in vitro после первоначального выделения из кишечного гомогената) вирулентной культуры L.intracellularis. Инфицированных животных подвергают аутопсии через 21 день после контрольного заражения и производят обследование тонкого кишечника с целью выявления как макроскопических повреждений, так и микроскопических повреждений. Следует проводить также ПЦР, исследование методом непрямой иммунофлуоресценции (IFA) или иммуногистохимическим методом (ИГХ). Примерно 80% контрольных животных должны иметь значительные или микроскопические повреждения и давать положительную реакцию в тесте на присутствие L.intracellularis в клетках слизистой оболочки кишечника при использовании любого из методов тестирования, ПЦР, IFA или ИГХ. Вакцинированные животные должны иметь здоровые поверхности слизистой оболочки по данным гистологических исследований и давать отрицательную реакцию в тесте с использованием ПЦР через 3-4 недели после инокуляции.

Как правило, ослабленный иммуногенный изолят L.intracellularis получают после непрерывного культивирования в течение периода времени от примерно 150 до примерно 250 дней, в течение этого периода времени культуру пересевают примерно 50-100 раз. Однако специалисту в данной области известно, что путем варьирования этих параметров можно получать другие ослабленные культуры.

Продукт в виде вакцины, предлагаемой в изобретении, можно лиофилизировать. После сбора изолят можно концентрировать различными методами, известными в данной области, и можно смешивать со стабилизатором, например с сахарозо-желатиновым стабилизатором. Затем продукт в виде вакцины можно подвергать замораживанию и сушке (лиофилизация). Как правило, стадия замораживания заключается в ступенчатом понижении температуры до примерно -45°С±3°С и выдерживании при этой температуре в течение периода времени от примерно 150 до примерно 480 мин. Стадия сушки может включать основную и вторичную стадии сушки. Например, основная стадия сушки может заключаться в том, что: (а) ступенчато понижают температуру до уровня, составляющего от примерно -30 до примерно -5°С, и выдерживают при этой температуре в течение периода времени от примерно 120 до примерно 1000 мин, и необязательно (б) ступенчато понижают температуру до уровня, составляющего от примерно -5 до примерно 5°С, и выдерживают при этой температуре в течение периода времени от примерно 150 до примерно 2000 мин. Вторая стадия, как правило, заключается в том, что ступенчато изменяют температуру до примерно 27°С±5°С и выдерживают при этой температуре в течение периода времени, составляющего от примерно 330 до примерно 1120 мин. Специалисту в данной области известно, что указанные диапазоны можно регулировать в зависимости от условий, например от исходного объема.

После этого получают вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество ослабленной L.intracellularis в фармацевтически приемлемом носителе. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина содержит изолят с регистрационным номером АТСС РТА-4926 в фармацевтически приемлемом носителе. Объединенные иммуноген и носитель могут находиться в виде водного раствора, эмульсии или суспензии. Иммунологически эффективное количество определяют методами, известными в данной области, без дополнительных экспериментов, руководствуясь указаниями, приведенными в настоящем описании. Как правило, при использовании очищенных бактерий количество иммуногена составляет от 5 до 5000 мкг и от 10^2,0 до 10^9,0 TCID₅₀, предпочтительно от 10^3,0 до 10^6,0 TCID₅₀, более предпочтительно от 10^4,0 до 10^5,0 TCID₅₀.

Под объем настоящего изобретения подпадают также комбинированные вакцины, содержащие ослабленный изолят L.intracellularis с регистрационным номером АТСС РТА-4926 и антигенный материал по меньшей мере из одного другого патогена, включая (но, не ограничиваясь ими): Salmonella spp. (например Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium), Erysipelothrix spp. (например Erysipelothrix rhusiopathiae), Haemophilus spp. (например, Haemophilus parasuis), Mycoplasma spp. (например, Mycoplasma hyopneumonid), Leptospira spp., Clostridium spp. (например, Clostridium perfingens, Clostridium difficile), Streptococcus spp. (например, Streptococcus suis), Brachyspira spp. (например, Brachyspira hyodysenteriae), Bordetella (например, Bordetella bronchiseptica), Pasteurella spp. (например, Pasteurella multocida), цирковирус (например, цирковирус типа 2 свиней), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), вирус гриппа свиней (SIV), короновирус (например, передаваемый желудочно-кишечным путем (TGE) вирус, респираторный коронавирус свиней), парвовирус или Escherichia coli; и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из вариантов осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.Intracellularis, регистрационный номер РТА-4926, и антигенный материал из Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix spp., Clostridium spp, Brachyspira spp., передаваемого желудочно-кишечным путем (TGE) вируса и Escherichia coli; и фармацевтически приемлемый носитель. Антигенный материал из Clostridium spp. может включать (но, не ограничиваясь им) антигенный материал из Clostridium perfingens и Clostridium difficil. Антигенный материал из Erysipelothrix spp. может включать (но, не ограничиваясь им) антигенный материал из Erysipelothrix rhusiopathiae.

В другом варианте осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.intracellularis, ATCC, регистрационный номер АТСС РТА-4926, и антигенный материал из Salmonella choleraesuis и Erysipelothrix spp.; и фармацевтически приемлемый носитель. Еще в одном варианте осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.intracellularis isolate, регистрационный номер АТСС РТА-4926, и антигенный материал из Salmonella choleraesuis и Erysipelothrix rhusiopathiae; и фармацевтически приемлемый носитель.

В следующем варианте осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.intracellularis, регистрационный номер АТСС РТА-4926, антигенный материал по меньшей мере из одного другого патогена, включая (но, не ограничиваясь ими) Clostridium spp. (например, Clostridium tetani), вирус гриппа лошадей (EIV) (например, EIV-1, EIV-2), вирус герпеса лошадей (EHV) (например, EHV-1, EHV-2, EHV-3, EHV-4, EHV-5, EHV-6, EHV-7), альфавирус (например, вирус восточного энцефалита, вирус западного энцефалита, вирус венесуэльского энцефалита) или вирус Западного Нила, и фармацевтически приемлемый носитель.

Вакцины, предлагаемые в изобретении, как правило, вводят чувствительным животным, предпочтительно свинье, в виде одной или нескольких доз. Живую или убитую вакцину можно вводить 1 или 2 раза с 2-недельными интервалами. Ослабленную живую вакцину предпочтительно вводят в виде одной дозы. Предпочтительными путями введения ослабленных живых изолятов являются внутримышечный, оральный или интраназальный пути введения, а для убитой вакцины наиболее предпочтительным является введение путем внутримышечной или подкожной инъекции.

Препятствием для эффективной диагностики РРЕ является время, необходимое для культивирования вызывающих заболевание бактерий. В результате создания настоящего изобретения в настоящее время имеется возможность разработки диагностических средств, обеспечивающих быстрый и точный анализ присутствия L.intracellularis в биологических образцах, взятых из организма свиньи и других животных, чувствительных к РРЕ.

Бактерии L.intracellularis европейского происхождения, предлагаемые в настоящем изобретении, или компоненты, полученные из этих бактерий, можно применять в качестве антигена в ELISA или другом иммуноанализе, таком как метод непрямой иммунофлуоресценции ("IFA"), для обнаружения антител к L.intracellularis в сыворотке или другой общей воде организма животных, в отношении которых имеется предположение, что они заражены бактериями. В настоящее время предпочтительным иммуноанализом является IFA, описанный ниже в примере. В альтернативном варианте бактерии, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в анализе методом Вестерн-блоттинга.

Предпочтительным протоколом ELISA, предлагаемым в изобретении, является следующий протокол:

1. Добавляют антиген в количестве 0,1 мл/лунку, разведенный в буфере для сенсибилизации. Инкубируют в течение 18 ч при 4°С.

2. Промывают 3 раза ЗФР.

3. В каждую лунку планшета добавляют 0,25 мл блокирующего буфера. Инкубируют в течение 1-2 ч при 37°С.

4. Промывают 3 раза буфером для отмывки.

5. Разбавляют сыворотку блокирующим буфером и добавляют 0,1 мл в первые лунки планшета. Осуществляют серийные разведения в соотношении 1:2 в следующих лунках планшета. Инкубируют в течение 1 ч при 37°С.

6. Промывают 3-5 раз буфером для отмывки.

7. Разбавляют конъюгат блокирующим буфером и добавляют по 0,1 мл в лунки планшета и инкубируют в течение 1 ч при 37°С.

8. Промывают 3-5 раз буфером для отмывки.

9. Добавляют субстрат.

10. Измеряют абсорбцию света с помощью спектрофотометра.

11. Лунки, в которые не добавляли антиген, используют в качестве контролей.

12. В каждом тесте следует использовать также свиную сыворотку в качестве положительного и отрицательного контроля.

Предпочтительным протоколом Вестерн-блоттинга является следующий протокол:

1. Осуществляют электрофорез с использованием 12% ДСН-ПААГ и переносят на нитроцеллюлозную мембрану.

2. Помещают мембрану в блокирующий буфер на 2 ч.

