СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА У ДЕТЕЙ Российский патент 2008 года по МПК A61B10/00 G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии. Оно может быть использовано в клинике для диагностики острого пиелонефрита (ОП) у детей.

Известен способ диагностики ОП по клиническим признакам, согласно которому ОП дифференцируют от цистита, гломерулонефрита, интерстициального нефрита, наследственного нефрита и других заболеваний (Возианов А.Ф., Майданник В.Г., Бидный В.Г., Багдасарова И.В. Основы нефрологии детского возраста. - К.: Книга плюс, 2002. - С.22-91).

Известен способ диагностики пиелонефрита по определению уровня цитокинов, который выбран в качестве ближайшего аналога. Этот способ включает выявление повышения уровня цитокинов (фактора некроза опухоли-альфа, трансформирующего фактора роста-бета1) в плазме крови иммуноферментным методом (Хворостов И.Н., Смирнов И.Е., Зоркин С.Н., Кучеренко А.Г. Цитокины при обструктивных уропатиях у детей. // Вопросы современной педиатрии. - Приложение № 1: Сборник материалов Х Съезда педиатров России «Пути повышения эффективности медицинской помощи детям». - 2005. - Т.4. - С.572). Недостатком данного способа является его высокая стоимость.

Целью изобретения является повышение точности, эффективности и объективизация диагностики острого пиелонефрита, что обеспечит быстроту постановки диагноза, экономичность, а также своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.

Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что наряду с клиническими данными и исследованием мочи определяют уровень молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитов в периферической крови ребенка методом непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител и при содержании молекул CD11β более 26,34% и молекул CD54 более 33,26% диагностируют активную стадию ОП.

Выход клеток иммунной системы из сосудистого русла и миграция их в очаг проникновения инфекционных агентов являются ключевым этапом в системе защиты организма. Взаимодействие CD11β (Mac-1, интегрин, рецептор iC3b) с CD54 (ICAM-1, лиганд для LFA-1 и Мас-1) имеет важное значение в регуляции отдельного этапа адгезии лейкоцитов и их трансэндотелиальной миграции. ICAM-1 и его рецептор LFA-1 являются дополнительными факторами активации Т-лимфоцитов. Молекулы адгезии CD11β и CD54 индуцируются медиаторами воспаления, такими как IL-1, TNFα и IFNγ. Этим можно объяснить повышение уровня экспрессии молекул адгезии при микробно-воспалительном процессе в почках.

Способ осуществляется следующим образом: из пробы (4-5 мл) гепаринизированной крови, взятой натощак у больных детей, выделяют лимфоциты на градиенте фиколл-верографина, затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD11β, CD54) и инкубируют 30-45 мин при +4°С. Затем добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. После удаления супернатанта вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab˜)₂-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения используют раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4°С, затем клетки 2 раза отмывают как указано выше. Окрашенные клетки анализируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендируют, переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и препарат просматривают под иммерсией с увеличением (×3; объектив ×90). Количество антигенпозитивных клеток определяют как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами. При содержании молекул адгезии CD11β более 26,34% и молекул адгезии CD54 более 33,26% устанавливают активную стадию ОП.

ПРИМЕР.

Девочка Д., 5 лет. Больна 2 суток. Заболевание началось после переохлаждения с повышения температуры тела до 39,0°С, появления болей в животе, в поясничной области. При поступлении в стационар состояние средней тяжести, температура 39,0°С. Кожные покровы бледные, отеков и пастозности тканей нет. В легких везикулярное дыхание. ЧДД 20 в 1 мин. Тоны сердца удовлетворительной звучности. Пульс 120 в 1 мин, АД 100/60 мм рт.ст. Живот мягкий, болезненный при пальпации в области правого фланка. Область почек не изменена, почки не пальпируются, симптом Пастернацкого справа положительный. Стул оформленный. Мочеиспускания учащены до 10 раз в сутки, безболезненные.

