СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ДЕСЦЕНЦИИ ТАЗОВОГО ДНА У ЖЕНЩИН Российский патент 2007 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования развития тазовой десценции.

Десценция тазового дна приводит к стойкой социальной дезадаптации, снижению качества жизни, утрате трудоспособности и инвалидизации женщин. Эта проблема актуальна для современного здравоохранения в связи с большой частотой (28,0%) и высокими материальными затратами на хирургическое лечение заболевания.

Этиология тазовой десценции у женщин имеет многофакторную природу. Предрасполагающими факторами являются численность родов, большая масса тела новорожденных, высокое внутрибрюшное давление, дефицит эстрогенов, семейная отягощенность, дефекты развития соединительной ткани. Учитывая высокую распространенность и тяжесть заболевания, разработка современного способа прогнозирования тазовой десценции у практически здоровых женщин является чрезвычайно важной.

Применение разработанного способа обеспечит выявление пациенток с высокой вероятностью развития тазовой десценции с целью формирования групп высокого риска реализации данной патологии и осуществление своевременных и целенаправленных мероприятий по профилактике прогнозируемых нарушений со стороны тазового дна.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования релаксации тазового дна по определению содержания коллагена в соединительной ткани и морфологическим признакам (Sharon A.S. et al., Striae and pelvic relaxation: Two disorders of connective tissue with strong association, J. of Investigative dermatology, 23 March 2006, v.126, p.1745-1748).

Задачей изобретения стала разработка объективного и высокоинформативного способа прогнозирования развития десценции тазового дна, позволяющего оценить риск ее возникновения, как у больных, так и практически здоровых женщин.

Технический результат при использовании изобретения - получение критериев прогноза развития заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК амплифицируют фрагменты локусов Alu и VNTR гена коллагена 3 типа Соl3АI и при выявлении генотипов Alu -/- с отсутствием инсерции и VNTR*2*2 у обследуемых прогнозируют риск развития тазовой десценции.

При выявлении генотипов Alu -/- с отсутствием инсерции и VNTR*2*2 гена коллагена 3 типа Соl3АI риск развития десценции тазового дна составляет 99,13%.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Из лейкоцитов свежей или замороженной консервированной венозной крови методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции выделяют геномную ДНК. Проводят анализ полиморфных локусов Alu и VNTR гена коллагена 3 типа (Соl3АI - интерстициальный коллаген; формирует крупные фибриллы, находится в связках, сухожилиях, сосудах, коже, строме внутренних органов) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК и рестрикционного анализа.

Амплификацию полиморфных участков гена коллагена 3 типа проводят в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1-1,0 мкг геномной ДНК, 0,1 ед. Taq - полимеразы, 0,25 мкМ соответствующих олигонуклеотидных праймеров:

5'-GAGTCCTTTAGAAGGATATGCTCTG-3'

5'-ACCTGCAGCACCAGGAGGTCCTGGAGGGCC-3' (локус Alu Col3AI, хромосомная локализация 2q-31-2q-32,3. интрон-8);

5'-CGCGGATCCTACAGTGAGCCAAGATTGCG-3'

5-CGCGAATTCATTCTTACCAGGAGCACCCTA-3' (локус VNTR Col3AI, хромосомная локализация 2q31-2q-3232q)

и 250 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата в 25 мкл однократного ПЦР-буфера, содержащего 67 мМ Tris-HCl, рН 8,8; 6.7 мМ MgCl₂; 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄; 0.01% Tween-20. Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 95°С в течение 3 мин, 30 циклов, включая отжиг праймеров при 69°С - 30 сек, синтез ДНК при 72°С - 1 мин, денатурацию при 95°С - 30 сек. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 6% полиакриламидном геле, окрашивают бромидом этидия и идентифицируют в ультрафиолетовом свете. Электрофорез фрагментов ДНК проводят в I* трисборатном буфере (I* ТВЕ) (0,089 М Tris - HCl рН 7,8; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА с рН 8,8) в вертикальных пластинах при постоянном напряжении 300 вольт в течение 1,5 часов после 20-минутного префореза. Перед нанесением на гель пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 15% фекола.

Результаты рестрикционного анализа оценивают путем проведения электрофореза в 7% ПААГ с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия (01 мкг/мл в I* ТВЕ) в течение 10 минут и визуализацией под ультрафиолетовыми лучами при длине волны 260 нм.

