СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПОЛИСИСТЕМНОЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике и педиатрии. Способ основан на определении цитохимических характеристик ферментов биоэнергетического обмена лимфоцитов периферической крови с помощью компьютерной морфометрии. Оценку активности ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ), α-глицерофосфатдегирогеназы (ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), лактатдегрогеназы (ЛДГ) проводят на основании характеристик гранул формазана с помощью определения следующих параметров: количество депозитов, показатели их формы, размеров, оптических характеристик, при этом проводится дифференцированный анализ гранул формазана в зависимости от их площади - мелкие (до 0,5 мкм²), средние (0,5-1,5 мкм²), крупные гранулы (кластеры) (более 1,5 мкм²). С помощью математического подхода и бинарной логистической регрессии Backward получен "коэффициент детерминации" (р), позволяющий проводить дифференциальную диагностику наследственных заболеваний с недостаточностью белков, участвующих в энергообмене (синдром Кернса-Сейра, Пирсона, MELAS и др.) и заболеваний, при которых нарушения энергообмена представляют собой вторичные звенья патогенеза. Способ малотравматичен, позволяет получить значимые результаты и с высокой достоверностью проводить дифференциальную диагностику наследственных заболеваний.

К "первичным" митохондриальным болезням, детерминируемым дефектами ядерной и митохондриальной ДНК, относятся синдромы MELAS (митохондриальная энцефаломиопатия, лактат-ацидоз, инсультоподобные эпизоды), MERRF (миоклонус-эпилепсия, "рваные" красные волокна), Кернса-Сейра (наружная офтальмоплегия, пигментный ретинит, атриовентрикулярная блокада сердца) и др. Однако, наряду с "первичными" митохондриальными заболеваниями, существует обширный класс состояний, характеризующийся "вторичной" митохондриальной недостаточностью (туберозный склероз, синдромы Элерса-Данло, Марфана, некоторые формы прогрессирующих мышечных дистрофий и др.). К вторичным биоэнергетическим заболеваниям относят ганглиозидозы, некоторые спиноцеребеллярные дегенерации, моногенные синдромы, сопровождающиеся задержкой физического и нервно-психического развития в сочетании с митохондриальной дисфункцией. Причинами "вторичного" угнетения митохондриальной активности могут быть токсические агенты (продукты перекисного окисления липидов и др.), экопатогены (соли тяжелых металлов), дефицит карнитина.

Морфологический анализ, наряду с биохимическим и молекулярно-генетическим методами, традиционно занимает ведущее место в диагностике митохондриальной недостаточности. Наиболее информативным при этом считается анализ митохондрий в биоптатах скелетной мышцы. Однако, учитывая полисистемность поражения, митохондриальные изменения можно выявлять и в других тканях.

В последнее время для диагностики используется цитохимический метод определения активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови (метод Р.П.Нарциссова). Достоинствами метода являются его малотравматичность, относительная простота в постановке, возможность неоднократного применения для изучения динамики изменений и низкая стоимость.

Митохондрий в определенном отношении можно считать наиболее автономными из всех органелл цитоплазмы, они однозначно представляют собой лишь звено морфофункционального гомеостаза тканей. Поэтому многие нарушения других клеточных и органных систем несомненно приводят к "вторичным" митохондриальным изменениям. В качестве примера можно привести данные о нарушении функций митохондрий при пероксисомных болезнях (Holmes et al., 1993), легочной патологии (Lloreta et al., 1996) или различных формах миозита (Ricci et al., 1993). Вероятные "вторичные" изменения митохондрий усложняют диагностику энергетических нарушений и выявление "первичных" изменений этих органелл, связанных с патологией генетического контроля митохондриальных белков.

Определение активности окислительно-восстановительных ферментов клеток периферической крови количественным цитохимическим методом может адекватно отражать энергетический обмен клеток и тканей (Нарциссов Р.П. 1969-1993 гг.). Многолетние исследования показали, что активность ферментов лимфоцитов может отражать состояние ферментативного статуса клеток других тканей организма. Доказательством адекватности применения морфометрического анализа лимфоцитов при митохондриальных болезнях является установленная корреляция функциональной активности митохондрий лимфоцитов с тестом RRF в биоптатах мышц. Морфометрическими методами удалось показать, что функциональная активность митохондрий лимфоцитов у детей с митохондриальными болезнями достоверно снижена по сравнению со здоровыми детьми (Клембовский А.И., Сухоруков В.С. Арх. патол. 1997; Сухоруков В.С., Нарциссов Р.П., Клембовский А.И. и соавт. Арх. патол. 2000). Таким образом, ферментный статус лимфоцитов периферической крови не менее достоверно, чем характеристики митохондрий в скелетных мышцах, может отражать полисистемную митохондриальную недостаточность у детей.

