НЕПРЕРЫВНЫЙ СПОСОБ ЭКСТРАГИРОВАНИЯ ПРОЦИАНИДИНОВ КАКАО И ЭКСТРАКТ КАКАО, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ Российский патент 2007 года по МПК A23G1/02 

Изобретение относится к усовершенствованным способам экстракции полифенолов какао, в том числе катехина, эпикатехина и олигомеров процианидина какао из сухого вещества какао.

Известно, что регулярное потребление пищевых полифенолов, которые обычно присутствуют в различных фруктах и овощах, является полезным. Установлено, что красное вино, зеленый чай и какао богаты полифенолами, и было показано, что регулярное потребление как красного вина, так и зеленого чая, снижают риск смерти от заболеваний сердца в промышленно развитых странах.

Хорошо известно, что значительный вклад в развитие аромата ферментированных и жареных какао-бобов вносят полифенолы какао. Терпкий и горький вкус какао традиционно связывают с присутствием в какао-бобах алкалоидов ксантина и полифенолов. По этой причине за многие годы были разработаны различные способы экстракции полифенолов какао для определения их присутствия, количественной оценки и идентификации. Полифенолами какао являются прежде всего процианидины какао. Однако до сих пор ни один из экстракционных способов не позволял получить экстракты с высоким содержанием процианидов какао.

В настоящее время известно, что между структурой и функцией процианидиновых олигомеров какао имеется очевидная взаимосвязь, означающая, что отдельные олигомеры или фракции, содержащие несколько олигомеров сходного размера, демонстрируют специфичные биологические функции, на которые не влияют другие олигомеры. Таким образом, важно обеспечить, чтобы используемый способ экстрагирования приводил не только к максимальному растворению полифенолов какао, но также эффективно экстрагировал все олигомеры полифенолов какао, присутствующие в какао-бобах.

Экстрагирование какао-бобов водой или органическим растворителем, или смесью воды и органического растворителя использовалось для удаления алкалоидов ксантина (преимущественно кофеина и теобромина) и других растворимых компонентов какао- бобов, которые придают горький, неприятный привкус. К числу этих растворимых компонентов, придающих горький привкус, относятся и процианидины.

В патенте США № 1750795 (выдан Дефрену в 1926) описан способ удаления «большей части растворимых компонентов бобов, придающих горький привкус», который заключается в вымачивании бобов в воде при 60°С, удалении воды и обжаривании бобов.

Для удаления ксантинов с целью получения бобов какао без стимулирующих веществ использовалась обработка горячей водой, см. патент США № 4407834 («удаление теоброминов из какао»)(выданный Chiovini и др. 28 июня 1983) и патент США № 4755391 «удаление метилксантинов из какао» (выданный Chiovini и др. 5 июля 1988).

Экстракты какао получали экстрагированием порошка, полученного из ферментированных, обжаренных обычным способом какао-бобов, водой и/или спиртами. Osakabe и др. использовал для получения сырого экстракта полифенола обычный спирт (этанол) абсолютный либо в водном растворе с более 40% об/об деионизированной воды при температуре окружающей среды, см. JP-94-64717 «Пищевые продукты или напитки для предотвращения язвы желудка (4 октября 1995).

Zieglader и др. для экстракции полифенолов из какао-бобов использовали метанол при температуре окружающей среды, см.«Antioxidative Effects of Cocoa» («Антиокислительное действие какао») (Rev.Choc. Confect Bak, 8:3-6, 1983), в котором описано получение метанольного экстракта. Этот экстракт содержал «мономерные предшественники танина (катехины, антоцианидины и их растворимые конденсаты)» и использовался в качестве добавки к маслу для предотвращения его окисления. Griffiths и др. использовали метанольные экстракции, также проводимые при температуре окружающей среды, для получения экстрактов полифенолов из спелых какао-бобов без шелухи, которые использовались для изучения характеристик растительных полифенолов какао и других растений, см. «А» Comparative Study of the Seed Polyphenols of the Genus Theobroma» «Сравнительное изучение полифенолов семян рода Theobroma», (Biochemical J. 74:362-365, 1960). Rigaud и др. получили экстракт из лиофилизированных какао-бобов и виноградных косточек и обнаружили, что использование метанола в качестве растворителя препятствует экстракции высших олигомеров, см. "Normal-Phase High-Performance Liquid Chromatograhic Separation of Procyanidins from Cacao Beans and Grape Seeds» («Отделение процианидинов из какао-бобов и виноградных косточек посредством ВЭЖХ» (J. Chromatography 654:255-60, 1993). Jalal и Collin получили экстракты из различных частей растения какао для анализа на присутствие полифенолов в каждой части растения. Экстрагирование проводили 70% холодным метанолом, а затем этилацетатом, см. "Polyphenols of Mature Plant, Seedling and Tissue Cultures of Theobroma Cacao" (Phytochemistry, 16:1377-1380, 1977) «Полифенолы культур зрелых растений, ростков и тканей Theobroma cacao».

Для экстракции бобов какао также использовалась смесь ацетон/вода. Clapperton et al., описали экстракцию обезжиренного порошка какао, полученного из ферментированных бобов какао, используя охлажденный 70% ацетон, см. "Polyphenols and Cocoa Flavor, Groupe Polyphenols" Полифенолы и ароматические вещества какао (XVI^th Intern. Conf., Lisbon, Portugal, 13-16 июля, 1992). Rigaud объединил первую экстракцию этанолом и вторую экстракцию, используя 60%-ную смесь ацетона с водой, см. "Normal-Plase High-Performance Liquid Chromatographic Separation of Procyanidins from Cacao Beans and Grape Seeds" (J.Chromatography, 654:255-60, 1993).

Обычно какао-бобы обрабатывают таким образом, чтобы максимально уменьшить горький привкус, который дают бобам полифенолы, что приводит к снижению содержания полифенольного компонента в бобах. Существует два пути, при которых полифенольный компонент значительно уменьшается: ферментация какао-бобов в кожуре и обжаривание ферментированных какао-бобов для растрескивания кожуры и облегчения ее удаления. Zieglader и др. описали потерю антиоксидантной активности в экстрактах ферментированных какао-бобов по сравнению с экстрактами неферментированных бобов и связь этого снижения антиоксидантной активности со снижением количества полифенолов в экстрактах ферментированных бобов. Все описанные выше способы экстракции проводили с использованием ферментированных бобов и в большинстве случаев бобы были обжарены. При этом выход процианидинов был гораздо ниже, чем их выход из экстрактов неферментированных бобов.

Обычной практикой было использовать после стадии начальной экстракции стадию экстракции этилацетатом, см. Forsyth & Roberts, «Cacao Polyphenolic Substances: 3. The Structure of Cacao Leucocyanidin I» Biochem. J. 74, 374-378, 1960; Thompson et al., «Plant Procyanidins. Part I. Introduction; the Isolation, Structure and Distribution in Nature of Plant Procyanidins» J. Chem. Soc. Perkin I, Vol. 11, 1387-99, 1972; Jalal & Collins, «Polyphenols of Mature Plant, Seedling and Tissue Cultures of Theobroma Cacao»,Phytochemistry, 16:1377-1380, 1977, Porter et al. «Flavans and Proanthocyanidins» Chapter Two in «The Flavonoids», Ed., J.B. Harbome, Chapman and Hall Ltd., London, 1988; патент США № 5554645, выданный 3 октября 1994 Romanczyk и др.). Экстракт в этом случае содержит мономеры и низшие олигомеры, но не содержит или содержит в небольшом количестве высшие олигомеры, см. Lea A. «The Phenolics of Ciders: Oligomeric and Polymeric Procyanidins», J. Sci. Fd Agric. 29, 471-477, 1978.

На выход экстрагированных полифенолов влияет то, были или не были какао-бобы обезжирены перед экстракцией. Если бобы не были обезжирены, то жир в бобах оказывает отрицательное действие на растворяющую способность растворителя, и полифенольный выход значительно снижается (Lazarus et al., «Flavonoids and Other Polyphenols» в серии «Методы Энзимологии», ред. Lester Packer. Academic Press, New York.