3. Удаляют блокирующий буфер и промывают ЗФР в течение 1 мин.

4. Разбавляют сыворотку блокирующим буфером и наносят на мембрану. Инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре.

5. Промывают 3 раза буфером для отмывки (5 мин для каждой отмывки).

6. Разбавляют конъюгат блокирующим буфером и наносят на мембрану. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.

7. Промывают 3 раза буфером для отмывки.

8. Добавляют субстрат на 10 мин или до тех пор, пока не возникает выраженный бэндинг.

9. Промывают ЗФР.

10. Сушат на воздухе и помещают на хранение в темноту.

Бактерии L.intracellularis европейского происхождения, предлагаемые в настоящем изобретении, или компоненты, полученные из таких бактерий, можно использовать также для изготовления антисыворотки или антител для диагностического, профилактического или терапевтического применения. Бактерии L.intracellularis европейского происхождения, предлагаемые в настоящем изобретении, или компоненты, полученные из таких бактерий, можно вводить животным кроме человека в количестве, эффективном для вызывания иммунного ответа, и антисыворотку или плазму, содержащую антитела к бактериям L.intracellularis, или компонентам, полученным из таких бактерий, можно собирать согласно методам, известным в данной области и представленным в настоящем описании.

Ниже изобретение более подробно проиллюстрировано на примерах, которые представлены только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения. В частности, специалисту в данной области должны быть очевидны другие варианты осуществления изобретения.

Все цитированные в настоящем описании публикации и патенты включены в описание в качестве ссылки во всей их полноте.

Пример 1

Получение вакцины L.intracellularis

Выделение L.intracellularis из кишечников европейских свиней, страдающих пролиферативной энтеропатией свиней (ПЭС), и ослабление указанной бактерии:

Вирулентный изолят Z.intracellularis DK 15540 (обозначения DK 15540, DK-15540 и 15540 используются в настоящем описании взаимозаменяемо) был выделен в Миннесотском университете из гомогената подвздошной кишки датской свиньи, зараженной острой геморрагической энтеропатией свиней. Этот изолят был помещен в соответствии с Будапештским договором в Американскую коллекцию типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, 9 января 2003 г. под регистрационным номером РТА-4927. Процесс выделения включал соскабливание слизистой оболочки с подвздошной кишки, гомогенизацию, обработку трипсином в течение 30 мин и обработку с помощью гомогенизатора ткани. Затем гомогенат подвздошной кишки пропускали через ряд фильтров с размерами отверстий 5,0, 1,0 и 0,65 мкм. Гомогенат разбавляли сахарозо-фосфат-глутаматным буфером, дополненным 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Отбирали аликвоты (6×1 мл) гомогената и помещали на хранение при температуре ниже -70°С. Гомогенат использовали в качестве инокулята для заражения клеток линии МсСоу в колбах Т-75 см². Ежедневно осуществляли мониторинг культур в отношении заражения клеток линии МсСоу, для чего соскабливали монослои клеток линии МсСоу, проводили лизис клеток с помощью обработки хлоридом калия, помещали концентрированный клеточный дебрис на предметные стекла микроскопа и осуществляли окрашивание методом IFA с использованием моноклональных антител, специфических для L.intracellularis. После 11 пересевов на закрепленные клеточные культуры инокулят, полученный после 11-го пересева, переносили во вращающуюся колбу вместимостью 250 мл, которая содержала клетки линии МсСоу, и выращивали в суспензии до осуществления сбора. Датский изолят L.intracellularis (регистрационный номер АТСС РТА-4927) ослабляли путем непрерывного пересева in vitro в клетки линии МсСоу в течение 80 недель и тестировали с целью идентификации с помощью моноклональных антител. Ослабленный изолят был обозначен В3903 (обозначения В3903, В 3903 и В-3903 в настоящем описании используются взаимозаменяемо). Изолят В3903 был помещен в соответствии с Будапештским договором в Американскую коллекцию типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния 20110-2209, 9 января 2003 г. под регистрационным номером АТСС РТА-4926.

Культуры:

Идентификация

Для идентификации основных (мастер-) и рабочих посевных материалов L.intracellularis использовали требования к особенностям роста, ПЦР-реакции и реакции с использованием моноклонального антитела.

Чистота

Чистоту основного посевного материала и рабочего посевного материала L.intracellularis определяли путем исследования культур с помощью окраски моноклональными антителами, обычных тестов с использованием других агентов на присутствие бактерий и вирусов и с помощью тестов на стерильность микоплазмы.

Вирулентность

Основные посевные материалы L.intracellularis были невирулентными, о чем свидетельствовало отсутствие способности основного посевного материала и инокулята для обратного пересева вызывать клинические симптомы и макроскопические повреждения, которые наблюдались у чувствительной свиньи после заражения вирулентной L.intracellularis, что дополнительно проиллюстрировано в примере 2, ниже.

Количество пересевов

Конечный собранный материал при продуцировании L.intracellularis получали в результате не более чем 11 пересевов основного посевного материала.

Состав среды

Основную (мастер-) линию клеток (MCS) EU МсСоу выращивали и поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с добавлением усиленной среды Хэма F12 (DMEM/F12) и 1-10 об.% сыворотки новорожденных телят (НТС) или фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (питательная и поддерживающая среды).

Основной и рабочий посевной материалы хранили в среде DMEM/F12 с добавлением 1-10 об.% НТС или ФБС и 5-15 об.% глицерина (основная и рабочая среды для хранения посевного материала).

Конечный собранный продукт хранили в сахарозо-желатиновом стабилизаторе (СЖС) (среды для хранения конечного продукта).

Размножение

Основную и рабочую культуры посевного материала L.intracellularis размножали в MCS EU МсСоу с использованием описанных выше питательной и поддерживающей сред для клеток и хранили при температуре ниже примерно -35°С.

Источник ткани

Посевной материал L.intracellularis и продуцирующие организмы выращивали в основной линии клеток МсСоу (регистрационный номер АТСС CRL 1696, номер партии F-10422). Линию основных клеток после 10-го пересева (пересев X) обозначили как 3894MMCSS. Линию основных клеток пересевали еще 6 раз и обозначили как MCS EU МсСоу Х+0. Клетки MCS EU МсСоу, пересев Х+0, хранили при температуре

-70°С±5°С или при более низкой температуре. Получение вакцины осуществляли в полученной пассированием линии клеток MCS EU МсСоу при 40-м пересеве.

Контейнеры для культуры

MCS EU МсСоу размножали в колбах для культур ткани, имеющих площадь поверхности 25-150 см², в клеточных ячейках типа Costar, в роллер-флаконах, имеющих площадь 850-22250 см², во вращающихся колбах вместимостью вплоть до 40 л и в биореакторах емкостью 3-500 л.

Культуры L.intracellularis, предназначенные для применения в качестве посевного материала, выращивали во вращающихся колбах вместимостью 250-40000 мл, роллер-флаконах, имеющих площадь 850-2250 см², колбах для культур ткани, имеющих площадь поверхности 25-150 см², или в биореакторах вместимостью 3-500 л.

Культуры L.intracellularis, предназначенные для получения продукта, выращивали во вращающихся колбах вместимостью 6-40 л или в биореакторах вместимостью 3-500 л.

Методы получения суспензий для посева или инокуляции

Культуры для посева

Замороженные или свежие основные или размноженные рабочие посевные материалы L.intracellularis подвергали оттаиванию при комнатной температуре (25±3°С) или при 37±2°С. Биореакторы, вращающиеся колбы или флаконы, предварительно засеянные клетками линии МсСоу с плотностью клеток 50000-500000 клеток/мл, заражали L.intracellularis в концентрации 1-10 об.% или с множественностью заражения (MOI), составляющей 0,08-1,0. Зараженную культуру инкубировали при пониженных концентрациях кислорода путем введения в пространство над культурой газовой смеси, содержащей 86% N₂, 4% Н₂ и 10% СО₂. Культуру инкубировали в течение 3-10 дней при 37±2°С, рН 6,7-7,3 при непрерывном перемешивании (10-100 об/мин) для поддерживания перемешивания, необходимого для сохранения клеток в суспензии.

Культуры для получения продукта

Замороженные или свежие основные или размноженные рабочие посевные материалы L.intracellularis подвергали оттаиванию при комнатной температуре (25±3°С) или при 37±2°С. Биореакторы или вращающиеся колбы (вместимостью 3-500 л), предварительно засеянные (за 0-7 дней до заражения) клетками линии МсСоу с плотностью клеток 50000-500000 клеток/мл, заражали L.intracellularis в концентрации 1-10 об.% или с MOI, составляющей 0,08-1,0. Зараженную культуру инкубировали при пониженных концентрациях кислорода путем введения в пространство над культурой газовой смеси, содержащей 96% N₂, 4% Н₂, или путем барботирования указанной смесью. Культуру инкубировали в течение 3-8 дней при 37±2°С, рН 6,7-7,3 при непрерывном перемешивании (10-100 об/мин) для поддерживания перемешивания, необходимого для сохранения клеток в суспензии.