В общем анализе крови нейтрофильный лейкоцитоз, увеличение СОЭ. Биохимический анализ крови: уровень общего белка, мочевины, креатинина в пределах нормы, С-реактивный белок - отриц. В общем анализе мочи - лейкоцитурия, оксалурия. Анализ мочи по Нечипоренко: лейкоциты - 15.750 в 1 мл (нейтрофилы 80%, лимфоциты 20%), эритроциты - 1000 в 1 мл. Бактериологическое исследование мочи: Е. coli 100000 КОЕ в 1 мл, чувствительна к ампициллину, цефтриаксону, цефтазидиму, гентамицину, нитрофурантоину. Снижена антикристаллобразующая способность мочи к оксалатам кальция. По результатам исследования клиренса по эндогенному креатинину, анализа мочи по Зимницкому - функция почек сохранена. УЗИ почек и мочевого пузыря: неоднородность центрального эхокомплекса за счет гиперэхогенных сигналов, эхопризнаки воспалительного процесса правой почки. Консультация гинеколога: признаков воспаления наружных половых органов не выявлено.

Уровень экспрессии молекул адгезии CD11β лимфоцитами периферической крови 36,00%, молекул CD54 - 46,00%.

Диагноз. Острый вторичный (дисметаболический) пиелонефрит, активная стадия. Функция почек сохранена.

Данные показывают, что молекулы CD11β и CD54 могут служить маркером активности микробно-воспалительного процесса при ОП.

Способ диагностики острого пиелонефрита у детей по уровню экспрессии молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитами периферической крови был апробирован на 14 детях с предварительным диагнозом острый пиелонефрит, поставленным на основании клинических признаков (основная группа).

Контрольную группу составили 30 детей с первой группой здоровья, с нормальными анализами крови и мочи. Всем обследованным производился забор крови и определение уровня экспрессии молекул CD11β и CD54 лимфоцитами периферической крови перечисленным выше способом.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице. Для обработки полученного материала и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки информации «STATGRAPHICS PLUS». Вычисляли среднюю и ошибку средней (М±m). Сравнение в исследованных группах проводили попарно при помощи параметрических методов, так как изучаемые выборки могли быть аппроксимированы нормальным законом распределения. Сравнение осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t) (сравнение средних) и Фишера (сравнение средних квадратических отклонений). Уровень достоверности оценивали значением р. Различия при сравнении считали достоверными с вероятностью более 95% при Р<0,05.

У здоровых детей молекулы адгезии CD11β экспрессируют не более 18,34% лимфоцитов периферической крови, молекулы CD54 - 22,41%.

Полученные данные показали, что при ОП уровень экспрессии молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитами периферической крови достоверно увеличивался, следовательно, молекулы CD11β и CD54 можно считать высокочувствительным маркером активности микробно-воспалительного процесса при ОП.

Использование предложенного способа диагностики имеет следующие преимущества:

1) высокую информативность для подтверждения активности микробно-воспалительного процесса при остром пиелонефрите;

2) быструю диагностику;

Таблица 1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА У ДЕТЕЙОстрый пиелонефрит (n=14)Здоровые (n=30)М±m (min, max)М±m (min, max)CD11β (%)CD54 (%)CD11β (%)CD54 (%)30,10±1,88*37,00±1,87*18,00±0,17*22,00±0,21*(26,34-33,86)(33,26-40,74)(17,66-18,34)(21,79-22,41)Примечание: * - p<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении

3) обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии и иммунологии. В периферической крови больных определяют методом непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител уровень экспрессии молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитов и при содержании молекул CD11β более 26,34% и молекул CD54 более 33,26% определяют активную стадию острого пиелонефрита. Способ прост и информативен. Он позволяет быстро и объективно в течение 2,5 часов после взятия крови оценить показатели адгезии лейкоцитов и их трансэндотелиальной миграции, отличается высокой информативностью для подтверждения активности микробно-воспалительного процесса при остром пиелонефрите, обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий. 1 табл.

Способ диагностики острого пиелонефрита, включающий исследование периферической крови, отличающийся тем, что определяют степень экспрессии лимфоцитами молекул адгезии CD11β и CD54 методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител и при содержании молекул CD11β более 26,34% и молекул CD54 более 33,26% считают наличие активности микробно-воспалительного процесса при остром пиелонефрите подтвержденным.