Экстракты какао получали из порошка какао, полученного из неферментированных или ферментированных какао-бобов, высушенных на солнце. Бобы размалывали, обезжиривали и экстрагировали смесью 70% ацетон/30% деионизированная вода, а затем экстрагировали 70% метанолом и два раза хлороформом. Затем экстрагировали этилацетатом с добавлением воды и удаляли этилацетат. Альтернативно, бобы экстрагировали 70% ацетоном. В обоих случаях экстракцию проводили при комнатной температуре, и водные экстракты сушили сублимацией, см. патент США № 5554645 (выданный 3 октября 1994 L. Romanczyk и др.) и WO 98/09533 (12 марта 1998).

Кроме того, экстракты какао могут быть получены из частично обезжиренного порошка какао, полученного из необжаренных бобов какао. Порошок какао, полученный как из ферментированных, частично ферментированных, так и из неферментированных какао-бобов имеет более высокое содержание полифенолов, то есть процианидинов какао, чем порошок какао, полученный из обжаренных какао-бобов, как это делается обычно, см. патент США № 6015913 (выданный 18 января 2000 K.S.Kealey и др.).

Обезжиренные, высушенные замораживанием, неферментированные бобы какао содержат приблизительно 2% алкалоидов ксантина, а обработанные обычным способом бобы содержат их еще больше. Теобромин является продуктом разложения кофеина, и оба являются хорошо известными стимуляторами нервной системы. Чрезмерное потребление алкалоида ксантина, как полагают, является вредным. Следовательно, в некоторых случаях, может быть желательным получение экстрактов какао без алкалоидов ксантина.

Таким образом, существует потребность в усовершенствованном способе экстрагирования процианидинов какао из сухих веществ какао, и, в некоторых случаях, для получения экстрактов какао, не содержащих кофеина и теобромина.

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу экстракции полифенолов какао, которые включают в себя катехин, эпикатехин и процианидиновые олигомеры какао, из частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из необжаренных бобов какао. Улучшенный способ включает в себя экстракцию при атмосферном или пониженном давлении подкисленным растворителем, способным растворять полифенолы, или водными подкисленными растворами, содержащими растворитель. Предпочтительно, количество кислоты, добавляемой в растворитель или водный растворитель, является достаточным для снижения рН с около 6,5 до около 2-4. Предпочтительными являются пищевые или физиологически приемлемые кислоты.

Сухие вещества какао получают из неферментированных, частично ферментированных или ферментированных бобов какао. Органический растворитель может быть выбран из группы, состоящей из низших алкильных спиртов, низших алкильных кетонов и низших алкильных ацетатов. Соответствующие растворители включают метанол, этанол, изопропанол, ацетон, метилацетат и этилацетат. Водный растворитель предпочтительно содержит не более чем около 50 об.% воды, однако он может содержать больше воды, но эффективность экстракции такими, более водными, растворами будет ниже. Предпочтительно, водно-органический растворитель содержит от около 50 до около 70% изопропанола, от около 80% до около 100% ацетона и от около 80% до около 95% этанола. При использовании одного этанола экстрагируются главным образом процианидиновые олигомеры какао, начиная с гептамеров. Смесь из около 80% изопропилового спирта и около 20% воды предпочтительно экстрагирует мономеры и олигомеры до гексамеров включительно.

Настоящее изобретение также относится к способу экстрагирования полифенолов какао, в том числе катехина, эпикатехина и процианидиновых олигомеров какао, из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из необжаренных бобов какао. Способ включает стадию экстракциии сухого вещества какао при атмосферном или пониженном давлении неподкисленным органическим растворителем, способным растворять полифенолы какао. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично неферментированными; однако могут использоваться ферментированные какао-бобы, но в этом случае в экстракте будет меньше высокомолекулярных олигомеров.

Частично ферментированные какао-бобы обычно имеют коэффициент ферментации 275 или менее. К предпочтительным частично ферментированным какао-бобам относятся синевато-серые, фиолетовые или фиолетово-коричневые бобы какао, или смеси синевато-серых и фиолетовых бобов какао, фиолетовых и коричневых бобов какао, или синевато-серых, фиолетовых или коричневых бобов какао. Неферментированные или частично ферментированные бобы какао содержат по меньшей мере от около 1% до около 15-17 вес.% общих процианидинов какао на грамм обезжиренного сухого вещества какао, обычно около 4-7%.

Растворитель может быть выбран из группы, состоящей из спирта низшего алкила, кетона низшего алкила и ацетата низшего алкила. Подходящими растворителями являются метанол, этанол, изопропил, ацетон, метилацетат и этилацетат. Водный раствор растворителя может содержать до около 50 об.% воды, однако количество воды может быть больше, но при этом общее количество экстрагированных полифенолов какао будет меньше. К предпочтительным растворителям относится 50-60% ацетон и 100% этанол. Экстракцию можно проводить при температуре от 0°С до температуры кипения используемого растворителя или водного растворителя при используемом давлении экстракции. Когда растворителем является метанол, экстракцию предпочтительно проводят при комнатной температуре. Когда растворителем является этанол, экстракцию предпочтительно проводят при температуре от около 20°С до около 50°С. Когда растворителем является изопропанол, экстракцию предпочтительно проводят при около 70^°С. Когда растворителем является водный раствор ацетона, экстракцию предпочтительно проводят при температуре от около 50^°С до температуры кипения раствора.

В вышеуказанных процессах, при использовании подкисленного растворителя или его водного раствора, предпочтительнее низкая температура экстракции. Когда используется неподкисленный растворитель или его водный раствор, то может использоваться высокая температура экстракции.

Настоящее изобретение также относится к способу селективной экстракции низкомолекулярных процианидиновых олигомеров какао из частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао. Используемым растворителем является растворитель, который предпочтительно экстрагирует низкомолекулярные олигомеры, например метилацетат или этилацетат. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично ферментированными, однако могут использоваться ферментированные какао-бобы. Экстракцию предпочтительно проводят при температуре от около 20°С до около 50°С. Полученные экстракты какао состоят в основном из мономеров, димеров и тримеров.

Настоящее изобретение также относится к способу селективного экстрагирования высокомолекулярных процианидиновых олигомеров какао из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из необжаренных бобов какао. Этот способ предусматривает стадии: а) экстрагирования сухого вещества какао этилацетатом, (b) извлечения экстрагированного сухого вещества какао, (с) экстрагирования извлеченного сухого вещества какао растворителем, который является подходящим растворителем для высокомолекулярных олигомеров, например, ацетоном, этанолом и их смесью с содержанием воды до 50%, (d) разделения сухого вещества какао и экстракта какао и, возможно, е) сушки экстракта какао. Экстрагирование предпочтительно проводят при температуре от около 20°С до около 50°С. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично ферментированными, однако могут использоваться ферментированные какао-бобы. Экстракт какао состоит в основном из по меньшей мере тетрамеров и высших олигомеров.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к непрерывному способу экстрагирования полифенолов какао при атмосферном или пониженном давлении, включая катехины, эпикатехины и процианидиновые олигомеры какао, из частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао, используя растворитель, пригодный для растворения процианидинов какао, или водные растворы растворителя. Этот способ предусматривает стадии: а) контактирования ряда ячеек, заполненных сухими веществами какао, содержащими различные количества полифенолов какао, с растворителем, текущим в противоточном направлении, и (b) рециркулирования экстракта какао. Жидкий экстракт какао может быть высушен. К предпочтительным растворителям относятся низшие алкильные спирты, низшие алкильные кетоны и низшие алкильные ацетаты. Подходящими низшими спиртами являются метанол, этанол и изопропанол. Предпочтительным является этанол. Подходящим низшим алкильным кетоном является ацетон. Подходящими низшими ацетатами является метилацетат и этилацетат. Предпочтительно, цикл с экстрактом какао повторяют до практически полного исчезновения полифенолов какао, в том числе эпикатехина, катехина и/или процианидинов какао, из экстрагируемого сухого вещества какао.