Методы инокуляции культур посевного материала и культур для получения продукта

Осуществляли инокуляцию вплоть до 10 об.% основного или рабочего посевного материала (MOI=0,08-1,0) в питательную среду, находящуюся в биореакторах, вращающихся колбах или флаконах, которую засевали за 0-7 дней до инокуляции клетками линии МсСоу.

Культуры для получения продукта

Осуществляли инокуляцию вплоть до 10 об.% посевного материала для получения продукта (MOI=0,08-1,0) в соответствующий объем питательной среды, находящейся в сосудах емкостью 3-500 л, которую засевали за 0-7 дней до инокуляции клетками линии МсСоу с соответствующей плотностью клеток линии МсСоу.

Инкубация микроорганизмов

Культуры инкубировали при 37±2°С в течение 3-10 дней в атмосфере с пониженным содержанием кислорода при перемешивании для поддержания суспензии. Для продолжения процесса роста можно добавлять дополнительное количество среды и/или клеток линии МсСоу.

В течение инкубационного периода осуществляли макроскопическую оценку культур с целью выявления аномального роста или признаков загрязнения.

Сбор:

Обработка и получение культур

Культуры оценивали в отношении признаков адекватного бактериального роста с помощью окрашивания с по методу непрямой иммунофлуоресценции (IFA). Готовые к сбору культуры характеризовались клеточной инфицированностью, составляющей 60-100%. Процент инфицированности определяли путем изучения по меньшей мере трех полей, каждое поле содержало количество клеток линии МсСоу, достаточное для заполнения по меньшей мере 80% площади. Культура считалась зараженной, если примерно 50% клеток содержали бактерии.

Активность собранной культуры тестировали путем титрования образца клеток линии МсСоу, которые фиксировали и окрашивали с использованием специфического моноклонального антитела (моноклонального антитела к L.intracellularis VPM 53 партия 31599 или его эквивалента); конъюгата антимышиный IgG-флуоресцеин (ФИТЦ) (ICN No. 55499) после 6 дней инкубации при 37±2°С.

Производили визуальную оценку культур для выявления любых заметных признаков загрязнения. Сбор осуществляли через 3-10 дней после инокуляции.

Методы сбора и спецификации

Клетки и жидкое содержимое биореактора, вращающихся колб и флаконов, в которых находилась культура для получения продукта, частично или полностью собирали в стерильный сосуд для сбора. Сбор из каждого биореактора, вращающейся колбы и флакона, в которых находилась культура для получения продукта, осуществляли индивидуально или объединяли содержимое нескольких сосудов, добавляли СЖС и помещали на хранение при 1-7°С или при более низкой температуре. Из собранной культуры для получения продукта брали образец для оценки активности на основе TCID₅₀ и идентификации с помощью окрашивания методом IFA.

Культуры для получения продукта характеризовались значением TCID₅₀/мл, составляющим по меньшей мере 4,9, при окрашивании методом IFA и не имели никаких признаков загрязнения по данным микроскопического исследования.

Получение продукта в виде вакцины

Методы концентрирования

Продукт в виде вакцины можно концентрировать различными методами, например, давая культуре осадиться и осуществляя затем декантацию супернатанта, путем фильтрации через мембрану (с размером пор 0,22 мкм или менее), перфузии или центрифугирования.

Сахарозо-желатиновый стабилизатор (СЖС)

Гидролизованный раствор желатина получали путем смешения желатина с деионизированной водой или водой для инъекций до объема, составляющего примерно 25% конечного объема партии СЖС, и гидролизовали в автоклаве в течение 120 мин при 121°С.

Затем гидролизованный раствор желатина (40,0 г/л) смешивали с деионизированной водой или водой для инъекций до объема, составляющего примерно 75% конечного объема партии СЖС. Добавляли гидроксид калия аналитической чистоты (AR) (0,548 г/л), L-глутаминовую кислоту (1,440 г/л), вторичный кислый фосфат калия (AR) (2,508 г/л), первичный кислый фосфат калия (AR) (1,030 г/л) и сахарозу (AR) (150,00 г/л) и раствор тщательно перемешивали. Затем значение рН стабилизатора доводили до 6,8-7,0 с помощью растворов соляной кислоты или гидроксида натрия. Добавляли деионизированную воду или воду для инъекций для доведения объема до 100% требуемого конечного объема СЖС. Полный стабилизатор тщательно перемешивали и весь раствор стерилизовали фильтрацией через фильтр с размером отверстий 0,1 мкм.

Пример состава компонентов для приготовления партии приведен в таблице 1.

Таблица 1 L.intracellularis 200000-300000 мл Сахарозо-желатиновый стабилизатор (СЖС) 100000 мл (25 об.%) DMEM/F12 (можно добавлять для стандартизации продукта) 0-150000 мл Общий объем 400000 мл Объем средней партии составлял 50-500 л

Лиофилизация

Продукт в виде вакцины лиофилизировали согласно процедуре, приведенной в таблице 2 для цикла изготовления 10 доз (объем каждой 6,0 мл) или в таблице 3 для цикла изготовления 50/100 доз (объем каждой 10,0 мл).

Таблица 2 Стадии °С Скорость (мин) Выдержка (мин) Давление (мТорр) Предварительное охлаждение* 5° NA NA Атм. Замораживание -47°±3° Как можно быстрее 150 Атм. 1-я стадия сушки, 1-й этап -15°±2° 120 120 100-150 1-я стадия сушки, 2-й этап 0°±2° 120 180 100-150 2-я стадия сушки, 1-й этап 32°±2° 240 180 60-80 2-я стадия сушки, 2-й этап 26°±2° 240 Как можно быстрее 60-80 Общее время: 1352 мин (22,5 ч) * Полки предварительно охлаждали до 5°±2°С при загрузке лиофилизатора. NA - не требуется задавать

Таблица 3 Стадии °С Продолжительность (мин) Выдержка (мин) Давление (мТорр) Предварительное охлаждение* 5° NA NA Атм. Замораживание -48°±3° 60 90 Атм. 1-я стадия сушки -15°±2° 60 1500 100-150 2-я стадия сушки 26°±2° 60 600 60-80 Общее время: 2370 мин (39,5 ч) * Полки предварительно охлаждали до 5°±2°С при загрузке лиофилизатора. NA - не требуется задавать

Пример 2

Безопасность вакцины L.intracellularis

Цель:

Настоящее исследование преследовало две цели. Первая цель настоящего исследования заключалась в оценке и сравнении случаев заболевания, вызываемых тремя различными изолятами L.intracellularis, полученными после небольшого количества пересевов (два были выявлены в США и один имел европейское происхождение) у свиней 6,5-недельного возраста. Второй целью была оценка безопасности двух изолятов L.intracellularis, полученных после большого количества пересевов (оба имели европейское происхождение), на свиньях 6,5-недельного возраста.

Материалы и методы:

Тестируемые субстанции

1. L.intracellularis, U.S.-изолят (изолят, выявленный в США) N343, полученный после небольшого количества пересевов;

2. L.intracellularis, U.S.-изолят N 101494, полученный после небольшого количества пересевов N 101494;

3. L.intracellularis, EU-изолят (изолят европейского происхождения) DK 15540 р20, полученный после небольшого количества пересевов;

4. L.intracellularis, EU-изолят DK 15540 р60, полученный после большого количества пересевов;

5. L.intracellularis, EU-изолят DK 15540 р80 (основной посевной материал, обозначенный В3903).

Приготовление тестируемых субстанций

Изоляты, полученные после небольшого количества пересевов, выращивали непрерывно в течение 10-20 недель после выделения в суспензии клеток линии МсСоу. Изоляты, полученные после большого количества пересевов, выращивали непрерывно в течение 60-80 недель после выделения в суспензии клеток линии МсСоу. Все культуры собирали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Дебрис культуры клеток линии МсСоу, содержащих Lawsonia, ресуспендировали в сахарозо-фосфат-глутаминовом (СФГ) растворе, дополненном 10% ФБС.

Хранение тестируемых субстанций

Собранные культуры хранили при -70°С до дня осуществления контрольного заражения. Используемые для контрольного заражения культуры одного и того же изолята, но собранные в различные дни, подвергали оттаиванию и объединяли в пластиковых флаконах для вакцины, снабжали ярлыком и помещали на хранение при 4°С или на льду до дня осуществления контрольного заражения.

