СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, гастроэнтерологии, иммунологии. Оно может быть использовано в клинике для дифференциальной диагностики тяжести течения язвенной болезни (ЯБ) у взрослых.

Известен способ диагностики тяжести течения ЯБ по числу обострений заболевания в течение года. Наличие у больных трех и более обострений за год позволяет считать заболевание с тяжелым течением. Однако субъективность оценки испытываемых ощущений больным может вести к ошибкам в диагностике тяжести заболевания, и следовательно, к выбору неправильной тактики лечения. Кроме того, впервые выявленное обострение ЯБ не позволяет оценить будущую тяжесть течения.

Есть способ диагностики тяжести ЯБ по степени обсеменения СОЖ Helicobacter pylori. Степень обсеменения оценивается по результатам нескольких биоптатов СОЖ, но обсеменение слизистой может быть неравномерной.

Предложен способ определения тяжести заболевания по состоянию фракций воды в составе биомакромолекул форменных элементов крови. Чем тяжелее течение у больных, тем наблюдается более выраженное снижение связанной и увеличение свободной фракций воды. Недостатками этого метода является неоднозначность интерпретации результатов, использование сложных, нетрадиционных методов исследования (Патент на изобретение №2312584, 2007, С.1).

ЯБ характеризуется различной этиологией, сложным патогенезом, с хроническим рецидивирующим течением, морфологическим эквивалентом в виде дефекта слизистого и подслизистого слоев с исходом в соединительнотканный рубец. У пациентов с тяжелым течением периоды ремиссии кратковременны, не более 3-4 месяцев в году, болевой и диспепсический синдромы выражены значительно. Это заболевание является причиной длительных страданий большого количества людей, значительно ухудшая качество их жизни. Кроме того, течение заболевания сопровождается высоким уровнем деструктивных и неопластических осложнений, приводящих к трудопотерям, инвалидизации, летальным исходам, что влечет за собой возрастание экономических убытков для всего общества.

В силу большого количества синдромальных клинических проявлений ЯБ для постановки диагноза необходимы клинические и биохимические анализы крови, анализ кала на скрытую кровь, гистологическое и цитологическое исследование биоптатов, уреазный тест, эзофагогастродуоденоскопию с прицельной биопсией и щеточным цитологическим исследованием, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и другие методы. Дополнительные исследования проводятся при подозрении на злокачественную язву, при наличии осложнений и сопутствующих заболеваний.

Эти методы исследования в сочетании с данными, полученными при изучении клинической картины и анамнеза, позволяют с большей достоверностью установить наличие ЯБ и тяжесть ее течения (Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. - М.: Триада-Х, 1998 - 483 с. Приказ Министерства здравоохранения СССР «о порядке проведения всеобщей диспансеризации населения» №770 от 30.05.1986 - С.62, (в редакции Приказа Минздрава РФ №270 от 12.09.1997), патент на изобретение №2312584, 2007, С.1).

Недостатками используемых методов диагностики ЯБ является большая продолжительность по времени, связанная с применением большого количества инструментальных и специальных методов исследования, травматичностью инвазивных методов, неоднозначностью интерпретации результатов, использование сложных, нетрадиционных методов исследования. Боли в животе и диспептические явления, связанные с погрешностью питания, могут восприниматься больным как очередное обострение, и напротив, слабая выраженность жалоб при очередном обострении может не привлекать внимание больного. Кроме того, большинство исследований отличаются высокой стоимостью, необходимостью привлечения консультирующих врачей других специальностей, нередким отсутствием в медицинской документации данных, содержащих полноценный анамнез.

Целью изобретения является повышение эффективности дифференциальной диагностики легкого, среднего и тяжелого течения ЯБ путем определения уровня экспрессии маркеров CD3, CD4 лимфоцитами периферической крови, что приводит к ускорению постановки диагноза, своевременному прогнозированию степени тяжести ЯБ, обеспечению большей экономичности и более рациональному выбору терапевтических мероприятий.

Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что у пациентов ЯБ определяют степень экспрессии лимфоцитами маркеров CD3, CD4 методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител и при уровне CD3=70,5-75,00% и CD4=36,2-41,0% диагностируют легкое течение ЯБ; при CD3=65,00-70,00% и CD4=33,5-36,0% - средней тяжести течение ЯБ, а при CD3=56,00-63,00% и CD4=29,0-33,0% - тяжелое течения ЯБ.