Экстракты какао могут использоваться в виде жидких экстрактов, называемых «настойками», если растворителем является спирт, в виде водного раствора, если растворитель удаляют, или в виде водорастворимого сухого порошка, полученного после удаления растворителя или растворителя и воды. Когда используется растворитель, экстракт какао сушат путем испарения растворителя. Когда используется водный раствор растворителя, из экстракта какао выпаривают растворитель перед сушкой водного экстракта. Водные экстракты могут быть высушены сублимационной сушкой, распылительной сушкой, испарительной сушкой или барабанной сушкой.

Настоящее изобретение относится к способу получения процианидинов какао и теобромина из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из бобов какао. Способ предусматривает стадии: а) экстрагирования сухих веществ какао этанолом при температуре от около 50°С до около 70°С, (b) охлаждения экстракта этанола при температуре и в течение времени, достаточных для осаждения теобромина, (с) отделения осажденного теобромина и, возможно, (d) удаления этанола из экстракта для получения сухих процианидинов какао. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично ферментированными и необжаренными, однако могут использоваться ферментированные и ферментированные обжаренные какао-бобы.

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения количества теобромина в процианидинах какао, экстрагированных из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао. Этот способ предусматривает стадии: а) экстрагирования сухого вещества какао изопропанолом с получением спиртового экстракта, содержащего процианидины какао и теобромин, (b) охлаждения спиртового экстракта при температуре и в течение времени, достаточных для осаждения теобромина, и (с) отделения теобромина от спиртового экстракта.

В вышеуказанных способах охлаждение проводят в течение до около 12 часов при температуре от около 0°С до около 5°С, а стадию отделения проводят путем фильтрования экстракта, центрифугирования экстракта или адсорбирования теобромина подходящим адсорбентом.

На фиг. 1(А) представлен график, показывающий влияние температур 0°, 20°, 50° и 70°С на выход олигомеров - мономеров, пентамеров и декамеров, при использовании в качестве экстрагирующего растворителя 100%-ного этанола.

Фиг. 1(B) - график, на котором представлено влияние температур 0°, 20°, 50° и 70°С на % выход олигомеров - мономеров, пентамеров и декамеров, при использовании в качестве экстрагирующего растворителя 100%-ного изопропанола.

Фиг. 1(С) - график, на котором представлено влияние температур 0°, 20°, 50° и 70°С на % выход олигомеров - мономеров, пентамеров и декамеров, при использовании в качестве экстрагирующего растворителя 100%-ного метанола.

Фиг. 2 - график, показывающий, что ацетон и этанол наиболее эффективны для экстракции высокомолекулярных олигомеров. Извлечение показано в процентах от выхода стандартной экстракции смесью ацетан:вода:уксусная кислота (70:29,5:0,5 об/об).

Фиг. 3 - график, на котором представлено влияние ферментации и обработки на количество мономеров и олигомеров процианидина, экстрагированных с использованием в качестве экстрагирующего растворителя смеси ацетона:воды:уксусной кислоты. Результаты представлены в % от выхода из неферментированных бобов какао.

Фиг. 4 - график, на котором представлено влияние ферментации и обработки на количество мономеров и олигомеров процианидина, экстрагированных с использованием в качестве растворителя кипящей воды. Результаты представлены в % от выхода из неферментированных бобов какао.

Фиг. 5 - блок-схема процесса экстракции полифенолов из какао-бобов.

Фиг. 6 - схема, описывающая процесс удаления теобромина из экстракта какао. Поток паров растворителя, содержащего теобромин, проходит через трехходовой клапан на охлаждаемые пластины слева. Затем поток переключают на правую сторону. После этого растворитель удаляют из левой части. Левую дверь охлаждающего шкафа открывают и твердый осадок сырого теобромина собирают с пластин охлаждающего шкафа или смывают растворителем и получают в жидком виде. Те же стадии повторяют на правой стороне. Растворитель извлекают.

Фиг. 7 - график, сравнивающий профили олигомеров сухого вещества какао-экстрактов при экстрагировании этилацетатом при 50°С веществ, полученных из неферментированных какао-бобов, и при экстрагировании этилацетатного экстракта сухого вещества какао смесью ацетон:вода:уксусная кислота (70:29,5:0,5). Процентный выход сравнивали с экстрактом сухих веществ какао из неферментированных бобов смесью ацетон:вода:уксусная кислота (70:29,5:0,5).

Фиг. 8 - график, сравнивающий выход мономеров и олигомеров в экстрактах сухого вещества какао, полученных из ферментированных и неферментированных бобов какао, при использовании смеси 80% этанол:20% вода в качестве растворителя.

Полифенолы какао, в том числе процианидины, могут быть получены из нескольких генотипов Theobroma cocoa c помощью процедур, обсуждаемых ниже. Мономеры включают в себя (+) - катехин, (-)-эпикатехин и их соответствующие эпимеры (то есть, (-)-катехин и (+)-эпикатехин). Процианидины, обнаруженные в экстрактах какао, включают олигомеры от димеров до октадекамеров. Олигомеры могут быть неразветвленными или разветвленными. Неразветвленные 4→8 олигомеры имеют структуру:

где х представляет собой целое число от 0-16. Разветвленные олигомеры имеют структуру:

где а и b, независимо, являются целыми числами от 0-15.

Могут встречаться структурные варианты процианидиновых олигомеров с образованием вторичной внутрифлавоноидной связи при окислительном взаимодействии углерода и кислорода с образованием А-типа олигомеров, как показано ниже (Porter et "Flavons and Proanthocyanidins" глава два in "The Flavonoids», Ed., J.B. Harbome, Chapman и Hall Ltd., London, 1988; Porter в методах биохимии растений, том I. Plant Phenolics. Dey и Harbome, Eds; Academic Press: San Diego, Ca, 1989). Из-за сложности такого преобразования, А-тип проантоцианидинов нечасто встречается в виде олигомеров с одной связью:

По цвету какао-бобы можно разделить на четыре категории: преимущественно коричневые (полностью ферментированные), фиолетовые/коричневые и фиолетовые (частично ферментированные), и синевато-серые (неферментированные). Сухое вещество какао, используемое для максимальной экстракции процианидинов какао, предпочтительно получают из неферментированных или частично ферментированных какао-бобов (то есть, из синевато-серых или фиолетовых какао-бобов, из смеси синевато-серых и фиолетовых какао-бобов, из смеси фиолетовых и коричневых какао-бобов, или из смеси синевато-серых, фиолетовых и коричневых какао-бобов). Предпочтительнее, чтобы какао-бобы были синевато-серыми и/или фиолетовыми. Неферментированные какао-бобы имеют более высокое содержание полифенола какао, чем ферментированные какао-бобы (Kim Keeney J.Food Sci. 49 1090, 1984; Porter et al., «Cacao Procyanidins:Major Flavonoids and Identification of Some Minor Metabolites» Phytochemistry, том 30, № 51657-1663, 1991).

Содержание полифенолов в какао-бобах или их смеси выше, когда коэффициент ферментации бобов равен 275 или меньше. «Коэффициент ферментации» определяют, используя оценочную систему для характеристики ферментации бобов какао. Например, синевато-серые бобы оценивают как 1, фиолетовые бобы - 2, фиолетовые/коричневые бобы - 3 и коричневые бобы - 4. Процент бобов, попавших в каждую категорию, умножают на оценочный номер. Таким образом, «коэффициент ферментации» для образца со 100% коричневых бобов будет 100×4 или 400, тогда как для образца со 100% фиолетовых бобов он будет 100×2 или 200. Образец из 50% синевато-серых бобов и 50% фиолетовых бобов будет иметь коэффициент ферментации 150, то есть [(50×1) + (50×2)].