Анализ тестируемых субстанций

Значение TCID₅₀ определяли для всех объединенных изолятов, используемых для контрольного заражения, в момент осуществления контрольного заражения (день 0). Средние титры (n=3) (TCID₅₀/мл) приведены ниже в таблице 4:

Таблица 4 Тестируемая субстанция Средний титр (TCID₅₀/мл) L.intracellularis N 343 6,4 L.intracellularis N 101494 6,1 L.intracellularis DK 15540 p20 6,2 L.intracellularis DK 15540 p60 6,87 L.intracellularis DK 15540 p80 7,4

План исследования

Исследование проводили на пяти экспериментальных группах и одной контрольной группе. В день 0 исследования группе 1 (10 свиней 6,5-недельного возраста) вводили одну дозу 10 мл или эквивалентную внутрижелудочную (ВЖ) дозу US-изолята N 343 L.intracellularis, полученного после небольшого количества пересевов. Группе 2 (10 свиней 6,5-недельного возраста) вводили одну дозу 10 мл или эквивалентную ВЖ-дозу US-изолята N 101494 L.intracellularis, полученного после небольшого количества пересевов. Группе 3 (10 свиней 6,5-недельного возраста) вводили одну дозу 10 мл или эквивалентную ВЖ-дозу EU-изолята DK 15540 р20 L.intracellularis, полученного после небольшого количества пересевов. Группе 4 (10 свиней 6,5-недельного возраста) вводили одну дозу 10 мл или эквивалентную ВЖ-дозу EU изолята DK 15540 р60 (60 недель) L.intracellularis, полученного после большого количества пересевов. Группе 5 (20 свиней 6-недельного возраста) вводили одну дозу 10 мл или эквивалентную дозу EU-изолята DK 15540 р80 L.intracellularis, полученного после большого количества пересевов. Группу 6 (10 свиней 6,5-недельного возраста), обозначенную как "строгие контроли", не подвергали обработке.

С момента начала исследования и до дня контрольного заражения соответствующих подопытных животных ежедневно осуществляли наблюдение за состоянием здоровья. Ежедневно, начиная со дня контрольного заражения (день 0) и до окончания исследования (день 21), оценивали в баллах (балльная шкала от 1 до 4) клиническое состояние здоровья (поведение, аппетит, состояние тела, волосяной покров и консистенцию стула). Рассчитывали средний суточный прирост веса (ССПВ), начиная со дня контрольного заражения (день 0) и до окончания исследования (день 21). Выделение L.intracellularis с фекалиями оценивали в дни 0, 7, 14 и 21. Одно животное (из группы 1), которое погибло в процессе исследования, было обследовано в отношении макроскопических и микроскопических повреждений. Было установлено, что смерть наступила в результате повреждений, связанных с ПЭС, что было подтверждено гистологическим и ПЦР-анализом, погибшее животное не заменяли. Качественный анализ присутствия Lawsonia в фекалиях проводили с помощью ПЦР наряду с гистологической оценкой присутствия L.intracellularis в подвздошной кишке и ободочной кишке. Образцы сыворотки брали в дни 0, 7, 14 и 21 исследования.

Результаты

Обобщение результатов исследования

Общие наблюдения

До осуществления контрольного заражения проводили ежедневные обследования состояния здоровья. Клиническое состояние животных оценивали ежедневно после контрольного заражения в течение периода исследования. Показатели включали: поведение, аппетит, состояние тела, волосяной покров и консистенцию стула. Клиническое состояние этих животных оценивали на основе численной балльной системы, отражающей серьезность заболевания. Диапазон баллов для каждого параметра составлял от 1 до 4. Балл 1 давали животному с нормальным здоровым внешним видом, балл 3 давали животному, имеющему серьезные клинические симптомы, а балл 4 - погибшему животному. Средний ежедневный балл для строгих контролей, DK 15540 р60 и DK 15540 р80, составлял 5,0. Средние ежедневные баллы для групп, обработанных материалами, полученными после небольшого количества пересевов, составляли: 5,23 для N 343, 5,15 для N 101494 и 5,01 для DK 15540 р20. Статистический анализ этих результатов с использованием критерия ранговой суммы Крускала-Уоллиса не выявил различий между группами обработки и контрольными группами.

Средние суточные приросты веса (ССПВ)

Средние суточные приросты веса рассчитывали с момента контрольного заражения (день 0) и до окончания исследования (день 21). Средний суточный прирост веса в группе строгого контроля составлял 0,9 фунта. Средний суточный прирост веса в группах, обработанных материалом, полученным после небольшого количества пересевов, составлял лишь 0,6 (N 343), 0,8 (N 101494) и 0,86 (DK 15540 р20) фунта/день. В группах, обработанных материалом, полученным после большого количества пересевов, происходил такой же или больший суточный прирост веса, что и в группе строгого контроля, которую не подвергали контрольному заражению, а именно 0,9 фунта/день (DK 15540 р60) и 1,05 фунта/день (DK 15540 р80) соответственно. В день 21 исследования средняя разница в среднем суточном приросте веса в группе, обработанной N 343, была значительно меньше, чем в группах обработанных материалом, полученным после большого количества пересевов (DK 15540 р60 и р80), и в группе строгого контроля (р<0,05 по критерию χ² Пирсона).

Сероконверсия

Сероконверсию у свиней в ответ на обработку Lawsonia измеряли путем выявления с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции (IFAT=IFA) присутствия антител к Lawsonia. В день 0 только в группе, обработанной N 343, была выявлена обнаруживаемая сероконверсия у 2/10 свиней. В день 7 в группе, обработанной N343, было выявлено с помощью IFA 2/9 свиней и в группе, обработанной DK 15540 р20, 1/10 свиней, позитивных в отношении антител к Lawsonia. В день по данным IFA 14 2/9 свиней были позитивными в группе, обработанной N 343, и 1/10 в группах, обработанных DK 15540 р20 и р60 соответственно. В день 21 по данным IFA были позитивными 1/10 свиней (N 343), 4/10 свиней (N 101494) и 6/10 свиней (DK 15540 р20), в то время как в группах, обработанных материалом, полученным после большого количества пересевов (DK 15540 р60 и р80), не было выявлено обнаруживаемой сероконверсии. Сероконверсия в ответ на обработку Lawsonia возрастала в день 21 в группах, обработанных материалом, содержащим как US-, так и EU-изоляты L.intracellularis, который получали после небольшого количества пересевов.

Выделение с фекалиями

ПЦР-анализ фекалий показал, что выделение L.intracellularis, начиная со дня 14, происходило у 4/9 животных, обработанных N 343, у 4/10 животных, обработанных N 101494, и у 5/10 животных, обработанных DK 15540 р20, полученными после небольшого количества пересевов. Группы, обработанные материалом, полученным после большого количества пересевов, и группа строгого контроля давали отрицательную реакцию по данным ПЦР в день 14. В день 21 в группе, обработанной DK 15540 р20, 1 животное дало положительную реакцию по данным ПЦР, в то время как все другие группы обработки и контрольная группы давали отрицательную реакцию по данным ПЦР. В течение всего исследования по данным ПЦР не было обнаружено свидетельств выделения в группах, обработанных изолятом, полученным после большого количества пересевов (DK 15540 р60 и р80). Количество ПЦР-позитивных животных, у которых выявлено активное выделение Lawsonia в фекалиях, в день 14 исследования было более значительным в группах, обработанных изолятами, полученными после небольшого количества пересевов (N 343, N 101494 и DK 15540 р20), чем в группах, обработанных изолятами, полученными после большого количества пересевов, и в группах строгого контроля (р<0,05 по критерию χ² Пирсона).

ПЦР в день 21: Подвздошная кишка и ободочная кишка

После аутопсии (день 21) проводили анализ с помощью ПЦР соскобов слизистой оболочки подвздошной кишки и ободочной кишки. Количества образцов, которые по данным ПЦР были заселены L.Intracellularis, давших положительную реакцию, составляли: 2/10 для ободочной кишки в группе, обработанной изолятом N 101494, и 2/10 для подвздошной кишки и 4/10 для ободочной кишки в группе, обработанной изолятом DK 15540 р20, полученным после небольшого количества пересевов. Ткани животных во всех остальных группах обработки и контрольных группах в день 21 исследования оказались ПЦР-негативными (давали отрицательную реакцию по данным анализа тканей с помощью ПЦР). Результаты свидетельствуют о том, что подвздошная кишка и ободочная кишка свиней, обработанных DK 15540 р20, были статистически достоверно заселены L.intracellularis в большей степени, чем все другие обработанные группы и контрольные группы (р<0,05 по критерию χ² Пирсона).

Гистология

При осуществлении аутопсии (день 21) брали срезы концевых отделов подвздошной кишки и ободочной кишки и помещали в забуференный формалин для проведения гистологического анализа. Присутствие внутриклеточных бактерий и гиперплазия крипт в тканях, окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е) и серебряными реагентами Вартина-Старри (Warthin-Starry), было выявлено у 4/9 свиней, обработанных N 343, 3/10 свиней, обработанных N 101494, 2/10 свиней, обработанных DK 15540 р60, и у 1/20 свиней, обработанных DK 15540 р80. Образование повреждений подтверждали с помощью окрашивания флуоресцентным антителом (FA) с использованием моноклональных антител к Lawsonia intracellularis, оно было выявлено у 1/9 свиней, обработанных N 343, у 3/10 свиней, обработанных N 101494, и у 1/10 свиней, обработанных DK 15540 р60. FA-окрашивание не выявило повреждений, вызванных Lawsonia, в ободочной кишке животных во всех группах обработки и контрольных группах. Результаты, полученные с помощью FA-окрашивания, свидетельствуют об образовании макроскопических повреждений в подвздошной кишке свиней в группе, обработанной N 101494, по сравнению со всеми другими группами обработки и контрольными группами. Окрашивание Н&Е/серебром позволило выявить образование значительных повреждений, связанных с ПЭС в группе, обработанной N 343, по сравнению со всеми другими группами обработки и контрольными группами (р<0,05 по критерию χ² Пирсона).