Количество Т-лимфоцитов и их субпопуляционный состав определяли по маркерам CD3, CD4. CD3 - представляет собой антигенспецифический Т-клеточный рецептор периферических Т-лимфоцитов человека. Связывание антигена, ассоциированного с детерминантами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), является специфическим сигналом для активации зрелой Т-клетки. При этом CD3 участвует в передаче сигнала внутрь клетки, характеризует активность воспалительного процесса по клеточному типу, который имеет место при ЯБ.

CD4 - антиген гликопротеиновой природы, который экспрессируется примерно на 2/3 периферических Т-лимфоцитах. Зрелые СD4-Т-клетки включают Т-лимфоциты, функционально характеризуемые как хелперы. Они запрограммированы индуцировать размножение и (или) дифференцировку клеток других типов, индуцировать секрецию антител В-лимфоцитами и стимулируют моноциты, тучные клетки и предшественники Т-киллеров к участию в клеточных иммунных реакциях. Все это играет важную роль в процессе антигенной стимуляции клетками, экспрессирующими молекулы ГКГС II. Иммунологические изменения, наблюдаемые за счет CD4 - хелперно-индукторной популяции, характеризуют активность воспалительного процесса по клеточному типу, который имеет место при ЯБ. В связи с этим определение уровня экспрессии лимфоцитами маркеров CD3, CD4 может служить диагностическим критерием дифференциальной диагностики тяжести течения ЯБ.

Способ осуществляется следующим образом: из пробы гепаринизированной крови (4-5 мл), взятой натощак у больных ЯБ, выделяют лимфоциты на градиенте фиколл-верографина. Затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в лунки 96-луночного кругло донного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD3, CD4) и инкубируют 30-45 мин при +4°С. Затем добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200g. После удаления супернатанта вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200g.

К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab~)2 - фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения используют раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4°С, затем клетки 2 раза отмывают как указано выше.

Окрашенные клетки анализируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендируют, переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, и препарат просматривают под иммерсией с увеличением (x3; объектив x90).

Количество антигенпозитивных клеток определяют как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами. По уровню экспрессии лимфоцитами маркеров CD3, CD4 судят о легком, среднем и тяжелом течении ЯБ.

ПРИМЕР 1

Больной Н. 32 года, водитель автобуса (совершает междугородные рейсы). Обратился в поликлинику для планового обследования. Жалоб не предъявляет. За медицинской помощью не обращался в течении 3-х лет.

Данные физического обследования: общее состояние удовлетворительное. Температура тела 36,6°С. Кожные покровы телесного цвета. Дыхание везикулярное, 18 в 1 мин. Ритм сердца правильный 60 в мин. АД 120/80 мм рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Печень, селезенка не увеличены.

Симптом Пастернацкого отрицательный. Физиологические отправления в норме.

Данные анамнеза: 3 года назад впервые установлен диагноз язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. Провели курс эрадикационной терапии. Больше обострений не было.

Данные дополнительных методов исследования: без особенностей.

На ФГДС признаки хронического гастрита.

Уреазный тест и микроскопия мазков отпечатков окрашенных по Граму биоптатов из антрального отдела и тела желудка: Helicobacter pylori типичные спиралевидные формы не выявляются.

Уровень экспрессии маркеров CD3=73,5%, CD4=40,00% лимфоцитами периферической крови. Т.е. CD3 входит в диапазон 70,5-75,00%, a CD4 -36,2-41,0%.

Диагноз: Язвенная болезнь 12 п.кишки, легкое течение, ремиссия.

ПРИМЕР 2

Больная Ж. 50 лет, секретарь. Обратилась в поликлинику с жалобами на боль в эпигастральной области ночью, изжогу, тошноту. Указанные жалобы беспокоят в течение 8 дней. За медицинской помощью не обращалась, самостоятельно не лечилась.

Данные физического обследования: общее состояние средней тяжести. Температура тела 36,6°С. Кожные покровы телесного цвета. Дыхание везикулярное, 18 в 1 мин. Ритм сердца правильный 68 в мин. АД 110/70 мм рт.ст. Язык сухой, обложен белым налетом. Живот мягкий, болезненный в эпигастрии и зоне проекции привратника (на 2 см вправо от пупка). Печень, селезенка не увеличены. Симптом Пастернацкого отрицательный. Мочеиспускание в норме. Стул склонный к запорам.

