СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ И ОЗДОРОВЛЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ in vitro С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИБИОТИКА ГРИЗЕОФУЛЬВИН Российский патент 2015 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к клональному микроразмножению сельскохозяйственных культур.

Известен способ клонального микроразмножения плодовых культур, при котором на этапе введения в культуру экспланты стерилизуют 0,1% раствором сулемы (ртути двуйодистой HgI₂) в течение 60 секунд и высаживают на среду Мурасиге-Скуга без добавления антибиотиков [Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами/ под ред. Е.Н. Джигадло - Орел: ГНУ ВНИИСПК- 2005. - 51 с].

Недостатками способа является токсичность препарата для человека при несоблюдении техники безопасности.

Известен другой способ, при котором на этапе введения растений в культуру in vitro в среду добавляется антибиотик нистатин в концентрации 20-100 мг/л - прототип [заявка на изобретение №94043416/13 от 08.12.1994. Авторы: Бабоша А.В., Шнейдер А.Ю., Фирсукова С.И.].

Недостатком способа является недостаточная степень оздоровления эксплантов и среды от грибной и дрожжевидной контаминации.

Техническим результатом изобретения является повышение выхода оздоровленных подвоев яблони, полученных меристемным методом in vitro за счет снижения доли погибших от заражения грибной инфекцией эксплантов.

Поставленная задача решается за счет того, что при высадке простерилизованных апексов терминальных участков однолетних побегов (экспланты) подвоев яблони ММ 106, СК 3, СК 4, СК 7 на питательные среды в качестве санирующего агента добавляется антибиотик гризеофульвин, действующее вещество которого подавляет развитие посторонней микрофлоры, что способствует нормальному развитию эксплантов.

Гризеофульвин - фармацевтический антибиотик, обладающий фунгистатическим действием, эффективен в отношении грибов рода Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton [Антибактериальные лекарственные средства. Методы стандартизации препаратов. - М.: ОАО Издательство Медицина, 2004. - 944 с.]. Активность препарата в отношении возбудителей микозов растений неизвестна.

Преимущества способа:

- достаточная степень оздоровления эксплантов и среды от грибной и дрожжевидной контаминации;

- повышение выхода оздоровленного посадочного материала.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1 (контроль №1). Способ заключается в том, что приготавливают питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга (Состав среды, мг/л: NH₄NO₃ - 1650, KNO₃ - 1900, CaCl₂, 2H₂O - 440, MgSO₄·7H₂O - 370, KH₂PO₄ - 170, H₃BO₃ - 6,2, MnSO₄·4H₂O - 22,3, CoCl₂·6H₂O - 0,025, CuSO₄·5H₂O - 0,025, ZnSO₄·7H₂O - 8,6, NaMoO₄·7H₂O - 0,25, KI - 0,83, FeSO₄·7H₂O - 27,8, Тиамин хлорид - 0,5, Пиридоксин хлорид - 0,5, Никотиновая кислота - 0,5, Мезоинозит - 100, Агар - 8000, вода до 1 л), в среду добавляют регуляторы роста 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 0,4 мг/л, pH раствора доводят до 5,6. Приготовленный раствор нагревают до 95°C, разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм, 120°C в течение 15-20 минут. После этого в ламинар-боксе высаживают на питательную среду простерилизованные апексы терминальных участков однолетних побегов (верхушек) или пазушных почек подвоя ММ 106, СК 3, СК 4, СК 7, изолированных с отрезком стебля.

Пример 2 (прототип). Аналогично примеру 1. Использование среды Мурасиге-Скуга с добавлением антибиотика нистатин в концентрации 100 мг/л.

Пример 3. Аналогично примеру 1. Использование среды Мурасиге-Скуга с добавлением в качестве санирующего агента антибиотика аугментин в концентрации 250 мг/125 мг/л.

Пример 4. Аналогично примеру 1. Использование среды Мурасиге-Скуга с добавлением в качестве санирующего агента антибиотика гризеофульвин в концентрации 500 мг/л.

Пример 5. Аналогично примеру 1. Использование среды Мурасиге-Скуга с добавлением в качестве санирующего агента антибиотика ксенаквин в концентрации 400 мг/л.

Пример 6. Аналогично примеру 1. Использование среды Мурасиге-Скуга с добавлением в качестве санирующего агента антибиотика макропен в концентрации 400 мг/л.

Пример 7. Аналогично примеру 1. Использование среды Мурасиге-Скуга с добавлением в качестве санирующего агента антибиотика цефепим в концентрации 500 мг/л.

Из таблицы видно, что гризеофульвин в концентрации 500 мг/л (пример №4) оказывает стабильное высокое санирующее воздействие на питательную среду и экспланты (приживаемость в среднем 89,3%).

Таким образом, для санации эксплантов подвоев СК 3, СК 4, СК 7 и ММ 106 при введении их в культуру in vitro наиболее эффективно добавлять в санитарную среду для посадки антибиотик гризеофульвин в концентрации 500 мг/л.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения подвоев яблони ММ 106, СК 2, СК 3, СК 4, СК 7, где на этапах введения в культуру в среду Мурасиге-Скуга добавляется в качестве санирующего агента антибиотик гризеофульвин 500 мг/л. Изобретение позволяет повысить выход оздоровленных подвоев яблони, полученных меристемным методом in vitro за счет снижения доли погибших от заражения грибной и дрожжевидной инфекцией эксплантов. 1 табл., 7 пр.

Способ клонального микроразмножения подвоев яблони ММ 106, СК 2, СК 3, СК 4, СК 7, отличающийся тем, что на этапах введения в культуру в среду Мурасиге-Скуга добавляется в качестве санирующего агента антибиотик гризеофульвин 500 мг/л.