Балльная оценка макроскопических повреждений

При проведении аутопсии (день 21) производили балльную оценку повреждений подвздошной кишки и ободочной кишки, связанных с ПЭС. Ткани, имеющие нормальный внешний вид (отсутствие повреждений), оценивали баллом 1, балл 2 соответствовал повреждениям, характеризующимся слабым утолщением, балл 3 - повреждениям, характеризующимся утолщением средней степени, и балл 4 - повреждениям, характеризующимся значительным утолщением. Средние клинические баллы составляли: для строгих контролей - 1,05, для группы, обработанной N 343, - 1,0, для группы, обработанной N 101494, - 1,2, для группы, обработанной DK 15540 р20, - 1,2 и для групп, обработанных DK 15540 р60 и р80, - 1,0. По данным дисперсионного анализа (ANOVA) для множественных сравнений между контрольными и обработанными группами не было обнаружено статистически достоверной разницы в баллах при оценке макроскопических повреждений.

Выводы

Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что у свиней, подвергнутых контрольному заражению дозой N 343, N 101494 и DK 15540, полученных с помощью небольшого количества пересевов, с TCID₅₀ более 1×10⁷ бактерий/дозу приводит к увеличению количества случаев ПЭС у этих животных. Полученные с помощью большого количества пересевов изоляты DK 15540 р60 и р80, которые вводили свиньям такого же возраста с TCID₅₀ более 1×10⁷, оказались безопасными и приводили к уменьшению распространения бактерий и образования повреждений, связанных с ПЭС. Этот вывод основан на результатах, полученных с помощью ПЦР-анализа слизистой оболочки подвздошной кишки, гистопатологии и FA-окрашивания срезов ткани.

В изолятах, полученных с помощью большого количества пересевов, обнаружено с помощью ПЦР уменьшение выделения L.intracellularis с фекалиями по сравнению с изолятами, полученными с помощью небольшого количества пересевов. Результаты расчета величин среднего суточного прироста веса для всех групп обработки и контрольных групп подтверждают этот вывод, о чем свидетельствует постоянное положительное ежедневное увеличение веса в группах, которых обрабатывали изолятом, полученным с помощью большого количества пересевов, и в группах строгого контроля, по сравнению с группами, которых обрабатывали изолятами, полученными с помощью небольшого количества пересевов, прежде всего с группой животных, которых обрабатывали N 343. Этот результат свидетельствует об уменьшении прироста веса животных, которых обрабатывали материалом, полученным с помощью небольшого количества пересевов, и он подкрепляет данные о том, что животные, которых обрабатывали материалом, полученным с помощью большого количества пересевов, имели такие же и сходные характеристики роста, что и животные, не подвергавшиеся контрольному заражению. По сравнению со строгими контролями изоляты, полученные с помощью большого количества пересевов, не оказывали отрицательного влияния на прирост веса и общее состояние здоровья, которое оценивали на основе клинических баллов.

Пример 3

Эффективность и минимальный защитный титр

Цель:

Цели настоящего исследования заключались в определении минимального защитного титра вакцины, содержащей изолят В3903 (лиофилизированный) (DK 15540, пересев 80) (понятия "вакцина В3903 (лиофилизированная)" и "вакцина В3903" в настоящем описании применяются взаимозаменяемо), которую вводили путем орального вливания свиньям 3-недельного возраста, и демонстрации ее эффективности в отношении контрольного заражения свиней вирулентной гетерологичной чистой культурой L.intracellularis, полученной с помощью небольшого количества пересевов, т.е. агентом, который вызывает пролиферативную энтеропатию свиней (РРЕ).

Материалы и методы:

Тестируемая субстанция: Ослабленная живая культура L.intracellularis, изолят В3903.

Состав вакцины В3903 (лиофилизированной)

Изоляты DK 15540 выращивали непрерывно в течение 80 недель после выделения в суспензии клеток линии МсСоу. Все культуры собирали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Дебрисы культуры клеток линии МсСоу, содержащие Lawsonia, ресуспендировали в сахарозо-фосфат-глутаминовом (СФГ) растворе, дополненном 10% ФБС. Сушку осуществляли согласно методу, описанному в примере 1, выше. Лиофилизированный продукт восстанавливали в воде для инъекций, q.s. до 2,0 мл.

Хранение вакцины В3903 (лиофилизированной)

Вакцину хранили при 2-8°С до подготовки к применению. После ресуспендирования вакцину хранили на льду до введения.

Дозы вакцины В3903 (лиофилизированной)

1. Высокая доза (группа обработки 1): 1×2 мл (6,0 log/дозу), вводимая путем непосредственного орального вливания в день 0 исследования.

2. Средняя доза (группа обработки 2): 1×2 мл (4,9 log/дозу), вводимая путем непосредственного орального вливания в день 0 исследования.

3. Низкая доза (группа обработки 3): 1×2 мл (3,8 log/дозу), вводимая путем непосредственного орального вливания в день 0 исследования.

Тестируемая субстанция: Плацебо

Плацебо, содержащий неинфицированную культуру клеток линии МсСоу, суспендированную в питательной среде DMEM/F12, усиленной 5% NBS, вводили животным из групп обработки 4 (контрольная группа, подвергнутая контрольному заражению) и 5 (отрицательный контроль) в день 0 исследования. Эту субстанцию вводили поросятам из группы обработки 4 путем непосредственного орального вливания, при этом доза составляла 1×2 мл плацебо на подопытное животное.

Тестируемая субстанция: изолят L.intracellularis N 101494 для вирулентного контрольного заражения

Изолят L.intracellularis N 101494 получали из кишечника свиньи 12-недельного возраста, выращенной на ферме шт.Индиана (US 5714375).

Получение изолята L.intracellularis N 101494 для вирулентного контрольного заражения

Материал для контрольного заражения L.intracellularis выращивали непрерывно в суспензии клеток линии МсСоу с использованием не более 30 пересевов после первого выделения из зараженной ткани кишки. В дополнение к (1 л) SF 1421 выращивали активные культуры (2×3 л), обозначенные как SF 1422 и SF 1423, в суспензии клеток линии МсСоу в течение 7 дней до 15-30%-ного заражения клеток линии МсСоу. В день контрольного заражения (день 21) активные культуры собирали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин и клеточный дебрис ресуспендировали в общем объеме 350 мл с использованием СФГ-стабилизатора. Собранные активные культуры объединяли с 300 мл замороженных 10^×-20^× концентрированных изолятов N 101494, предназначенных для контрольного заражения, которые получали с помощью различных небольших количеств пересевов (24-27 пересевов после выделения).

Хранение изолята L.intracellularis N 101494 для вирулентного контрольного заражения

Конечные композиции, готовые для контрольного заражения, хранили при 2-8°С или на льду до осуществления инокуляции.

Пре-/пост-вакцинация и титры контрольного заражения

Результаты, полученные при анализе TCID₅₀, подтвердили количество живых L.intracellularis, вводимых каждому подопытному животному в одной дозе при вакцинации и контрольном заражении. Средние титры (n=5) для вакцины В3903 и материала для контрольного заражения (изолят L.intracellularis N 101494) до и после титрований приведены в таблице 6:

Таблица 6 Группа Обработка (log/дозу) Среднее значение log/дозу (2 мл) превакцинация (TCID₅₀/мл) Среднее значение log/дозу (2 мл) поствакцинация (TCID₅₀/мл) Общее среднее значение Log/дозу 1 Вакцина В3903, высокая доза 6,07 5,89 6,0 2 Вакцина В3903, средняя доза 4,94 4,84 4,9 3 Вакцина В3903, низкая доза 3,9 3,5 3.8 4 Контроли, подвергнутые контрольному заражению 7,85 7,57 7,71

План исследования

65 здоровых незараженных L.intracellularis поросят-отъемышей 3-недельного возраста разделяли произвольным образом на 5 групп обработки и содержали раздельно в течение периода исследования. В день 0 группе обработки 1 (15 свиней) вводили путем непосредственного орального вливания дозу вакцины В3903, 2 мл (6,0 log/дозу). Группе обработки 2 (15 свиней) вводили путем непосредственного орального вливания дозу вакцины В3903, 1×2 мл, титрованной до 4,9 log/дозу. Группе обработки 3 (15 свиней) вводили путем непосредственного орального вливания дозу вакцины В3903, 1×2 мл, титрованной до 3,8 log/дозу.

Группам обработки 4 и 5 (10 свиней/группу) вводили путем непосредственного орального вливания дозу плацебо, 1×2 мл.

