СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ Chlamydophila pneumoniae И Mycoplasma pneumoniae У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА, БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ РЕСПИРАТОРНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ С БРОНХООБСТРУКТИВНЫМ СИНДРОМОМ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии.

Известен способ оценки эффективности антибактериальной терапии С.pneumoniae и М.pneumoniae методом иммуноферментного анализа, который основан на определении в сыворотке крови больных титров родоспецифичных IgG, IgM, IgA к белкам наружной мембраны бактерий. Метод позволяет определить стадию заболевания, обосновать необходимость антибактериального лечения и оценить его эффективность. По сравнению с микробиологическими методами, ИФА обладает преимуществом автоматизации, высокой пропускной способности, не требует применения высококвалифицированной экспертизы, что и является причиной его широкого использования для эпидемиологической оценки распространенности респираторного хламидиоза и микоплазмоза (Кротов С.А., Кротова В.А., Юрьев С.Ю. Хламидиозы: эпидемиология, характеристика возбудителя, методы лабораторной диагностики, лечение генитального хламидиоза - Кольцово, ЗАО «Вектор-Бест» - 2000 - 36 с.).

К недостаткам метода относятся: относительно невысокая специфичность анализа, отсутствие у больных с гипогаммаглобулинемией антител в диагностическом уровне или наличие диагностического уровня антител в течение длительного времени (до 4-6 мес.) у некоторых больных после окончания курса антибактериальной терапии. Кроме того, этиотропное лечение внутриклеточных инфекций не всегда приводит к полной эрадикации возбудителя из организма. Также доступные специфические методики выявления возбудителей могут давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты обследования. Поэтому в настоящее время очень сложно практическому врачу оценить динамику сочетания уровня антител и клинического состояния больного: остается подчас нерешенным вопрос: «Продолжать или нет антибактериальную терапию?» Таким образом, на сегодняшний день отсутствуют критерии, учитывающие состояние иммунной системы при внутриклеточных инфекциях, роль которых в патогенезе заболевания велика. Поэтому разработка ранних иммунологических критериев эффективности антибактериальной терапии внутриклеточных инфекций является актуальной.

Задачей изобретения явилось более раннее определение излеченности детей раннего возраста, перенесших острые респираторные заболевания с бронхообструктивным синдромом на фоне хламидийной и микоплазменной инфекций.

Сущность изобретения состоит в том, что в периферической крови больных острыми респираторными заболеваниями с бронхообструктивным синдромом на фоне инфицированности Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae определяют методом непрямой иммунофлюоресценции субпопуляционный состав лимфоцитов и при снижении содержания маркеров ранней активации Т-лимфоцитов CD71⁺-лимфоцитов до 3,92% и менее и CDDR⁺-лимфоцитов до 28,55% и менее через 3-4 недели после окончания лечения антибактериальную терапию, направленную на эрадикацию возбудителя, следует считать эффективной.

Способ осуществляется следующим образом: из пробы (4-5 мл) гепаринизированной крови, взятой натощак у детей, больных острыми респираторными инфекциями с бронхообструктивным синдромом, до антибактериальной терапии и через 3-4 недели после ее окончания выделяли лимфоциты на градиенте фиколл-верографина, затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносили в лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляли 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD71⁺, CDDR) и инкубировали 30-45 мин при +4°С. Затем добавляли 150 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 200 g. После удаления супернатанта вносили 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендировали, добавляли 150 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 200 g. К осадку отмытых клеток добавляли 50 мкл F(ab~)₂-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения использовали раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендировали и инкубировали 30 мин при +4°С, затем клетки 2 раза отмывали, как указано выше. Окрашенные клетки анализировали с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендировали, переносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом, и препарат просматривали под иммерсией с увеличением (х3; объектив х90). Количество антигенпозитивных клеток определяли как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами.

До лечения содержание CD71⁺-лимфоцитов у детей, больных ОРЗ с БОС на фоне инфицированности С.pneumoniae и М.pneumoniae, составляло 5,70±0,25%, a CDDR-лимфоцитов - 31,45±1,06%, а через 3-4 недели после антибактериальной терапии, направленной на эрадикацию С.pneumoniae и М.pneumoniae, содержание CD71⁺- и CDDR-лимфоцитов снижалось и составляло 3,92% и менее и 28,55% и менее соответственно, p<0,05, что позволило считать проведенную терапию эффективной.

Поэтому иммунологические критерии оценки эффективности антибактериальной терапии хламидийной и микоплазменной инфекций являются более доступными и достоверными, позволяющими оценить результаты терапии уже через 3-4 недели от последнего приема антибактериального препарата.