Данные анамнеза: на протяжении 4-5 лет отмечает обострения 2 раза в год, преимущественно весной и осенью. Самостоятельно принимает ультоп.

Данные дополнительных методов исследования.

OAK, ОАМ в норме.

УЗИ органов брюшной полости: без видимой патологии.

Анализ кала на скрытую кровь (реакция Грегерсена): отрицательный.

ФГДС: язва луковицы двенадцатиперстной кишки. Рубцовая деформация луковицы двенадцати перстной кишки 1 степени.

Уреазный тест: Helicobacter pylori положительный.

Микроскопия мазков отпечатков окрашенных по Граму биоптатов из антрального отдела и тела желудка: Helicobacter pylori типичные спиралевидные формы в большом количестве.

Уровень экспрессии маркеров CD3 68,49%, CD4 35,00% лимфоцитами периферической крови. Т.е. CD3 входит в диапазон 65,00-70,00%, a CD4 - 33,5-36,0%.

Диагноз: Язвенная болезнь с локализацией язвы в луковице 12 п.кишки, средней тяжести течения, 2-й степени выраженности, стадия обострения. Осложнение: рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки 1 степени.

ПРИМЕР 3

Больной А. 46 лет, водитель такси. Обратился в поликлинику с жалобами на умеренную боль в эпигастральной области, возникающую через 1,5-2 часа после приема пищи, и ночные боли, прекращающиеся после еды, изжогу, тошноту. Указанные жалобы беспокоят в течении 6 дней. За медицинской помощью не обращался, самостоятельно принимал но-шпу и соду, которые давали кратковременный эффект. Курит по 20 сигарет в день.

Данные физического обследования: общее состояние средней тяжести. Температура тела 36,6°С. Кожные покровы телесного цвета. Дыхание везикулярное, 18 в 1 мин. Ритм сердца правильный 68 в мин. АД 110/70 мм рт.ст. Язык обложен белым налетом. Живот мягкий, болезненный в эпигастрии и зоне проекции привратника (на 2 см вправо от пупка). Печень, селезенка не увеличены. Симптом Пастернацкого отрицательный. Физиологические отправления в норме.

Данные анамнеза: 3 года назад впервые установлен диагноз язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. Лечение на момент осмотра: омез 20 мг - 2 р/д 10 дней, алмагель по 1 столовой ложке через час после еды 5 дней. Больше за медицинской помощью не обращался. 3-4 раза в год отмечает вышеперечисленные симптомы. Самостоятельно принимал омез, ранитидин.

Данные дополнительных методов исследования.

Общий анализ крови: Нв 140 г/л, Эр 4,1*10¹²/л, Л 7,2*10⁹/л, СОЭ 7 мм/час. Общий анализ мочи: удельный вес 1020, цвет соломенно-желтый, реакция кислая, Л 1-2 в п/зр, Эр 0-1 в п/зр.

ЭКГ: ритм синусовый, ЧСС 72 в мин, нормальное положение ЭОС.

ККФ: легочные поля прозрачные, сердце без видимой патологии.

УЗИ органов брюшной полости: без видимой патологии.

Анализ кала на скрытую кровь (реакция Грегерсена): отрицательный.

ФГДС: язва луковицы двенадцатиперстной кишки 0,4*0,6 см, хронический эрозивный гастрит, бульбит. Рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки 2-3 степени.

Уреазный тест: Helicobacter pylori резко положительный. Микроскопия мазков отпечатков окрашенных по Граму биоптатов из антрального отдела и тела желудка: Helicobacter pylori типичные спиралевидные формы в очень большом количестве.

Уровень экспрессии маркеров CD3=60,00%, CD4=31,00% лимфоцитами периферической крови. Т.е. CD3 входит в диапазон 56,00-63,00%, a CD4 - 29,0-33,0%.

Диагноз: Язвенная болезнь с локализацией язвы в луковице 12 п. кишке, тяжелое течение, 2 степени выраженности, стадия обострения.

Сопутствующий: хронический эрозивный гастрит.