В день 21 исследования (через 3 недели после вакцинации) подопытным свиньям в группах обработки 1-4 вводили через желудочный зонд дозу 1×10 мл вирулентного гетерологичного изолята N 101494 чистой культуры L.intracellularis, полученного с помощью небольшого количества пересевов.

В день 42 исследования (через 3 недели после контрольного заражения) всех животных в группах обработки (1-5) подвергали эвтаназии и аутопсии для анализа макроскопических и микроскопических повреждений, вызванных ПЭС.

С момента начала исследования до дня контрольного заражения ежедневно проводили обследование состояния здоровья каждого подопытного животного. Ежедневно, начиная со дня контрольного заражения (день 21) до дня окончания исследования (день 42), производили балльную оценку клинического состояния здоровья (диарея, поведение и состояние тела). В день вакцинации (день 0), день контрольного заражения (день 21) и день окончания исследования (день 42) проводили измерение веса для расчета среднего суточного прироста веса в каждой группе обработки. Выделение L.intracellularis с фекалиями оценивали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) путем тестирования фекальных мазков (ф-ПЦР), взятых в дни исследования 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42. Всех животных, подвергнутых эвтаназии по окончании исследования (день 42), обследовали в отношении макроскопических и микроскопических повреждений. В день исследования 42 проводили качественный анализ с помощью ПЦР (т-ПЦР) содержания бактерий в тканях наряду с гистологической оценкой присутствия L.intracellularis в подвздошной кишке, ободочной кишке, миндалине и мезентериальном лимфатическом узле. Образцы сыворотки брали в дни исследования 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42. Сыворотку анализировали с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции (IFAT) для выявления антител к Lawsonia в организме подопытных животных. Сравнение групп обработки проводили на основе анализа результатов оценки среднего суточного прироста веса после вакцинации и после контрольного заражения, клинических баллов, скоростей сероконверсии (IFAT), заселения бактериями (т-ПЦР), выделения с фекалиями (ф-ПЦР), образования макроскопических повреждений и микроскопических повреждений, которые оценивали с помощью иммуногистохимического исследования (ИГХ).

Результаты:

Обобщение основных результатов

Конечные результаты исследования, полученные для каждой из групп обработки, свидетельствуют об образовании в подвздошной кишке и ободочной кишке невакцинированных контрольных свиней, подвергнутых контрольному заражению (группа 4), макроскопических и микроскопических повреждений в отличие от вакцинированных свиней (группы 1, 2 и 3) независимо от дозы (высокая, средняя и низкая) (р<0,05). Средние баллы макроскопических повреждений ободочной кишки при обработке низкой дозой вакцины не имели достоверных отличий от баллов, полученных для контролей, подвергнутых контрольному заражению. Группа, обработанная низкой дозой вакцины (группа 3), представляла собой единственную группу обработки, которой вводили вакцину и в которой происходило образование значительных повреждений (макроскопических и микроскопических) по сравнению с группой строгого контроля, которую в процессе исследования не подвергали вакцинации, введению плацебо или контрольному заражению.

Клинические баллы

Клинические баллы регистрировали для каждого животного ежедневно, начиная со дня контрольного заражения (день 21) до дня осуществления аутопсии (день 42). На основе клинических баллов рассчитывали средний ежедневный клинический балл, отражающий серьезность и продолжительность заболевания в группах обработки в результате осуществления контрольного заражения вирулентным изолятом L.intracellularis. Средние клинические баллы для каждой группы обработки обобщены в таблице 8.

Таблица 8 Группа обработки Характеристика группы Средний клинический балл 1 Обработка вакциной В3903 - высокая доза 3,1 а 2 Обработка вакциной В3903 - средняя доза 3,0 а 3 Обработка вакциной В3903 - низкая доза 3,0 а 4 Контроль, подвергнутый контрольному заражению 3,0 а 5 Строгий контроль 3,0 а * одинаковые буквы означают отсутствие достоверной разницы между средними клиническими баллами, начиная со дня контрольного заражения до дня осуществления аутопсии (р<0,05)

Статистический анализ средних клинических баллов, полученных для групп обработки, осуществляли с помощью однонаправленного дисперсионного анализа ANOVA. Не было выявлено достоверных отличий невакцинированных контролей, подвергнутых контрольному заражению, и строгих контролей от групп, обработанных высокой, средней или низкой дозой вакцины.

Средние суточные приросты веса

Средние суточные приросты веса (ССПВ) рассчитывали со дня введения вакцины (день 0) до осуществления контрольного заражения (день 21), до окончания исследования (день 42). Статистический анализ разницы в приросте веса (в фунтах) между группой, обработанной высокой дозой вакцины, и невакцинированной контрольной группой, подвергнутой контрольному заражению, выявил достоверную разницу в период времени от контрольного заражения до осуществления аутопсии (р<0,05). Данные о массе животных обобщены в таблице 9.

Таблица 9 Группа обработки Характеристика группы Средний начальный вес (фунты) ССПВ (дни 0-21) (фунты) ССПВ (дни 21-42) (фунты) Общее ССПВ (фунты) (со дня вакцинации до дня аутопсии) 1 Обработка вакциной В3903, высокая доза 17,8 а 0,94 а 1,63 а 1,29 а 2 Обработка вакциной В3903, средняя доза 17,7 а 1,00 а 1,60 ab 1,30 а 3 Обработка вакциной В3903, низкая доза 18,0 а 0,94 а 1,48 ab 1,21 а 4 Контроль, подвергнутый контрольному заражению 17,7 а 0,96 а 1,45 b 1.21 а 5 Строгий контроль 17,7 а 0,94 а 1,63 ab 1.28 а * одинаковые буквы означают отсутствие достоверной разницы между ССПВ в группах обработки, начиная со вакцинации до дня контрольного заражения и со дня контрольного заражения до дня осуществления аутопсии (р<0,05).

Сероконверсия (IFAT)

Образцы сыворотки брали еженедельно в дни исследования 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42 у всех подопытных животных в каждой группе обработки и анализировали в отношении присутствия антител в виде IgG к Lawsonia. Во всех анализах, проводимых в данном исследовании, использовали контрольные IFAT-образцы, дающие 100%-ную положительную и отрицательную реакцию. В дни 0-21 (3 недели после вакцинации) все подопытные животные в каждой группе обработки давали отрицательную реакцию по данным IFA. В день исследования 28 (1 неделя после контрольного заражения) 1/15 (6,7%) подопытных животных в группе, обработанной высокой дозой вакцины, давало положительную реакцию по данным IFA, в то время как все остальные давали отрицательную реакцию при тестировании с помощью IFA. В день исследования 35 (2 недели после контрольного заражения) 4/15 (26,7%) свиней в группах, обработанных высокой дозой и средней дозой вакцины, и 1/10 (10%) свиней в невакцинированной контрольной группе обработки, подвергнутой контрольному заражению, давали положительную реакцию по данным IFA в отношении присутствия антител к Lawsonia. В день 35 как группа, обработанная низкой дозой вакцины, так и группа строгого контроля давали отрицательную реакцию по данным IFA. В день исследования 42 (3 недели после контрольного заражения) 8/10 (80%) свиней в контрольной группе обработки, подвергнутой контрольному заражению, 6/15 (40%) свиней в группе, обработанной средней дозой вакцины, 5/15 (33,3%) свиней в группе, обработанной низкой дозой вакцины, и 3/15 (20%) свиней в группе, обработанной высокой дозой вакцины, давали положительную реакцию по данным IFA. Группа обработки, представляющая собой строгий контроль, давала отрицательную реакцию по данным IFA в день окончания исследования (день 42).

Результаты оценки сероконверсии подвергали статистическому анализу с использованием критерия χ². Для результатов, полученных для группы обработки, представляющей собой строгий контроль, статистический анализ на основе критерия χ² не проводили, поскольку в процессе исследования для каждого подопытного животного были получены 100%-ные отрицательные реакции. Для групп обработки, которым вводили вакцину или плацебо, результаты, полученные с помощью IFAT, проводили сравнение результатов с использованием статистического анализа на основе критерия χ² с определением точного значения р (метод Монте-Карло). Положительные результаты, полученные с помощью IFAT в день 42 исследования (через 3 недели после контрольного заражения) для групп, подвергнутых контрольному заражению вирулентной чистой культурой, существенно превышали результаты, полученные для групп, обработанных высокой дозой вакцины и низкой дозой вакцины (р<0,05).

Выделение L.intracellularis с фекалиями (ПЦР-анализ)

Еженедельно в дни исследования 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42 брали фекальные мазки у всех подопытных животных в каждой группе обработки и присутствие L.intracellularis анализировали с помощью ПЦР. Для каждого анализа, проводимого в данном исследовании, для экстракции ДНК и осуществления ПЦР использовали достоверные на 100% позитивные и негативные контроли. В течение периода времени от дня 0 (вакцинация) до дня 21 (контрольное заражение) фекалии всех подопытных животных при анализе с помощью ПЦР давали отрицательную реакцию в отношении присутствия L.intracellularis. На протяжении всего исследования фекалии свиней в группе строгого контроля при анализе с помощью ПЦР давали отрицательную реакцию в отношении присутствия L.intracellularis. Выделение L.intracellularis с фекалиями (положительная фекальная ПЦР) обнаруживалось в различных группах обработки каждую неделю после контрольной инокуляции. Эти результаты обобщены в таблице 10.