Неферментированные или частично ферментированные бобы какао предпочтительно содержат, по меньшей мере, 1 вес.% общих процианидинов какао, от веса обезжиренного сухого вещества какао, предпочтительно 3-7 вес.%, более предпочтительно 7-12% и наиболее предпочтительно 13-17%.

Способ получения какао-массы, подходящей для экстракции, описан в патенте США № 5554645(выдан 10 сентября 1996 Romanczyk и др.). Собранные «стручки» какао вскрывали и вынимали из них бобы с кожурой для сублимационной сушки. Из полученной после сублимационной сушки массы вручную удаляли кожуру, а бобы обрабатывали следующим образом: сначала с высушенных сублимацией бобов вручную снимали оболочку и перемалывали в мелкий порошок с помощью мельницы TEKMAR Mill, затем полученную массу обезжиривали до утра экстракцией Soxhlet, используя в качестве растворителя гексан двойной дистилляции. Из обезжиренной массы вакуумом удаляли остаточный растворитель при температуре окружающей среды. Альтернативно, какао-бобы сушили на солнце в условиях, задерживающих ферментацию, затем бобы сушили в машине и после этого удаляли оболочку.

Частично обезжиренный или обезжиренный материал какао с высоким содержанием полифенолов какао, то есть с высоким содержанием процианидинов какао, может быть получен обработкой какао-бобов или их частиц без стадии обжаривания, а затем измельчением бобов до тертого какао и извлечением частично обезжиренного сухого вещества какао, или посредством шнекового прессования обжаренных бобов или их частиц, получая частично обезжиренное сухое вещество какао. Если в данном процессе используется частично ферментированные какао-бобы, то можно получить еще большее содержание процианидинов. Этот способ сохраняет полифенолы какао, так как проводится без обычной стадии обжаривания. Способ предусматривает стадии: (а) нагревания какао-бобов до внутренней температуры, достаточной лишь для снижения содержания влаги до приблизительно 3 вес.% и растрескивания кожуры, обычно в инфракрасном нагревательном приборе в течение 3-4 минут: (b) провеивания (отделения бобов от кожуры воздухом) (с) шнекового прессования частиц какао и d) извлечения какао масла и частично обезжиренного сухого вещества какао, содержащего полифенолы какао, в том числе процианидины какао. Перед стадией нагревания какао-бобы, возможно, очищают, например, в плотностном сепараторе с псевдоожиженным (воздухом) слоем. Предпочтительно, какао-бобы нагревают до внутренней температуры боба от около 100°С до около 110°С, более предпочтительно до температуры менее чем около 105°С. Провеивание (отделение воздухом) также можно осуществлять в фракционном пневмосепараторе с псевдоожиженным слоем. Вышеописанный процесс нагревания какао-бобов для снижения влажности и растрескивания кожуры описан в патенте США № 6015913 (выдан 18 января 2000 года Kealey et al.).

Внутреннюю температуру боба (ВТБ) можно измерить, если наполнить бобами изолированный контейнер, например термос, вмещающий 80-100 бобов. Для поддержания температуры бобов после перемещения бобов из нагревательного прибора в термос, термос подходящим образом закрывали для поддержания в нем температуры образца. Внутрь заполненной бобами емкости вставляли термометр, при этом температура на термометре устанавливалась в зависимости от температуры бобов в термосе. Значение температуры соответствовало ВТБ. ВТБ может также рассматриваться как равновесная температура массы бобов.

В контексте данного описания применяются следующие термины: «высшие олигомеры» означают здесь процианидиновые олигомеры, от гексамеров до декамеров или выше, а «низшие олигомеры» означают процианидиновые олигомеры, от димеров и до пентамеров. «Экстракт какао», как используется здесь, представляет собой экстракт, содержащий смесь неустановленного состава, экстрагированную из молотых какао бобов, предпочтительно очищенных от кожуры путем суспендирования обезжиренного сухого вещества какао в растворителе или водном растворителе, и удаления сухих веществ какао для извлечения жидкого экстракта. Жидкий экстракт может быть высушен способами, известными специалистам в данной области.

Процесс экстракции предусматривает стадии: суспендирования частично обезжиренного или обезжиренного сухого вещества какао в соответствующем растворителе или водном растворителе для растворения полифенолов какао, отделения экстрагированных сухих веществ какао от фазы растворителя, например, центрифугированием, и, возможно, удаления растворителя(ей). Предпочтительно, экстракция представляет собой непрерывный процесс.

Используемый растворитель, предпочтительно пищевой, может быть растворителем, способным растворять мономеры эпикатехина и катехина и процианидиновые олигомеры какао, содержащиеся в сухом веществе какао. Предпочтительно, растворитель выбран из группы, состоящей из низших спиртов, таких как метанол, этанол и изопропанол; ацетатов, таких как метил или этилацетат; и ацетона. Растворители могут использоваться неразбавленными и в виде водных растворов. Неожиданно оказалось, что предпочтительные разведения растворителя водой отличаются в зависимости от используемого растворителя.

Подкисление растворителя или водного раствора растворителя до рН от около 2 до около 4 может либо повышать, либо снижать эффективность экстракции процианидинов в зависимости от используемого растворителя. Содержание или отсутствие 0,5% уксусной кислоты в растворителе или водном растворителе оказывает разное влияние на эффективность экстракции в зависимости от используемого растворителя и его концентрации. Кислота, используемая при экстракции, может быть любой неминеральной кислотой. Предпочтительными кислотами являются пищевые или физиологически приемлемые кислоты, такие как муравьиная кислота, лимонная кислота, фосфорная кислота и уксусная кислота. При проведении экстракции при высокой температуре, присутствие кислоты не является предпочтительным.

Из экстрактов какао могут быть удалены теобромин и кофеин, причем эти метилксантины могут быть извлечены и очищены. Выбор предпочтительного растворителя зависит от того, выбрасывают или извлекают теобромин. Если теобромин выбрасывают, то лучшим экстрагирующим растворителем является изопропанол при низкой температуре. Однако если теобромин должен извлекаться для очистки, то лучшим растворителем является этанол, а экстракцию удобно проводить при температуре от 50 до 70°. Для обеспечения эффективного и простого процесса получения из какао полифенольного экстракта без теобромина оптимальные условия для удаления метилксантинов должны быть сбалансированы с оптимальными условиями для экстракции процианидинов.

Альтернативно, метилксантины могут быть удалены из экстракта с помощью гелевой хроматографии, как описано в патенте США № 5554645 (Romanczyk и др., 10 сентября 1996). Вкратце, процесс частичной очистки проводят с использованием жидкостной хроматографии на Sephadex LH 20 (28×2,5 см). Разделению способствует ступенчатый градиент растворителя в деионизированной воде. Композиция с начальным градиентом представляет собой 15% метанол в деионизированной воде, за которым ступенчато, каждые 30 минут, следуют 25% метанол в деионизированной воде, 35% метанол в деионизированной воде, 70% метанол в деионизированной воде и, наконец, 100% метанол.

После элюирования кофеина и теобромина элюент собирали в общей фракции, которая представляла собой не содержащую алкалоидов ксантина подфракцию исходного экстракта.

Метилксантины могут быть также удалены из экстракта какао путем их адсорбирования на твердом адсорбенте, после чего экстракт, по существу свободный от кофеина и теобромина, промывают через адсорбент. В данном процессе могут использоваться различные твердые адсорбенты, такие как полимерные смолы и активированный уголь. Предпочтительно, адсорбент по существу нейтрален в воде. Примером нейтральной адсорбирующей смолы является полукальцинированная смола ХЕ-340 (производство Rohm & Haas). Нейтральный активированный уголь может быть получен либо кислотной промывкой термически активированного угля, а затем промывкой водой до нейтральности, либо нейтрализацией кислотно-активированного угля водным раствором щелочи, а затем промывкой водой до нейтральности.

