СПОСОБ ОЗДОРОВЛЕНИЯ ОТ ВИРУСОВ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР, ВЫРАЩИВАЕМЫХ in vitro Российский патент 2007 года по МПК A01G7/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для обеззараживания от вирусов растений, выращиваемых in vitro.

Известен способ оздоровления от вирусов на плодовых культурах путем обязательного сочетания суховоздушной термотерапии (37-38°С на протяжении 40 дней) и культуры in vitro с использованием эксплантов величиной не более 0,3-0,4 мм исключительно из терминальных почек прогретых побегов (См. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур. Методические указания под общей редакцией акад. РАСХН / В.И.Кашина. М.: ВСТИСП. 2001, с.16-17).

Однако, поскольку некоторые вирусы, например вирус хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV), характеризуются термотолерантностью и способностью проникать в меристематические ткани, эффективность оздоровления остается довольно низкой.

Кроме этого суховоздушная термотерапия является энергозатратным процессом, многие плодовые культуры плохо переносят повышенные температуры, формируют слабые побеги, на листьях образуются ожоги.

Наиболее близким техническим решением из известных является способ размножения садовых культур in vitro, согласно которому обработку проводят посредством индуктора последовательностью однонаправленных импульсов магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл, периодом 5,12 с, скважностью от 100 до 4500, при этом апикальную часть экспланта ориентируют противоположно направлению вектора магнитной индукции, а число импульсов магнитной индукции устанавливают от 10 до 100 (См. патент РФ №2222933. Способ размножения садовых растений, выращиваемых in vitro. МПК A01G 7/04, 2002, опубл. в Бюл. №4, 2004 - прототип).

Однако этот известный способ обработки растений направлен главным образом на увеличение скорости роста растений и для оздоровления растений от вирусов мало пригоден.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является снижение гибели эксплантов и повышение эффективности оздоровления от вирусов плодовых культур, выращиваемых in vitro.

Поставленная задача решается тем, что в способе оздоровления от вирусов плодовых культур, выращиваемых in vitro, включающем заготовку эксплантов вегетативных частей растений, высадку их на питательную среду и обработку импульсным магнитным полем, новым является то, что обработку проводят периодической последовательностью взаимно разнонаправленных в одной плоскости импульсов магнитной индукции с частотой 0,8-3,0 Гц, числом импульсов от 160 до 600 и амплитудным значением 0,02-0,03 Тл, при этом проводят не менее 6 обработок с интервалом между ними в 7 дней.

Технический результат выражается в том, что согласно предложенному способу работу можно проводить по оздоровлению уже растущих в культуре in vitro растений, увеличить размер эксплантов с 0,3-0,4 мм до 5-10 мм, что позволяет снизить до минимума гибель ксплантов, а также снизить энергозатраты и себестоимость получаемых растений.

Отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом является обработка плодовых культур, выращиваемых in vitro, периодической последовательностью взаимно разнонаправленных в одной плоскости импульсов магнитной индукции с частотой 0,8-3,0 Гц, числом импульсов от 160 до 600 и амплитудным значением 0,02-0,03 Тл, при этом проводят не менее 6 обработок с интервалом между ними в 7 дней.

Все это обеспечивает более эффективное оздоровление плодовых культур от вирусов.

Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволили установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявленном способе, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «новизна».

Результаты проверки соответствия заявленного изобретения условию «изобретательский уровень» показали, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, а является результатом творческого труда авторов изобретения.

Описываемое изобретение не основано на применении количественных признаков, представлении таких признаков во взаимосвязи либо изменении ее вида.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом.