Таблица 10 Группа обработки Характеристика группы День 28 (через 1 неделю после контрольного заражения) День 35 (через 2 недели после контрольного заражения) День 42 (через 3 недели после контрольного заражения) 1 Обработанная вакциной В3903, высокая доза 0/15 (0%) а 2/15 (13,3%) а 0/15 (0%) а 2 Обработанная вакциной В3903, средняя доза 6/15 (40%) ab 5/15 (33,3%) а 0/15 (0%) а 3 Обработанная вакциной В3903, низкая доза 4/15 (26,7%) ab 8/15 (53,3%) ab 2/15 (13,3%) ab 4 Контроль, подвергнутый контрольному заражению 4/10 (40%) b 7/10 (70%) b 4/10 (40%) b 5 Строгий контроль 0/10 (0%) 0/10 (0%) 0/10 (0%) * одинаковые буквы означают отсутствие достоверной разницы между группами, подвергнутыми контрольному заражению (р<0,05).

Путем статистического анализа на основе критерия χ² с определением точного значения р (метод Монте-Карло) сравнивали положительные реакции в каждой группе, обработанной вакциной, с реакциями в невакцинированной контрольной группе, подвергнутой только контрольному заражению. Результаты для группы строгого контроля не учитывались при сравнении групп, поскольку в процессе всего исследования все свиньи при анализе с помощью ПЦР давали 100%-ную отрицательную реакцию в отношении присутствия L.intracellularis в фекалиях. В день 28 (через 1 неделю после контрольного заражения) у свиней, обработанных высокой дозой вакцины, было выявлено существенно меньшее выделение L.intracellularis, чем у невакцинированных свиней, подвергнутых контрольному заражению (р=0,017). В день 35 (через 2 недели после контрольного заражения) у свиней, обработанных высокой дозой (р=0,0024) и средней дозой (р=0,041) вакцины, было выявлено существенно меньшее выделение L.intracellularis с фекалиями, чем у невакцинированных свиней, подвергнутых контрольному заражению. В день 42 (окончание исследования) у свиней, обработанных высокой дозой и средней дозой (р=0,041) вакцины, также было выявлено существенно меньшее выделение L.intracellularis с фекалиями, чем у невакцинированных свиней, подвергнутых контрольному заражению. Свиньи в группе, обработанной низкой дозой, давали в любой день после контрольного заражения несколько меньшую положительную реакцию при анализе с помощью ПЦР, чем контроли, подвергнутые контрольному заражению.

Заселение ткани L.intracellularis (ПЦР-анализ)

После аутопсии (день исследования 42) проводили анализ с помощью полимеразной цепной реакции срезов ткани концевых отделов подвздошной кишки, ободочной кишки, миндалины и мезентериального лимфатического узла. В группе, обработанной высокой дозой вакцины, 1/15 (6,7%) свиней давала положительную реакцию в отношении заселения миндалин L.intracellularis при анализе с помощью ПЦР, в то время как все остальные группы обработки давали отрицательную реакцию при анализе с помощью ПЦР. Оценка с помощью ПЦР, пригодной для анализа илеита (илеит-ПЦР-анализ), мезентериальной лимфатической ткани позволила установить, что 3/10 (30%) свиней в невакцинированных контролях, подвергнутых контрольному заражению, давали положительную реакцию в отношении заселения L.intracellularis, в то время как все другие группы обработки давали отрицательную реакцию при анализе с помощью ПЦР. Илеит-ПЦР-анализ соскобов слизистой оболочки концевого отдела подвздошной кишки позволил установить, что 4/10 (40%) свиней в контролях, подвергнутых контрольному заражению, 4/15 (26,7%) свиней в группе, обработанной низкой дозой вакцины, 2/15 (13,3%) свиней в группе, обработанной средней дозой вакцины, и 1/15 (6,7%) свиней в группе, обработанной высокой дозой вакцины, давали положительную реакцию в отношении заселения L.intracellularis. Илеит-ПЦР-анализ ободочной кишки позволил установить, что 3/10 (30%) свиней в контролях, подвергнутых контрольному заражению, 5/15 (33,3%) свиней в группе, обработанной низкой дозой вакцины, 1/15 (6,7%) свиней в группе, обработанной средней дозой вакцины, и 2/15 (13,3%) свиней в группе, обработанной высокой дозой вакцины, давали положительную реакцию в отношении заселения L.intracellularis при анализе с помощью ПЦР. В группе строгого контроля не было обнаружено заселения тканей L.intracellularis.

На основе статистического анализа проводили сравнение положительных χ² результатов, полученных с помощью илеит-ПЦР, с использованием критерия χ² и аппроксимации по методу Монте-Карло точного значения р. Результаты анализа с помощью ПЦР мезентерального лимфатического узла свидетельствуют о существенной разнице между невакцинированными контролями, подвергнутыми контрольному заражению, и всеми другими группами, обработанными вакциной (р=0,054). В день 42 исследования между различными группами обработки не было выявлено статистически достоверной разницы в заселении L.intracellularis подвздошной кишки, ободочной кишки или миндалины.

Гистология (ИГХ/Н&Е)

При осуществлении аутопсии (день 42) делали срезы миндалин, мезентерального лимфатического узла, концевого отдела подвздошной кишки и ободочной кишки длиной 2-4 см и помещали их в 10%-ный забуференный формалин для гистологического анализа. При осуществлении аутопсии ни в одной группе обработки не было выявлено с помощью ИГХ-окрашивания присутствие Lawsonia intracellularis в срезах миндалин. Для всех образцов ткани, взятых при осуществлении аутопсии у животных в группе строгого контроля, в ИГХ-анализе была получена отрицательная реакция в отношении L.intracellularis. Присутствие L.intracellularis и наличие микроскопических повреждений, связанных с ПЭС, было обнаружено в подвздошной кишке у 9/10 (90%) свиней в группах невакцинированных контролей, подвергнутых контрольному заражению, у 6/15 (40%) свиней в группе, обработанной низкой дозой вакцины, у 3/15 (20%) свиней в группе, обработанной средней дозой вакцины и у 1/15 (6,7%) свиней в группе, обработанной высокой дозой вакцины, соответственно. Микроскопические повреждения были выявлены в ободочной кишке у 8/10 (80%) свиней в контрольной группе, подвергнутой контрольному заражению, у 3/15 (20%) свиней в группе, обработанной низкой дозой вакцины, и у 1/15 (6,7%) свиней в группе, обработанной высокой дозой вакцины. Группа, обработанная средней дозой вакцины, давала отрицательную реакцию в ИГХ-анализе в отношении присутствия L.intracellularis в ободочной кишке. В контрольной группе, подвергнутой контрольному заражению, только у 1/10 (10%) свиней были получены окрашенные срезы мезентерального лимфатического узла, свидетельствующие о присутствии L.intracellularis. Положительные результаты ИГЗ-анализа для срезов подвздошной кишки и ободочной кишки в группах обработки хорошо коррелируют с наличием выраженной гиперплазии крипт, обнаруженной с помощью метода с использованием Н&Е.

Статистический анализ количественных результатов ИГХ проводили с помощью однонаправленного дисперсионного анализа и критериев ранговой суммы Крускала-Уоллиса с последующей оценкой специфических различий между значениями р, полученными для каждой из групп, обработанных дозой вакцины, и для группы, подвергнутой контрольному заражению, и группы строгого контроля. Статистический анализ в день исследования 42 выявил наличие образования значительных повреждений, вызванных L.intracellularis, в подвздошной кишке и ободочной кишке животных в контрольной группе, подвергнутой контрольному заражению, по сравнению с вакцинированными свиньями независимо от дозы (р<0,001). Различие средних баллов повреждений подвздошной кишки и ободочной кишки, полученных на основе ИГХ, для вакцинированных животных, обработанных высокой или средней дозой вакцины, по сравнению с группой обработки, представляющей собой строгий контроль, не было статистически достоверным (р>0,05). Свиньи, обработанные низкой дозой вакцины, характеризовались существенно более высокими средними баллами микроскопических повреждений в подвздошной кишке, вызванных L.intracellularis, чем животные в группе строгого контроля (р<0,05).