Экстракция растворителем обезжиренного сухого вещества какао может проводиться либо периодически, либо непрерывно, предпочтительно непрерывно. При периодическом процессе экстракции полифенолов из сухого вещества какао требуется больше растворителя относительно твердой фазы. Кроме того, для экстракции всех доступных полифенолов какао, в том числе процианидинов, обычно требуется несколько последовательных экстракций. Предпочтительным методом экстракции является непрерывная противоточная экстракция. В этом процессе оптимальны эффективность экстракции и затраты на осуществление процесса, позволяя применять этот способ в промышленном масштабе. Использование непрерывного противотока растворителя через сухое вещество какао позволяет значительно снизить количество растворителя относительно твердой фазы, так как растворитель можно непрерывно рециркулировать. Кроме того, в результате непрерывного потока растворителя через сухое вещество какао, нет необходимости проводить двойную экстракцию растворителем или промывать сухое вещество водным растворителем, чтобы обеспечить полное экстрагирование процианидинов из сухого вещества какао.

Как будет показано ниже, эффективность экстракции процианидинов значительно варьирует в зависимости от используемого растворителя. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что некоторые растворители в основном экстрагируют высшие олигомеры, тогда как другие растворители лучше экстрагируют мономеры и низшие олигомеры. Тип используемого растворителя, находится он в водном растворе или нет, температура проведения экстракции и другие факторы могут повлиять на селективную экстракцию высоко - или низкомолекулярных процианидиновых олигомеров. Путем последовательного проведения экстракции одного и того же сухого вещества какао двумя разными растворителями, один из которых экстрагирует мономеры и низшие олигомеры, а другой экстрагирует высшие олигомеры, можно получить отдельные фракции процианидинов в течение одной процедуры экстракции без необходимости подвергать экстракт сложной обработке разделения высших и низших олигомеров. Таким образом, еще одним вариантом изобретения является процесс, благодаря которому можно селективно экстрагировать олигомеры из сухого вещества какао в промышленном масштабе с помощью одностадийного процесса, без дорогостоящего и сложного процесса хроматографического разделения олигомеров.

Эксперименты

Контрольный экстракт

В последующих примерах результаты всех экстракций растворителями сравнивали с контрольными экстрактами, полученными экстрагированием неферментированных обезжиренных какао-бобов, высушенных сублимацией, с использованием процедур, описанных в части А примера 1. Использованным растворителем была смесь 70% ацетона, 29,5% воды и 0,5% уксусной кислоты. Все водные растворы были выражены в % (об/об). Десять граммов обезжиренной массы какао суспендировали в 100 мл этой смеси растворителей и обрабатывали ультразвуком в течение 5-10 минут при 50°С. Жидкий раствор центрифугировали в течение 15 минут при 4°С при 3000×g и надосадочную жидкость фильтровали через стекловату. Выход неочищенных процианидинов составил от 15 до 20%.

Разделение и количественная оценка олигомеров процианидина

В последующих примерах для разделения и количественной оценки по степени полимеризации мономеров и олигомеров процианидина в экстрактах какао использовались описываемые ниже аналитические способы. Способ, описанный ниже для идентификации олигомеров процианидина в экстракте какао, основан на работе Hammerstone. J. F. и др., «Identification of Procyanidins in Cocoa (Theobroma cacao) and Chocolate Using High-Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry», J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (10) 490-496. Как сообщалось Lazarus S.A. и др.«High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis of Proanthocyanidins in Foods and Beverages», J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (9); 3693-3701, аналитические способы, описанные ниже, были использованы для количественного анализа широкого спектра образцов пищевых продуктов и напитков, в которых присутствуют различные проантоцианидины. Описанный способ анализа по Лазарусу (1999) использует методы флуоресцентного определения из-за их высокой селективности и чувствительности.

Образцы анализировали, используя аналитический способ Adamson». G.E. и др. «HPLC Method for the Quantification of Procyanidins in Cocoa and Chocolate Samples and Correlation to Total Antioxidant Capacity», J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (10) 4184-4188. Затем образцы непосредственно сравнивали с контрольным экстрактом для точного определения уровней мономеров и олигомеров процианидина по сравнению с мономерами и олигомерами процианидина в контрольном экстракте. Также и общее количество мономеров процианидина и олигомеров в экстракте может быть определено способом Adamson и др. Однако вместо сравнения содержаний в образцах с контрольными экстрактами образцы сравнивают со стандартными растворами каждого мономера и олигомера, позволяя таким образом рассчитать абсолютное количество каждого процианидина, находящегося в экстракте. Стандартные растворы и калибровочные кривые получены для мономеров и олигомеров процианидина способом Adamson и др.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Этот пример описывает получение сухого вещества какао, содержащего различные количества полифенолов какао.

Часть А - Получение из какао-бобов сублимационной сушки

Способы получения обезжиренной какао-массы описаны в патенте США № 5554645 (выдан Romanczyk 10 сентября 1996). Если не указано иное, использованными какао-бобами были неферментированные какао-бобы Sulawesi. Их обрабатывали следующим образом: собранные стручки какао вскрывали и вынимали бобы с пульпой для сублимационной сушки. От полученной после сублимационной сушки массы вручную отделяли пульпу и бобы обрабатывали следующим образом: сначала сублимированные какао-бобы вручную отделяли от кожуры и перемалывали в мелкий порошок на мельнице TEKMAR Mill, затем полученную массу обезжиривали до утра экстракцией Soxhlet, используя в качестве растворителя гексан двойной дистилляции. Из обезжиренной массы удаляли вакуумом остаточный растворитель при температуре окружающей среды.

Часть В - Получение из обжаренных какао-бобов

Порошок какао получали, используя западно-африканские какао-бобы традиционным способом, который предусматривает стадии обжаривания какао-бобов до внутренней температуры боба от 95°С до 160°С, просеивания зерен какао, извлеченных из обжаренных бобов какао, измельчения обжаренных зерен какао с получением тертого какао, прессования тертого какао для извлечения какао-масла и собирания какао-масла и частично обезжиренных сухих веществ какао. Сухое вещество какао может быть дополнительно обезжирено, используя в качестве растворителя гексан, как было описано ранее в части А.

Часть С - Получение из необжаренных какао-бобов

Частично обезжиренное сухое вещество какао с высоким содержанием полифенолов какао, то есть с высоким содержанием процианидинов, получали обработкой высушенных на солнце неферментированных какао-бобов Sulawesi до сухого вещества какао без стадии обжаривания бобов или зерен какао и, если желательно, без стадии измельчения бобов в тертое какао, то есть без шнекового прессования для получения масла какао и частично обезжиренного сухого вещества какао. Полифенолы какао при этом сохранялись, так как традиционная стадия обжаривания была пропущена. Способ предусматривает стадии: (а) нагревания какао-бобов до внутренней температуры бобов, достаточной только для снижения содержания влаги до около 3% по весу и растрескивания кожуры какао; (b) провеивания какао-бобов для отделения от кожуры, (с) шнекового прессования и (d) собирания какао-масла и частично обезжиренного сухого вещества какао, содержащего полифенолы какао, в том числе процианидины какао. Обычно нагревание проводили в инфракрасном нагревателе в течение 3-4 минут. Перед стадией нагревания какао-бобы, возможно очищают, например, в плотностном сепараторе с псевдоожиженным воздухом слоем. Предпочтительно, какао-бобы нагревали до внутренней температуры боба от около 100°С до около 110°С, предпочтительнее менее чем около 105°С. Провеивание можно проводить в том же сепараторе с псевдоожиженным слоем. Вышеописанный процесс нагревания какао-бобов для снижения влажности и растрескивания кожуры описан в патенте США № 6015913 (выдан 18 января 2000 года).

Пример 2

В этом примере изучалась эффективность различных растворителей и водных растворов растворителей при 50^°С. Растворители, использованные для экстракций, были различны, также различным было их рН. Экстракты сравнивали, чтобы оценить эффективность различных растворителей.