Пример. С целью оздоровления плодовых культур от вирусов ApMV (мозаики яблони) и ACLSV брали экспланты груши сорта Лада, зараженные в сильной степени данными вирусами, величиной 10-12 мм, высаживали их на питательную среду Мурасиге и Скуга (1962), дополненную 6-БАП (бензиламинопурина) в концентрации 1,0 мг/л и ИМК (индолилмасляной кислотой) 0,1 мг/л, агар-агаром 6 г/л, сахарозой 30 г/л. После высадки на питательную среду экспланты помещали внутрь индуктора и с помощью генератора магнитных импульсов обрабатывали периодической последовательностью взаимно разнонаправленных в одной плоскости импульсов магнитной индукции с частотой 0,8-3,0 Гц, числом импульсов от 160 до 600 и амплитудным значением 0,02-0,03 Тл, при этом проводили не менее 6 обработок с интервалом между ними в 7 дней. Спустя 6 месяцев после обработки экспланты извлекали из сосудов и тестировали методом иммуноферментного анализа (ИФА, ELJSA - тест), используя его сэндвич-вариант по методике M.Clark, A.Adams, 1977. Использовали набор для ИФА фирмы BJORAD (Франция). Иммуноглобулины растворяли в покрывающем буфере и наносили по 100 мкл в каждую лунку микроплаты, затем инкубировали при температуре +4°С в течение 4 ч. После инкубации осуществляли 3-кратную промывку лунок и наносили тестируемые образцы, гомогенизированные в экстрагирующем буфере в соотношении 1:10, по 100 мкл, после чего инкубировали 15 ч при температуре +4°С. Затем микроплаты 4-кратно промывали промывающим буфером и наносили конъюгат по 100 мкл на 10 мл конъюгатного буфера; микроплаты ставили на инкубацию на 2 ч при температуре 37°С. Позже микроплаты 3-кратно промывали, растворяли в субстратном буфере (10 мл) 10 мг 4-нитрофенилфосфата и наносили данный раствор субстрата по 100 мкл в каждую лунку, инкубировали 1-2 ч при температуре +20...+25°С и измеряли результаты на спектрофотометре Униплан-2000 при длине волны 450 нм. Оптическая плотность продукта ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации вируса. В качестве отрицательного контроля брали сок тестируемого растения, заведомо свободного от определяемого вируса. Оптическую плотность тестируемого образца сравнивали путем деления с оптической плотностью сероотрицательного контроля и устанавливали наличие вируса: в тестируемых пробах реакция считается положительной (указывающей на присутствие вируса), если отношение оптической плотности образца к отрицательному контролю более 2,0.

Подсчитывали число здоровых растений и определяли процент здоровых растений к общему числу протестированных растений.

Результаты показали, что наиболее высокий процент оздоровления растений груши сорта Лада от вирусов ApMV и ACLSV отмечен в диапазоне с числом разнонаправленных импульсов магнитной индукции 160-600 и частоте импульсов 0,8-3,0 Гц и составил для вируса ApMV 40-60%, для вируса ACLSV 60-100% (табл.1).

Более низкие и более высокие значения числа разнонаправленных импульсов магнитной индукции и частоты импульсов оказались менее эффективными режимами в отношении оздоровления растений груши сорта Лада от указанных вирусов.

Кроме оздоровления от вирусов магнитная обработка по данному способу обеспечила уменьшение гибели эксплантов до 0,0-12,5%, что на 31,3-43,8% ниже, чем в прототипе (табл.2). При этом увеличилась длина побегов и их число. Обработка по предложенному способу приводила к увеличению длины побегов в 1,7-2,4 раза, числа почек и побегов в 2,0-2,6 раза по сравнению с прототипом.

Таким образом, обработка эксплантов по предлагаемому способу дает положительный эффект в сравнении с прототипом как в отношении оздоровления плодовых культур от вирусов, так и снижения гибели эксплантов и улучшения их развития.

Таблица 1.Эффективность оздоровления растений груши сорта Лада с использованием обработки разнонаправленными импульсами магнитной индукции, в % к общему числу эксплантовЧисло/частота, Гц импульсовВирус мозаики яблони (ApMV)Вирус хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV)Прототип20,040,080/0,418,633,3160/0,860,060,0320/1,658,580,0600/3,040,0100,01280/6,420,040,0

Таблица 2Показатели гибели и вегетативного развития груши сорта Лада в зависимости от обработки разнонаправленными импульсами магнитной индукцииЧисло/частота, Гц импульсовГибель эксплантов, %Длина побегов, ммЧисло почек и побеговПрототип43,810,30,980/0,431,311,71,5160/0,812,518,01,9320/1,60,024,81,8600/3,06,324,62,31280/6,425,010,81,3

Способ включает заготовку эксплантов вегетативных частей растений, высадку их в питательную среду и обработку импульсным магнитным полем. Растения подвергаются воздействию последовательности взаимно разнонаправленных в одной плоскости импульсов магнитной индукции с частотой 0,8-3,0 Гц, числом импульсов от 160 до 600 и амплитудным значением 0,02-0,03 Тл. При этом проводят не менее 6 обработок с интервалом между ними в 7 дней. Способ позволяет снизить гибель эксплантов и повысить эффективность оздоровления от вирусов плодовых культур, выращиваемых в культуральных сосудах. 2 табл.

Способ оздоровления от вирусов плодовых культур, выращиваемых in vitro, включающий заготовку эксплантов вегетативных частей растений, высадку их на питательную среду и обработку импульсным магнитным полем, отличающийся тем, что обработку проводят периодической последовательностью взаимно разнонаправленных в одной плоскости импульсов магнитной индукции с частотой 0,8-3,0 Гц, числом импульсов от 160 до 600 и амплитудным значением 0,02-0,03 Тл, при этом проводят не менее 6 обработок с интервалом между ними в 7 дней.