Выявлены достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов Alu локуса гена Соl3АI между контрольной группой и больными с пролапсом гениталий (ПГ). Установлено, что с развитием пролапса гениталий ассоциирован генотип Alu -/- с отсутствием инсерции (χ²=5.598, р=0.025; OR=3.89, 95%CL 1.18-12.84). Обнаружено, что аллель с инсерцией Alu повтора (Alu+) (χ²=9.02, р=0.005; OR=0.133, 95%CL 0.029-0.617), а также гетерозиготный генотип Alu+/- (χ²=9.26, р=0.005; OR-0.127, (95%CL 0.27-0.594) являются протективными для развития ПГ.

При сравнении контрольной группы и больных с ПГ обнаружены статистически достоверные различия по частоте аллеля VNTR*4 (χ²=5.29, р=0.025), который оказался протективным для развития ПГ (OR=0.55, 95%CL 0.33-0.92). Выявлено 10 генотипов у больных и 12 генотипов у здоровых доноров. Обнаружены достоверные различия между больными и контролем по генотипу VNTR*2*2 (χ²=7.049, р=0.01), который является генотипом риска развития ПГ у пациенток (OR=3.67, 95%CL 1.33-10.09).

Исходя из полученных результатов об ассоциации Alu и VNTR полиморфизма гена Соl3АI с развитием ПГ, мы использовали лог-линейную регрессию для оценки вероятности развития ПГ в зависимости от генотипов по этим двум локусам. Поскольку два полиморфизма гена Соl3Аl являются сцепленными, мы включили только один полиморфизм в анализ - Alu инсерцию, как более информативный маркер.

В результате анализа было получена логистическая регрессия следующего вида:

Для предложенной модели, рассчитанной методом максимального правдоподобия, хи - квадрат составил 12.24 (df=2, p=0.022). Таким образом, предложенная модель является статистически достоверной.

На следующем этапе нами был проведен дискриминантный анализ: лямбда Уилкса = 0.916, F=7.211802, р<0.0010. Провели классификационный анализ на основе имеющихся данных. Из 116 пациенток только в одном случае диагностика на основе этой модели была некорректной - то есть больная была квалифицирована как здоровая. То есть, вероятность правильной постановки диагноза на основе данных генотипов по локусам гена Соl3АI составила 99.13%. В то же время только в 13.33% случаев индивиды были диагностированы как здоровые, в 86.67% случаев они были диагностированы как больные. Таким образом, использование только генетических данных позволяет установить диагноз довольно точно.

В качестве следующего шага мы провели анализ вероятности развития заболевания с учетом, как генетических данных, так и информации о сопутствующей патологии: наличии гипермобильности суставов, варикозного расширения вен нижних конечностей, костных нарушений, а также наследственной отягощенности.

Была получена регрессионная модель при χ²=122.25, df=4, p<<0.000001, которая хорошо описывает имеющиеся данные. Дискриминантный анализ показал высокую информативность клинических показателей для оценки риска ПГ: лямбда Уилкса = 0.51, F=35.07, p<<0.000001. Количество правильно диагностированных случаев составило 87.74%, однако ни один индивид из контрольной группы не был классифицирован как больной, что позволяет почти со 100% надежностью исключать у них возможность развития ПГ. Полученные результаты позволяют говорить об информативности использования полиморфизмов гена Соl3АI в качестве ДНК-маркеров для диагностики ПГ.

Вычисление генетического риска возникновения тазовой десценции при наличии генотипов локуса Alu -/- и VNTR*2*2 гена коллагена 3 типа проводят на основании расчета показателя отношения шансов - Odds ratio (OR) / J.M.Bland, D.G.Altman // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P.1468), отражающего относительный риск развития указанной гинекологической патологии по формуле: OR=(а+0,5)(d+0,5)/(b+0,5)(с+0,5), где а - частота генотипа в выборке больных; b - частота генотипа в контрольной выборке; с - 1-а - сумма частот остальных генотипов в выборке больных; d - 1-b - сумма частот остальных генотипов в контрольной выборке; параметр 0,5 в представленной формуле используют, когда одно из чисел a, b, c, d равняется нулю или оказывается меньше трех. Высокий риск развития десценции тазового дна констатируют при OR>1. В нашем исследовании OR₁=385 (CI=1,18-12,84), при наличии генотипа локуса Alu -/-, OR₂=3,67 (CI=1,33-10,0) при VNTR*2*2 Col3AI.