Экстракты получали, используя сухое вещество какао, полученное из неферментированных обезжиренных какао-бобов, высушенных замораживанием, как описано в части А примера 1. Десять граммов обезжиренной какао массы суспендировали в 100 мл растворителя в течение 5-10 минут при 50°С. В случае подкисленных растворителей в растворители и водные растворители добавляли 0,5% уксусной кислоты. Использованными растворителями были этанол, метанол, изопропанол и ацетон. Процентное содержание растворителя в воде было различно. Взвесь центрифугировали при 3000×g в течение 5 минут при температуре окружающей среды, а надосадочную жидкость пропускали через 0,45 микронный фильтр. Используя аналитические способы, описанные выше, определяли количество экстрагированных процианидинов и профили олигомеров экстрактов какао. Количество каждого обнаруженного олигомера выражали в виде процентов от количества этого же олигомера, экстрагированного в контрольный экстракт, описанный выше.

Изопропанол

Результаты для изопропанола показаны на таблице 1 (подкисленный) и 2 (неподкисленный).

Таблица 1 - Подкисленный изопропанол% раст-
ворителямоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергексамергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5094,9291,1790,3790,5384,2378,9869,8660,4243,8335,79Продолжение таблицы 16097,2693,0391,1789,4680,5872,7559,9750,0935,1126,497094,9690,5286,1278,9764,3250,8035,5925,5314,568,608094,7086,1673,9657,9638,6124,0212,716,660,000,0010058,4550,8950,1249,4946,6744,3340,3838,4934,8529,12Таблица 2 - Неподкисленный изопропанол% раст-
ворителямоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергексамергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5093,2588,9686,6184,5882,8275,0166,5460,7750,0518,186092,5987,9084,5780,6779,4663,7355,0848,0036,449,097093,3290,4383,0973,3165,0045,4530,1124,1314,151,528040,5235,7125,7520,3817,7714,1611,9311,738,881,6110042,1438,9537,5636,2435,8132,1032,0530,75282222,14

При всех разведениях изопропанола было отмечено явное уменьшение экстракции процианидинов при увеличении размера олигомеров. Наименьшая эффективность была у раствора с 80% изопропанола и 20% воды. Для всех олигомеров, кроме декамеров, для которых наиболее эффективным был 100% изопропанол, наиболее эффективными были 50%, 60% и 70% растворы изопропанола. Необходимо отметить, что для мономеров и низших олигомеров (до пентамеров) растворы 50-70% изопропанола более чем в два раза эффективнее, чем 80% и 100% изопропанол.

Результаты показывают, что кислотная добавка во все водные разведения (50%, 40%, 30% и 20% воды) приводит к увеличению экстракции олигомеров во всех случаях. Однако при добавлении кислоты в 80% изопропанол количество экстрагируемых низших олигомеров увеличивалось в два раза, при этом количество экстрагируемых высших олигомеров практически не изменялось.

Метанол

Результаты для изопропанола показаны на таблице 3 (подкисленный) и 4 (неподкисленный).

Таблица 3 - Подкисленный метанол% раст-
ворителямоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергексамергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5086,9885,4880,2474,98722658,2755,2150,0039,880,006091,6089,6685,2281,2677,0066,1956,5048,9331,900,007092,4695,2395,5797,1590,9084,3372,6760,8241,8228,958088,5394,1092,8692,4385,8078,5766,0054,12363621,0510092,4090,7390,7692,0692,8286,9480,3477,6361,1343,86Таблица 2 -Неподкисленный метанол% раст-
ворителямоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергексамергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5079,50743269,4863,7356,6246,9235,8628,0917,028,336081,04763372,6667,6562,1552,5639,8032,5820,2112,507087,0782,6076,1939,1860,8551,1842,1836,7135,4818,758089,4984,9477,8270,7862,09523542,1834,1829,0312,5010084,9476,4177,7378,0676,6276,4169,7471,9162,7766,67

Данные показывают, что при использовании 70% и 80% метанола, лучше экстрагировались низшие олигомеры, при 100% метаноле лучше экстрагировались высшие олигомеры. Для олигомеров, начиная с пентамеров и выше, низкие концентрации спирта были менее эффективны в зависимости от увеличения размера олигомеров.

Добавление кислоты приводило к увеличению выхода олигомеров. Однако 100%-ный метанол не был эффективен в присутствии кислоты.

Ацетон

Результаты для ацетона показаны на таблице 5 (подкисленный) и 6 (неподкисленный).

Таблица 5 - Подкисленный ацетон%
раство-
рителямоно-
мерди-
мертримертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5095,9393,9693,9795,6999,64107,73114,39112,33126,81121,056095,2894,8194,8495,7897,65100,78104,29103,62111,35111,408077,3073,4374,5577,5676,0374,0563,0354,0213,0413,1610092,4090,7390,7692,0692,8286,9480,3477,6361,1343,86

Таблица 6 - Неподкисленный ацетон%
раство-
рителямоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5089,3684,6986,2085,6186,6794,7794,17108,94108,21140,596098,18115,9575,5498,67100,16102,95102,95105,39100,94131,9580103,54103,34102,89100,6494,9793,2180,2380,5668,0624,4210072,0768,2069,5773,2073,8878,3671,7068,660,000,00

Для низких концентраций ацетона (50 и 60%) эффективность экстракции увеличивается с увеличением размера олигомеров. Для 80% и 100% ацетона эффективность экстракции уменьшается с повышением размера олигомеров.

Этанол

Результаты для этанола показаны на таблице 7 (подкисленный) и 8 (неподкисленный).

Таблица 7 - Подкисленный этанол%
раство-
рителямоно-
мерди-
мертримертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5086,0283,1780,7779,8577,0069,9466,7352,5137,8019,096088,1284,0281,0077,8875,9268,3361,8344,0032,2115,767087,9782,6678,6174,2468,2158,3948,7732,9918,873,338091,4982,9075,51672957,7245,5336,2124,0813340,0010081,4875,5375,1575,7676,6976,1078,5371,1268,9263,03Таблица 2 - Неподкисленный этанол%
раство-
рителямоно-
мерди-
мертримертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер5084,4382,32793378,4076,556721533339,8829,073,336087,9986,0482,5881,6978,1766,7451,1136,9023266,677087,9683,4078,0074,0167,9955,5841,1128,5717,446,678091,8586,6283,1183,1171,0263,1353,0843,7537,3618,3310089,4481,87832487,9485,7690,0095,2997,75102,91109,86

Результаты показывают, что чистый этанол эффективнее водного раствора этанола и что подкисленный этанол лучше, чем неподкисленный. Данные также показывают, что при использовании 70% и 80% этанола лучше экстрагировались низшие олигомеры, при 100% метаноле лучше экстрагировались высшие олигомеры. Для олигомеров, начиная с пентамеров и выше, низкие концентрации спирта были менее эффективны в зависимости от увеличения размера олигомеров.

Таким образом, выбор между использованием 100% растворителя или водной смеси растворителя будет зависеть от того, какие олигомеры процианидинов желательно иметь в экстракте какао.

Пример 3

Эксперименты проводили для определения эффекта температуры на экстракцию процианидинов какао, используя метанол, этанол и изопропанол. Экстракцию проводили, как описано выше, за исключением того, что температура была 0°С, 20°С, 50°С и 70°С, кроме случая с метанолом, у которого температура кипения равна 64°С. Результаты представлены в таблицах 9-11.