Цитохимический метод малотравматичен (для анализа необходимо всего 3-4 капли крови). Постановка цитохимической реакции относительно проста и не требует значительных материальных затрат.

Целью изобретения является улучшение дифференциальной диагностики наследственных болезней, связанных с различными формами полисистемных нарушений клеточного энергообмена у детей.

Описание метода

В качестве материала исследования используется цельная периферическая кровь. Объектом исследования являются лимфоциты.

На чистые обезжиренные предметные стекла (из расчета по 1 для оценки активности одного фермента) делают тонкие мазки цельной крови, маркируют и высушивают их на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего фиксируют.

Приготовление фиксирующего раствора:

250 мг трилона Б высыпать в сухую колбу на 100 мл; 60 мл ацетона довести дистиллированной водой до 100 мл; смесь вылить в колбу с трилоном Б; перемешать; поставить на сутки в темное место при комнатной температуре; использовать надосадочную жидкость; хранить в темноте при комнатной температуре.

Фиксацию осуществляют, погружая промаркированные предметные стекла с мазками крови в фиксирующий раствор на 30 секунд (не следует оставлять мазок в растворе более 60 секунд). Затем стекла споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, подсушивают на воздухе.

Цитохимическое выявление активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах цельной крови проводится по методу Нарциссова Р.П. (1986). Подготовку реактивов для каждого фермента (СДГ, ГФДГ, ГДГ, ЛДГ) осуществляют в соответствии с инструкцией производителя, прилагаемой к наборам реактивов (ООО МНПК "Химтехмаш" ГосНИИ "ИРЕА" (сертификаты №№27-30 от 4.10.2004 для количественного цитохимического определения ферментов).

Погружают по одному стеклу в стакан с раствором, содержащим реактив для определения соответствующего фермента, подогретый до 37°С. Инкубируют в течение 60 минут на водяной бане или в термостате при температуре 37°С. По окончании инкубации вынимают стекла из растворов, промывают водопроводной водой и высушивают при комнатной температуре.

Для компьютерной морфометрии мазки после проведения цитохимической реакции способом, описанным выше, заключаются под покровные стекла (для этого используется разогретый глицерин-желатиновый раствор). Оценку результатов проводят под светооптическим микроскопом (увеличение 10-15×90, масляная иммерсия). В каждом препарате число гранул формазана, который является продуктом цитохимической реакции, имеющих вид темно-синих зерен, оценивают не менее чем в 50 лимфоцитах. Для компьютерного морфометрического анализа полученных цитохимических показателей используется аппаратное и программное обеспечение пакета программ "Видео-Тест 4,0 Авто" (морфология) (С.-Пб, 2000, ООО "Иста-Видеотест").

При этом методом компьютерного анализа оцениваются следующие параметры: площадь, периметр, длина, ширина, средний габарит, средняя хорда, максимальный, минимальный и средний диаметры Фере, показатели формы - фактор формы эллипса, округлость, удлиненность, оптические параметры, такие как средняя яркость, отклонение яркости, минимальная и максимальная яркости, интервал яркости (разнородность), интегральная яркость, средняя оптическая плотность, интегральная оптическая плотность по всем гранулам, мелким, средним, кластерам 4-х определяемых ферментов.

Для дифференциальной диагностики заболеваний, основой патогенеза которых является наследственная недостаточность белков, участвующих в энергообмене, и наследственных заболеваний с сопутствующей митохондриальной недостаточностью предлагается следующее уравнение:

р=1/1+е^-z,

где е - основание натурального логарифма 2,718;

z=36,22-0,74A-39,12B,

где А - показатель среднего количества мелких гранул фермента ГФДГ;

В - показатель фактора формы эллипса кластеров фермента ГДГ.

Значения дифференциально-диагностического показателя р ("коэффициент детерминации") р<1/2 указывают на наличие у больных наследственной митохондриальной недостаточности (например, синдром Кернса-Сейра, Пирсона, MELAS и др.).