Осложнение: рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки 2-3 степени.

Уровень маркеров с легким течения ЯБ находится в диапазоне CD3 70,5-75,00%, CD4 36,2-41,0%, с средним течением ЯБ - CD3 65,00-70,00%, CD4 33,5-36,0%, с тяжелым течением CD3 56,00-63,00%, CD4 29,0-33,0%.

Способ диагностики язвенной болезни по уровню экспрессии маркеров CD3, CD4 лимфоцитами периферической крови был апробирован на группах сравнения между 38 пациентами легкой степени тяжести ЯБ, 45 пациентами со средней степенью тяжести ЯБ, 10 пациентами с тяжелым течением ЯБ. Диагноз был подтвержден основными методами исследования.

Всем обследованным производился забор крови и определение уровня экспрессии маркеров CD3, CD4 лимфоцитами периферической крови вышеперечисленным способом.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице.

Для обработки полученного материала и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки информации «STATGRAPHICS PLUS». Вычисляли среднюю и ошибку средней (M±m). Сравнение в исследованных группах проводили попарно при помощи параметрических методов, так как изучаемые выборки могли быть аппроксимированы нормальным законом распределения. Сравнение осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t) (сравнение средних) и Фишера (сравнение средних квадратических отклонений). Уровень достоверности оценивали значением «р». Различия при сравнении считали достоверными с вероятностью более 95% при р<0,05.

Таким образом, полученные данные показали, что при тяжелом течении ЯБ уровень маркеров CD3, CD4 периферической крови достоверно снижается по сравнению с легким и средним течением ЯБ, следовательно, уровень экспрессии молекул CD3, CD4 лимфоцитами периферической крови можно считать высокочувствительными маркерами для дифференциальной диагностики тяжести течении ЯБ.

Использование предложенного способа диагностики имеет следующие преимущества:

1) высокую информативность для дифференциальной диагностики тяжести течения язвенной болезни за счет определения уровня экспрессии молекул CD3, CD4 лимфоцитами периферической крови;

2) своевременное прогнозирование тяжести течения ЯБ, т.к это обеспечит экономичность, а также рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий пациентам с ЯБ;

3) быструю диагностику, т.к необходимо только определить уровень экспрессии маркеров CD3, CD4 лимфоцитами периферической крови;

4) благодаря быстрой диагностике обеспечивается своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.

Таблица СПОСОБ ДИФФЕРИНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ   CD3 (%) М±m (min, max) CD4 (%) M±m (min, max) легкое течение(n=38) 70,03±1,18*
(70,50-75,0) 37,05±0,88*
(36,2-41,0) среднее течение(n=45) 68,49±1,10*/**
(65,0-70,0) 35,2±0,94*/**
(33,5-36,0) тяжелое течение (n=10) 60,8±1,9**
(56,00-63,00) 32,2±1,42**
(29,0-33,0) Примечание: * - р<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении с тяжелым течением ЯБ. **- р<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении с легким течением ЯБ.

Изобретение относится к медицине и предназначено для дифференциальной диагностики тяжести течения язвенной болезни (ЯБ). У пациентов ЯБ методом непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител определяют уровень экспрессии маркеров CD3, CD4 лимфоцитами периферической крови. При значении CD3 70,5-75,00% и CD4 36,2-41,0% диагностируют наличие легкого течения ЯБ; при CD3 65,00-70,00% и CD4 33,5-36,0% - среднего течения ЯБ, а при CD3 56,00-63,00% и CD4 29,0-33,0% - тяжелого течения ЯБ. Способ позволяет своевременно определить тяжесть течения ЯБ, в том числе при впервые возникшем заболевании. 3 пр., 1 табл.

Способ дифференциальной диагностики тяжести течения язвенной болезни, включающий исследование периферической крови, отличающийся тем, что проводят определение степени экспрессии лимфоцитами маркеров CD3, CD4 методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител и при содержании в периферической крови маркеров CD3 в диапазоне 70,5-75,00% и CD4 36,2-41,0% диагностируют легкое течение язвенной болезни, при CD3 65,00-70,00% и CD4 33,5-36,0% - среднее течение, а при CD3 56,00-63,00% и CD4 29,0-33,0% - тяжелое течение.