Таблица 9 - 100% изопропанол^°Смоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер02,441,941,711,471,120,880,680,460,000,00205,854,974,544,113,553,062,632390,931,0350382136,4336,0435,2733,5731,6230,5630,44252725,897072,7669,9268,9965,7262,4159,30573260,4554,3461,33Таблица 10 - 100% метанол^°Смоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер091,2289,4385,9883,1079,0176,3669,7868,4758,1537,722092,2095,8793,6592,9488,5691,5487,1391,5484,3887,355090,4792,4191,9190,2288,3387,4686,8588,6782,5280,69Таблица 11 - 100% этанол^°Смоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мер067,6668,1767,8467,4963,9362,2858,9853,7249,6946,062073,2772,8873,0372,9070,6169,8364,5363,4359,6853,855089,1288,2289,3991,2288,84863586,2686,8773,5780,907090,5288,2189,17913288,9787,9387,0687,0682,8279,31

Если использовали 100% изопропанол, эффективность экстракции для всех олигомеров процианидина значительно увеличивалась при повышении температуры экстрагирования (см. фиг. 1B). При использовании 100%-ного этанола эффективность экстракции всех олигомеров возрастала при повышении температуры до 50°С (см. фиг. 1А). При использовании 100%-ного метанола действие температуры изменялось в зависимости от размера олигомеров. Например, выход мономеров не зависел от температуры, выход олигомеров, начиная с димеров и заканчивая гептамерами, включительно, возрастал при повышении температуры от 0°С до 20°С; и выход высших олигомеров (от октамеров до декамеров) существенно возрастал при повышении температуры от 0°С до 20°С, но после 20^°С выход снижался (см. фиг. 1С).

Для общего сравнения эффективности растворителей см. фиг.2. Для каждого растворителя было выбрано разведение, которое обеспечивало наилучший выход процианидинов. Как можно видеть, выходы мономеров и олигомеров до гексамеров включительно, значительно не изменяются в зависимости от растворителя. Однако для высших олигомеров стало ясно, что некоторые растворители лучше экстрагировали низшие олигомеры, тогда как другие растворители лучше экстрагировали высшие олигомеры. Например, изопропанол был особенно эффективным для мономеров и низших олигомеров, но его эффективность резко падала для высших олигомеров. Наоборот, этанол был менее эффективен при экстрагировании мономеров и низших олигомеров, но был более эффективным для экстрагирования высших олигомеров.

Пример 4

В этом примере изучалось влияние ферментации на выход процианидинов. Изучали различия выходов процианидина из следующих групп какао-бобов: 1) неферментированных какао-бобов, которые были сублимированы и измельчены в соответствии со способом части А примера 1; 2) ферментированных какао-бобов, которые перерабатывали в сухое вещество какао, используя тот же способ, что и для неферментированных какао-бобов. Для большинства видов бобов промежуток времени, необходимый для обычной ферментации зависит от размеров какао-бобов и частоты их переворачивания. Легкая ферментация бобов занимает около трех дней, полная ферментация от пяти до семи дней и переферментация занимает свыше восьми дней. Третья группа какао-бобов не была ни ферментирована, ни обжарена. Какао-бобы извлекали из стручка, сушили на солнце и обрабатывали в соответствии со способом, описанным в патенте США № 6015913 (Kealey и др.). Кожуру удаляли посредством нагревания какао-бобов в течение времени и при температуре, достаточных только для снижения влажности и ослабления кожуры, чтобы кожуру можно было отделить от зерен провеиванием. Бобы затем перемалывали в порошок способом по примеру 1. Процианидины какао экстрагировали, используя метод «контрольного экстрагирования», где растворителем была смесь 70% ацетона, 29,5% воды и 0,5% уксусной кислоты. Количество каждого мономера процианидина и олигомера процианидина, присутствующего в каждом экстракте, определяли оценочной процедурой, описанной выше.

Как показано на фиг. 3, экстракты ферментированных какао-бобов содержали на 75-100% меньше процианидинов, чем экстракты, полученные из неферментированных какао-бобов. Относительная потеря процианидинов увеличивалась в зависимости от размера олигомеров. Нагревание бобов для удаления кожуры (как в способе по патенту США 6015913) также оказывало влияние на состав экстракта, снижая содержание процианидинов, содержание процианидиновых олигомеров в экстрактах какао, полученных из нагретых бобов какао, составляло 10-50% от того содержания, которое было обнаружено в экстрактах неферментированных какао-бобов с кожурой, удаленной вручную.

Результаты показывают, что ферментация и последующая обработка какао-бобов в большей степени влияют на содержание процианидинов в экстракте, чем выбор растворителя.

Пример 5

Эксперимент по примеру 4 повторяли для тех же групп бобов, но с использованием альтернативного способа экстракции, используя кипящую воду в качестве растворителя. Как можно видеть на фиг. 4, при использовании кипящей воды в качестве растворителя значительно снижается выход процианидинов какао во всех случаях. Потери возрастали в зависимости от размера олигомеров, так как высшие олигомеры не экстрагировались горячей водой.

Пример 6

Данный пример является сравнительным примером, в котором повторяли процесс экстракции, описанный в ряде японских патентных заявок и патентов, принадлежащих Meiji Seika Kaisha Ltd., где предпочтительным растворителем является горячий водный раствор этанола, см. патент Японии № 9206026, опубликованный 12 августа, 1997 года; патент Японии № 7274894, опубликованный 24 октября, 1995 года; патент Японии № 9224606, опубликованный 2 сентября 1997 года. В этих публикациях не описано, были ли бобы ферментированы и обжарены. По-видимому, какао-бобы подвергали «традиционной» ферментации с последующим обжариванием и провеиванием какао-бобов для получения бобов без кожуры. Как описано выше, ферментация и обжаривание уменьшает доступное количество процианидинов в какао-бобах.

Эксперименты проводили для сравнения количества процианидинов и различных олигомеров в полученных экстрактах, когда экстракцию проводили используя (а) ферментированные, (b) неферментированные и (с) частично ферментированные необжаренные какао-бобы в соответствии с процедурой патента США № 6015913 (Kealey и др.). Сухие вещества какао получали из трех групп бобов способами, описанными в части А примера 1. Из каждой группы получали по два экстракта. Первый экстракт получали при 50^°С, используя в качестве растворителя стандартную смесь ацетон/вода/уксусная кислота (70%/29,5%/0,5%). Второй экстракт получали при 80°С, используя в качестве растворителя смесь 80% этанола и 20% воды. Количество каждого олигомера, присутствующего в экстракте водного этанола, выражали в виде процента от содержания олигомеров в экстракте, полученном стандартной смесью ацетон/вода/уксусная кислота.

Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12Порошок
какаомоно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мерНефермен-
тированные
бобы93,27105,9999,5895,2681,0264,4446,033018,812,5Ферменти-
рованные
бобы6456,415036,8433,3333,330000

Результаты показывают, что выход процианидинов значительно снижается при проведении экстракции ферментированных бобов. Кроме того, в экстрактах ферментированных бобов фактически не было высших олигомеров. Использование 100%-ного этанола в качестве растворителя приводило к очень высокому выходу наномеров и декамеров (103% для наномеров и 110% для декамеров, по сравнению со 100% со стандартным растворителем). Экстракция 80%-ным этанолом давала гораздо более низкий выход (37% для наномеров, 18% для декамеров) по сравнению со 100% со стандартным растворителем.

Пример 7

Экстракция процианидинов какао из порошка какао с использованием метода противоточной экстракции

При непрерывной противоточной экстракции органический растворитель или водный органический растворитель пропускают по экстракционной системе, содержащей множество ячеек с частично обезжиренным сухим веществом какао. Органический растворитель или водный органический растворитель поступает в экстракционную систему к ячейке, содержащей наиболее экстрагированную порцию сухого вещества какао, постепенно проходит через более свежие порции порошка какао, содержащиеся в последующих ячейках и наконец через камеру, содержащую самую свежую порцию сухого вещества какао. Таким образом, растворитель и сухое вещество, подлежащее экстракции, перемещают через экстракционную систему в противотоке друг к другу. Температура смеси растворителя, поступающего в ячейку с наиболее экстрагированной порцией сухого вещества какао, может составлять от около 20°С до около 100°С, предпочтительно, от около 50°С до около 95°С, если экстракцию проводят при атмосферном давлении, или быть выше, если экстракцию проводят под давлением. Растворитель должен находиться в жидкой фазе, а не в газовой, поэтому либо реакционная температура должна быть ниже точки кипения растворителя, либо реакцию необходимо проводить в герметичном сосуде. Так как экспериментальные данные, полученные из вышеописанных экспериментов, указывают на то, что процесс экстракции может быть более эффективным при более высоких температурах, может быть предпочтительным проведение противоточной экстракции при более высоком давлении. Количество ячеек и время цикла выбраны так, чтобы получить максимальный выход экстрагируемых процианидинов из сухого вещества какао. Содержание процианидина в экстракте концентрируется при рециркулировании экстракта по непрерывной противоточной системе. В такой системе экстракт непрерывно проходит через ряды ячеек. Периодически ячейку, содержащую наиболее экстрагированную порцию сухого вещества какао, удаляют из системы и вводят другую ячейку, содержащую свежее сухое вещество какао. Оптимальное количество ячеек в ряду и длина каждого цикла изменяется в зависимости от размера частиц сухого вещества какао и экстракционных параметров, таких как температура и давление. Способы определения оптимальных условий известны специалистам в данной области, см. упомянутую ссылку «Unit Operations of Chemical Engineering» 3^ее издание, глава 7, Eds.McCabe, W. и Smith J., McGraw Hill.