Оценки макроскопических повреждений

Во время аутопсии (день 42) проводили балльную оценку макроскопических повреждений подвздошной кишки и ободочной кишки у каждого подопытного животного, связанных с ПЭС. Ткани подопытных свиней в группе строгого контроля были здоровыми, не имели повреждений, и средние баллы повреждений составляли 1,1 (подвздошная кишка) и 1,0 (ободочная кишка). Ткани подопытных животных в невакцинированной контрольной группе, подвергнутой контрольному заражению, характеризовались наивысшим среди групп обработки средним баллом макроскопических повреждений подвздошной кишки (3,6) и ободочной кишки (2,0). Подопытные свиньи в группе, обработанной низкой дозой вакцины, характеризовались средним баллом макроскопических повреждений, составляющим 2,5 (подвздошная кишка) и 1,5 (ободочная кишка). Подопытные свиньи в группе, обработанной средней дозой вакцины, характеризовались средним баллом макроскопических повреждений, составляющим 1,5 (подвздошная кишка) и 1,0 (ободочная кишка). Ткани животных в группе, обработанной высокой дозой вакцины, характеризовались средним баллом макроскопических повреждений, составляющим 1,5 (подвздошная кишка) и 1,2 (ободочная кишка).

Статистический анализ средних баллов макроскопических повреждений для групп обработки проводили с помощью однонаправленного дисперсионного анализа. Средние баллы макроскопических повреждений свидетельствуют о существенном различии между повреждениями подвздошной кишки в невакцинированной контрольной группе, подвергнутой контрольному заражению, и группами, обработанными средней и высокой дозой вакцины соответственно (р<0,001). Было установлено существенное различие между средними баллами макроскопических повреждений подвздошной кишки для контрольной группы, подвергнутой контрольному заражению, и группы, обработанной низкой дозой вакцины (р<0,01). Средние баллы макроскопических повреждений ободочной кишки в контрольной группе, подвергнутой контрольному заражению, были существенно выше, чем в группах, обработанных средней и высокой дозой вакцины соответственно (р<0,05). Кроме того, было выявлено образование значительных макроскопических повреждений в подвздошной кишке в группе, обработанной низкой дозой вакцины, по сравнению с группой строгого контроля (р<0,001). Не было выявлено статистически достоверного различия между средними баллами макроскопических повреждений (подвздошная кишка и ободочная кишка) в группах, обработанных средней и высокой дозой вакцины, и в группе обработки, представляющей собой строгий контроль.

Выводы

В данном исследовании продемонстрировано, что защита 3-недельных свиней от ПЭС обеспечивалась путем введения оральным путем дозы вакцины В3903 (лиофилизированной) объемом 2 мл, содержащей как минимум 4,9 logs живой L.intracellularis на дозу. Сходная или даже несколько лучшая защита была достигнута для группы животных, обработанных высокой дозой вакцины, которым вводили 6,0 logs/дозу за 3 недели до контрольного заражения. Для группы, обработанной низкой дозой вакцины (3,8 logs/дозу) не была достигнута адекватная защита от контрольного заражения вирулентной гетерологичной чистой культурой в отличие от подопытных животных, обработанных высокой или средней дозой экспериментальной вакцины. Между группой, обработанной низкой дозой вакцины, и невакцинированными контрольными группами, подвергнутыми контрольному заражению, были выявлены статистически достоверные различия в серьезности микроскопических повреждений подвздошной кишки и ободочной кишки (р<0,001) и средними баллами макроскопических повреждений подвздошной кишки (р<0,01). Однако в этой группе были выявлены значительные связанные с РРЕ повреждения подвздошной кишки (микроскопические повреждения) и ободочной кишки (макроскопические повреждения) по сравнению с группой строгого контроля, которую не обрабатывали вакциной и которую не подвергали контрольному заражению.

В целом результаты данного исследования свидетельствуют о том, что: (1) минимальный защитный титр вакцины В3903 (лиофилизированной) при однократном оральном введении 3-недельным свиньям составляет 4,9 logs/дозу; (2) вакцина В3903 (лиофилизированная) обладает эффективностью в отношении вирулентного гетерологичного изолята N 101494, полученного с помощью небольшого количества пересевов чистой культуры L.intracellularis; и (3) вакцина В3903 (лиофилизированная) способствует уменьшению макроскопических и микроскопических повреждений, заселения ткани и выделения L.intracellularis с фекалиями у вакцинированных свиней по сравнению с невакцинированными свиньями.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан новый авирулентный изолят Lawsonia intracellularis. Изолят может быть использован для получения на его основе вакцины против заражения, вызываемого L.intracellularis. Также раскрыты способы получения таких вакцин, диагностики заболевания и получения антисыворотки с помощью изолята. Изобретение может быть использовано в ветеринарии. 10 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 табл.

1. Авирулентный изолят Lawsonia intracellularis ATCC PTA-4926, предназначенный для индукции иммунного ответа на Lawsonia intracellularis и/или для диагностики Lawsonia intracellularis.

2. Авирулентный изолят Lawsonia intracellularis по п.1, отличающийся тем, что применяется в качестве вакцины.

3. Авирулентный изолят Lawsonia intracellularis по п.1, отличающийся тем, что применяется в качестве вакцины для защиты животного от пролиферативной энтеропатии свиней.

4. Вакцина для иммунизации животного, содержащая фармацевтически эффективное количество авирулентного изолята Lawsonia intracellularis no п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Вакцина по п.4, отличающаяся тем, что фармацевтически эффективное количество авирулентного изолята Lawsonia intracellularis составляет от 10³ TCID₅₀ до 10⁶ TCID₅₀ на дозу.

6. Вакцина для иммунизации животного, содержащая авирулентный изолят Lawsonia intracellularis no п.1 и антигенный материал по меньшей мере из одного из следующих патогенов: Salmonella spp., Erysipelothrix spp., Haemophilus spp., Mycoplasma spp., Leptospira spp., Clostridium spp., Streptococcus spp., Brachyspira spp., цирковирус, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), вирус гриппа свиней (SIV), передаваемый желудочно-кишечным путем (TGE) вирус, парвовирус и Escherichia coli; и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Вакцина для иммунизации животного, содержащая авирулентный изолят Lawsonia intracellularis по п.1 и антигенный материал из Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix spp., передаваемого желудочно-кишечным путем (TGE) вируса, Escherichia coli, Clostridium spp.; и Brachyspira spp.; и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Вакцина для иммунизации животного, содержащая авирулентный изолят Lawsonia intracellularis по п.1 и антигенный материал из Salmonella choleraesuis и Erysipelothrix spp.; и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Вакцина для иммунизации животного, содержащая авирулентный изолят Lawsonia intracellularis no п.1 и антигенный материал по меньшей мере из одного из следующих патогенов: Clostridium spp., вирус гриппа свиней (SIV), вирус герпеса свиней (EHV), альфавирус и вирус Западного Нила; и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Способ получения вакцины для стимулирования иммунного ответа на бактерии Lawsonia intracellularis у животных, включающий следующие этапы:
(а) инкубирование изолята Lawsonia intracellularis по п.1 в культуре клеток, которая при культивировании указанных бактерий представляет собой суспензию при концентрации кислорода менее 10%, и
(б) перемешивание указанных культивируемых бактерий с фармацевтически приемлемым носителем.

11. Способ культивирования Lawsonia intracellularis no п.1, включающий:
(а) заражение культивируемых клеток инокулятом, содержащим вирулентный изолят указанного Lawsonia intracellularis,
(б) инкубирование зараженных клеток при концентрации кислорода менее примерно 10% при поддерживании с помощью перемешивания клеток в суспензии, и
(в) сбор по меньшей мере части указанных Lawsonia intracellularis.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что концентрация кислорода составляет от примерно 0 до 8%.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что концентрация кислорода составляет от примерно 0 до 3%.

14. Способ по п.11, отличающийся тем, что инкубирование осуществляют при диапазоне диоксида углерода в пределах от примерно 6 до 10%.

15. Способ по п.11, отличающийся тем, что культивируемые клетки выбраны из группы, включающей клетки линий НЕр-2, МсСоу и IEC-18.

16. Способ по п.11, отличающийся тем, что клетки линии IEC-18 культивируют на микроносителях.

17. Способ по п.11, отличающийся тем, что зараженные клетки инкубируют на стадии (с) в течение периода времени от 2 до 10 дней.

18. Способ по п.11, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию (д), на которой лиофилизируют собранные бактерии.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что процесс лиофилизации включает стадию основной сушки и стадию вторичной сушки.

20. Способ диагностики пролиферативной энтеропатии свиней, заключающийся в том, что проводят анализ для обнаружения антител к Lawsonia intracellularis в организме животного, кроме человека, при котором:
(а) приводят в контакт образец, взятый у объекта, с изолятом Lawsonia intracellularis по п.1 с образованием комплекса антиген-антитело; и
(б) обнаруживают образование комплекса,
где присутствие комплекса положительно коррелирует с диагнозом пролиферативной энтеропатии свиней.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что анализ представляет собой анализ, выбранный из группы, включающей радиоиммунный анализ, твердофазный иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ и иммуноэлектрофоретический анализ.

22. Способ получения антисыворотки к Lawsonia intracellularis в организме животного, кроме человека, заключающийся в том, что:
(а) вводят изолят Lawsonia intracellularis по п.1 животному, кроме человека, в количестве, эффективном для вызывания иммунного ответа; и
(б) собирают антисыворотку или плазму, содержащую антитела к Lawsonia intracellularis.