Генотипы локуса Alu -/- и VNTR*2*2 гена коллагена 3 типа являются диагностическими генетическими маркерами десценции тазового дна у женщин и могут применяться для выявления групп лиц с высоким риском развития заболевания, как среди практически здоровых, так и на ранних этапах возникновения болезни с целью проведения эффективных профилактических мероприятий.

Пример 1.

С., 18 лет, дочь больной Л., 54 лет, прооперированной нами по поводу десценции тазового дна в 2004 году. Родилась от вторых срочных, спонтанных, неосложненных родов с массой тела 3100 г, ростом 52 см с оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов. Находилась на естественном вскармливании до 1,5 лет. В детстве отмечались нечастые простудные заболевания. В школу пошла с 7 лет, в настоящее время обучается в одном из вузов. Менструальная функция: возраст менархе - 13 лет. Месячные установились через 6 месяцев, продолжительность менструального цикла - 28 дней, количество менструальных дней 3-4, количество теряемой крови во время менструации около 40 мл, болевых ощущений нет. Последняя менструация отмечалась с 7 по 11.12.05 г. Половой жизнью не живет. Гинекологических жалоб не предъявляет.

При объективном обследовании: рост 164 см, масса тела 60,0 кг. ИМТ=21. Со стороны органов дыхания, сердечно-сосудистой системы, органов брюшной полости, мочевой, нервной и эндокринной систем патологии не выявлено.

Гинекологический статус:

Молочные железы округлой формы, мягкой консистенции, с выраженными сосками; степень их развития по Таннеру - III. Выделений из сосков при надавливании нет.

Наружные половые органы развиты правильно, оволосение по женскому типу. Половая щель сомкнута, девственная плева цела, слизистая оболочка вульвы розового цвета, при натуживании опущение стенок влагалища отсутствует. Промежность обычная, высотой 4,5 см. Анальная область без изменений.

При ректально-абдоминальном исследовании: матка и ее придатки без особенностей.

Диагноз: практически здорова.

Результаты генотипирования.

Для выявления возможных вариантов в отношении тазовой десценции рисковых генотипов локусов Alu и VNTR гена коллагена 3 типа у больной было взято 10 мл венозной крови с последующим выделением ДНК с амплификацией полиморфных участков гена Соl3АI в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1-1 мкг геномной ДНК, 0,1 ед. Taq - полимеразы, 0,25 мкМ соответствующих олигонуклеотидных праймеров:

5'-GAGTCCTTTAGAAGGATATGCTCT-3'

5'-ACCTGCAGCACCAGGAGGTCCTGGAGGGCC-3'

5'-CGCGGATCCTACAGTGAGCCAAGATTGCG-3'

5'-CGCGAATTCATTCTTACCAGGAGCACCCTA-3'

и 250 мкг каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного ПЦР - буфера. Электрофорез фрагментов ДНК проводили при постоянном напряжении 300 вольт в течение 1,5 часов после 20-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого эдития в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

У обследованной пациентки изучение локусов Alu и VNTR кандидатного гена Соl3АI позволило выявить наличие генотипов Alu -/-, VNTR*2*2 Соl3АI - маркеров тазовой десценции.

Вывод: у наблюдаемой пациентки проведение генетического анализа на доклиническом уровне позволило определить высокий риск развития десценции тазового дна. Ей был назначен комплекс специальной лечебной физкультуры, подобран конституциональный гомеопатический препарат «Silicea», C30.

Предлагаемый способ современен и позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать развитие десценции тазового дна как у практически здоровых людей, так и у больных с начальной стадией заболевания.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии. Сущность изобретенрия: выделяют ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК амплифицируют фрагменты локусов Alu и VNTR гена коллагена 3 типа. При выявлении генотипов Alu -/- с отсутствием инсерции и VNTR*2*2 аллеля, прогнозируют риск развития тазовой десценции у обследуемых. Преимущество изобретения заключается в точном объективном прогнозе развития заболевания.

Способ прогнозирования риска развития десценции тазового дна, характеризующийся тем, что выделяют ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК амплифицируют фрагменты локусов Alu и VNTR гена коллагена 3 типа, Соl3А1 и при выявлении генотипов Alu -/- с отсутствием инсерции и VNTR*2*2 у обследуемых прогнозируют риск развития тазовой десценции.