Пример 8

Селективная экстракция процианидиновых олигомеров в зависимости от их размера

Этот пример показывает, как могут быть получены экстракты, содержащие преимущественно высокомолекулярные олигомеры процианидина какао или преимущественно низкомолекулярные процианидиновые олигомеры какао, при выборочном использовании растворителей, предпочтительно растворяющих определенные процианидиновые олигомеры.

Один грамм сухого вещества какао, полученного из неферментированных бобов какао способом, описанным в примере 1, экстрагировали три раза 100%-ным этилацетатом при 50°С. Экстракты объединяли и концентрировали вращательным выпариванием под вакуумом досуха. Сухой экстракт ресуспендировали в 10 мл растворителя стандартной смеси ацетон/вода/уксусная кислота (70%/29,5%/0,5%), очищали и анализировали на содержание олигомеров, как описано выше. Экстракт сухого вещества какао этилацетатом затем сушили в вакуумном сушильном шкафу до утра для удаления остаточного растворителя. Высушенные сухие вещества экстрагировали растворителем стандартной смеси ацетон/вода/уксусная кислота (70%/29,5%/0,5%) при 50°С, очищали и затем анализировали на содержание олигомеров, как описано выше. Содержание олигомеров в обоих экстрактах выражали в виде процентного содержания олигомеров в экстракте, полученном из неферментированных какао-бобов с использованием растворителя стандартной смеси ацетон/вода/уксусная кислота (70%/29,5%/0,5%) при 50°С. Результаты показаны в таблице 13.

Таблица 13 моно-
мерди-
мертри-
мертетра-
мерпента-
мергекса-
мергепта-
мерокта-
мернона-
мердека-
мерЭкстракт смесью
ацетон/вода/
уксусная кислота,
из неферментиро-
ванных бобов 100100100100100100100100100100Экстракт
этилацетатный, из
неферментированных
бобов47,7734,9425,7717,639,985,283,43000Экстракт смесью
ацетон/вода/
уксусная кислота,
из этилацетатного
экстракта из сухого вещества бобов66,4772,8178,583,4589,0592,9696,0897,87100100

Как видно из таблицы 13 и фиг. 7, использование этилацетата в качестве растворителя приводит к экстрагированию только мономеров и низших олигомеров, оставляя все высшие олигомеры в экстрагированном сухом веществе какао. Высшие олигомеры затем эффективно экстрагировали, используя растворитель стандартной смеси ацетон/вода/уксусная кислота ((70%/29,5%/0,5%) или 100% этанол.

Пример 7

Детеоброминирование экстракта какао

В этих экспериментах для экстрагирования процианидинов из сухого вещества какао использовали различные растворители при различных температурах. Экстракты затем анализировали для определения количества кофеина и теобромина в экстрактах какао. Использованными растворителями были изопропанол, этанол и метанол. Экстракции проводили при 0°С, 20°С, 50°С и 70°С, используя способ, описанный в примере 1.

Результаты показаны в таблице 14.

Таблица 14Растворители/
температураТеобромин мг/гКофеин мг/г   Изопропанол @ 0°С00изопропанол @ 20°ССледовое количествоСледовое количествоизопропанол @ 50°С1,7Следовое количествоизопропанол @ 70°С3,50,15   метанол @ 0°С1,17Следовое количествометанол @ 20°С1,560,16метанол @ 50°С1,880,19   этанол @ 0°С1,16Следовое количествоэтанол @ 20°С3,580,16этанол @ 50°С4,450,18этанол @ 70°С3,730,16

Если в качестве растворителя использовали этанол, выход теобромина был больше, а если в качестве растворителя использовали изопропанол, то выход был меньше. Выход возрастал с повышением температуры. Результаты показывают, что теобромин наиболее растворим в этаноле и менее растворим в изопропаноле, и что растворимость увеличивается с ростом температуры.

Для того чтобы получить экстракт с минимальным содержанием теобромина и, таким образом, способствовать его удалению из экстракта, оптимальную экстракцию проводят с изопропанолом при пониженной температуре. Это приводит к экстракции процианидинов. После этого при охлаждении экстракта до утра при температуре от около 0°С-4°С теобромин выпадает в осадок в экстракте и его можно извлечь фильтрованием экстракта.

Для выделения максимального количества теобромина из бобов какао, идеальным экстрагирующим растворителем является этанол при температуре от около 50°С-70°С. После экстракции экстракт этанола охлаждают до температуры от около 0°С-5°С, что приводит к осаждению теобромина. Теобромин отделяют фильтрованием, центрифугированием в непрерывной центрифуге или адсорбцией на нейтральном абсорбенте с последующим элюированием.

Предпочтительно, теобромин собирают в виде неочищенного твердого вещества, пропуская растворитель, содержащий теобромин, через систему охлаждаемых пластин в закрытых шкафах (как схематично показано на фиг. 6). Растворитель затем удаляют из системы и собирают для последующего использования. Неочищенный («сырой») теобромин соскабливают с пластин и растворяют в водном растворе. Очищенный, фармацевтически приемлемый теобромин получают перекристаллизацией теобромина, сушкой кристаллов и их повторным растворением в деионизирующей воде двойной дистилляции.

Таким образом, хотя здесь подробно описаны предпочтительные варианты изобретения, понятно, что настоящее изобретение, определяемое формулой изобретения, не ограничивается частными деталями, изложенными в описании, поскольку существует множество вариантов, не выходящих из объема изобретения.

Непрерывный способ экстрагирования полифенолов какао, включающих катехин, эпикатехин и процианидиновые олигомеры какао, из частично или полностью обезжиренных сухих веществ какао, используя неподкисленный водный растворитель, пригоден для солюбилизации полифенолов какао. Способ предусматривает следующие стадии: контактирование ряда ячеек, содержащих сухое вещество какао с водным растворителем, текущим в противоточном направлении, извлечение экстракта какао и рециркулирование экстракта какао. Выход процианидинов в экстракте зависит от используемых какао-бобов, используемого растворителя, рН используемого растворителя и температуры экстракции. Параметры экстрагирования можно оптимизировать с увеличением выхода процианидинов и с возможностью экстракции преимущественно высокомолекулярных или низкомолекулярных олигомеров. Способ селективной экстракции использует противоточную экстракцию растворителем, при которой экстракт какао рециркулируют. Соответственно с этим способом изготовлен экстракт какао. При этом обеспечивается возможность установления более высокой температуры экстракции, чем с использованием подкисленного растворителя. 2 с. и 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 14 табл.

1. Непрерывный способ экстрагирования полифенолов какао, включающих катехин, эпикатехин и процианидиновые олигомеры какао, из частично или полностью обезжиренных сухих веществ какао, используя неподкисленный водный растворитель, пригодный для солюбилизации полифенолов какао, предусматривающий стадии:

(a) контактирования ряда ячеек, содержащих сухое вещество какао с водным растворителем, текущим в противоточном направлении,

(b) извлечения экстракта какао и

(c) рециркулирования экстракта какао.