Значения р>1/2 - принадлежность больных к наследственным заболеваниям с сопутствующей митохондриальной недостаточностью.

Используя данный метод, с вероятностью 81,4% можно утверждать, относится исследуемый пациент к группе с "первичной" митохондриальной патологией или к группе с митохондриальной недостаточностью, сопутствующей наследственным заболеваниям, первично не связанным с нарушениями клеточного энергообмена.

В отделении врожденных и наследственных заболеваний и отделении отоларингологии ФГУ Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава было обследовано 75 детей с различными формами недостаточности клеточного энергообмена. Возраст детей колебался от 5 до 12 лет. Обследованные дети разделены на четыре группы.

В первую группу включены 20 детей с диагнозами: Митохондриальная энцефаломиопатия (n=11), органическая ацидурия (n=5), синдром Кернса-Сейра (n=3) и синдром MELAS (n=1). Вторую группу составили 23 ребенка с диагнозами: туберозный склероз (n=10), синдром Элерса-Данлоса (n=7), синдром Марфана (n=6). В третью группу - группу сравнения включены 21 ребенок с диагнозом: хронический тонзиллит. В контрольную группу вошли 11 здоровых детей.

Клинический пример

Пример 1. Больная К. Возраст 6 лет. Клинический диагноз: органическая ацидурия.

Результаты цитохимического компьютерного морфометрического исследования активности ферментов энергетического обмена: среднее количество мелких гранул фермента ГФДГ - 3,5 (показатель А); фактор формы эллипса кластеров фермента ГДГ - 0,864 (показатель В). Применяя уравнение, получают следующие результаты: z=-0,169968; р=0,4576.

Таким образом, р<1/2 указывает на наличие у данной больной наследственной митохондриальной недостаточности.

Пример 2. Больной П. Возраст 12 лет. Клинический диагноз: синдром Элерса-Данлоса.

Результаты цитохимического компьютерного морфометрического исследования активности ферментов энергетического обмена: среднее количество мелких гранул фермента ГФДГ - 0,8 (показатель А); фактор формы эллипса кластеров фермента ГДГ - 0,8502 (показатель В). Применяя уравнение, получают следующие результаты: z=2,3679; р=0,9143.

Таким образом, с вероятностью 81,4% можно утверждать, что данный больной относится к группе детей с наследственными заболеваниями с сопутствующей митохондриальной недостаточностью.

Таким образом, приведенные клинические примеры свидетельствуют о том, что в ряде случаев предлагаемый способ является более адекватным для дифференциальной диагностики наследственных митохондриальных заболеваний и заболеваний с сопутствующей митохондриальной недостаточностью, первично не связанной с нарушениями клеточного энергообмена.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике. Сущность способа заключается в том, что, анализируя цитохимическим методом активность ферментов биоэнергетического обмена лимфоцитов периферической крови, определяют среднее количество мелких гранул фермента α-глицерофосфатдегидрогеназы (ГФДГ) и показатель фактора формы эллипса кластера фермента глутаматдегидрогеназы (ГДГ). Затем определяют коэффициент детерминации (р), и по величине р проводят дифференциацию на наличие у больного наследственной митохондриальной недостаточности р<1/2 или на принадлежность больного к наследственным заболеваниям с сопутствующей митохондриальной недостаточностью р>1/2. Использование способа позволяет улучшить дифференциальную диагностику наследственных болезней, связанных с различными формами полисистемных нарушений клеточного энергообмена у детей.

Способ диагностики полисистемной митохондриальной недостаточности у детей, включающий цитохимический анализ активности ферментов биоэнергетического обмена лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что определяют среднее количество мелких гранул фермента α-глицерофосфатдегидрогеназы (ГФДГ) и показатель фактора формы эллипса кластера фермента глутаматдегидрогеназы (ГДГ), исходя из полученных данных определяют коэффициент детерминации (р) по формуле

р=1/1+е^-z, где е - основание натурального логарифма 2,718, а

z=36,22-0,74A-39,12B,

где А - показатель среднего количества мелких гранул фермента ГФДГ;

В - показатель фактора формы эллипса кластеров фермента ГДГ, и по величине р проводят дифференциацию на наличие у больного наследственной митохондриальной недостаточности - р<1/2 или на принадлежность больного к наследственным заболеваниям с сопутствующей митохондриальной недостаточностью - р>1/2.