Пример 1. Больная К., 1 г. 10 мес. Мать обратилась с жалобами на повышение температуры тела до 37,7°C, частый, сухой кашель, затрудненное носовое дыхание, одышку в покое, с затрудненным выдохом. Больна в течение 2 дней. Из анамнеза известно, что в возрасте 5 мес. у ребенка отмечался эпизод острого респираторного заболевания с бронхообструктивным синдромом. Этиотроппную терапию не получала. При объективном исследовании выявляется одышка экспираторного характера без участия в акте дыхания вспомогательной мускулатуры, перкуторно-коробочный оттенок перкуторного звука, при аускультации - на фоне жесткого дыхания, сухие «свистящие» хрипы над всей поверхностью легких. В общем анализе крови отмечается незначительный нейтрофильный лейкоцитоз, нормальные показатели СОЭ. В иммунограмме - повышение содержания общего IgE в сыворотке крови до 241,2 МЕ/мл. Содержание CD71⁺- и CDDR-лимфоцитов составило 5,7% и 31,4% соответственно. Также выявлено содержание IgM в титре 1:200 (положительный) и IgG в титре 1:20 (сильноположительный) к С.pneumoniae. Больная получала антибактериальную терапию сумамедом в возрастной дозе (в первые сутки 10 мг/кг однократно, во 2-5 сутки - 5 мг/кг в сутки также однократно) в течение 5 дней. Отмечалась положительная клиническая динамика: улучшение общего самочувствия, купирование симптомом интоксикации, нормализация температуры тела, исчезновение респираторного синдрома, одышки и сухих хрипов в легких. Через 3 недели при контрольном обследовании было выявлено содержание CD71⁺- и CDDR-лимфоцитов 3,3% и 26,4% соответственно, при сохранении уровня антител IgG к С.pneumoniae 1:10 (положительный), IgM сомнительный. Повторно курс антибактериальной терапии не проводился. При повторном обследовании через 2 месяца (через 3 месяца после окончания заболевания) содержание CD71⁺- и CDDR-лимфоцитов 3,21% и 26,2% соответственно, при отсутствии антител к С.pneumoniae и М.pneumoniae.

Пример 2. Больная А., 2 г., 8 мес. Мать обратилась с жалобами на повышение температуры тела до 38,4°C, сухой кашель, одышку в покое, с затрудненным выдохом. Больна первые сутки. В анамнезе с 7 мес. возраста отмечалось 3 эпизода острого респираторного заболевания с бронхообструктивным синдромом. Обследования и этиотропная терапия не проводились. При объективном исследовании выявляется одышка экспираторного характера с участием в акте дыхания вспомогательной мускулатуры, перкуторно-коробочный оттенок перкуторного звука, при аускультации - жесткое дыхание, обилие сухих «свистящих» хрипов над всей поверхностью легких. В общем анализе крови отмечается нейтрофильный лейкоцитоз, нормальные показатели СОЭ. В иммунограмме - повышение содержания общего IgE в сыворотке крови до 244,9 МЕ/мл. Содержание CD71⁺- и CDDR-лимфоцитов составило 5,5% и 30,8% соответственно. IgG в титре 1:10 (положительный), IgM в титре 1:200 (положительный) к С.pneumoniae; антитела к М.pneumoniae не определялись. Больная получала антибактериальную терапию сумамедом в возрастной дозе (в первые сутки 10 мг/кг однократно, во 2-5 сутки - 5 мг/кг в сутки также однократно) в течение 5 дней. Отмечалась положительная клиническая динамика: купированы симптомы интоксикации, респираторный и бронхообструктивный синдром. Через 4 недели при контрольном обследовании было выявлено содержание CD71⁺- и CDDR-лимфоцитов 3,4% и 25,1% соответственно, при отсутствии антител к С.pneumoniae и М.pneumoniae.

Всего указанным способом обследовано 152 ребенка раннего возраста (от 1 до 3-х лет) с острыми респираторными заболеваниями с бронхообструктивным синдромом. Из них у 77 была выявлена С.pneumoniae, у 6 - М. pneumoniae, у 17 выявлена ассоциация С.pneumoniae и М.pneumoniae. После лечения у всех детей нормализовались показатели иммунной системы при различном уровне антител к внутриклеточным возбудителям (см. табл., где представлена динамика изменения содержания CD71 и CDDR-лимфоцитов в периферической крови детей раннего возраста, больных острыми респираторными заболеваниями с бронхообструктивным синдромом после эффективной антибактериальной терапии).

В норме содержание CD71⁺- и CDDR-лимфоцитов составляет 26,52±1,01% и 3,43±0,24% соответственно.

Предлагаемый способ прост и информативен. Он позволяет быстро и объективно в течение 2,5 часов после взятия крови оценить состояние иммунной системы при хламидийной инфекции (С.pneumoniae) и микоплазменной инфекции (М.pneumoniae), ассоциированной с острыми респираторными заболеваниями с бронхообструктивным синдромом. Это важно для установления необходимости дальнейшего лечения, выбора препарата и оценки эффективности антибактеральной терапии.

Обследуемые дети CD71⁺ (M±m; min; max), % CDDR⁺ (M±m; min; max), % До лечения (n=100) дети с ОРЗ и БОС, инфицированные С.pneumoniae и М.pneumoniae 5,70±0,25* (5,18-6,23) 31,45±1,06* (29,33-33,57) После лечения (n=100) дети с ОРЗ и БОС, инфицированные С.pneumoniae и М.pneumoniae 3,43±0,24 (2,95-3,92) 26,52±1,01 (24,48-28,55) Группа сравнения (n=52) дети с ОРЗ и БОС через 1 мес. после выписки 4,14±0,23 (3,57-4,67) 26,41±1,17 (24,07-28,76) Примечание: * - различия в группах до и после лечения достоверны p<0,05

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии, и может быть использовано для оценки эффективности антибактериальной терапии С. pneumoniae и М. pneumoniae у детей раннего возраста, больных острыми респираторными заболеваниями с бронхообструктивным синдромом. Для этого определяют субпопуляционный состав лимфоцитов и при снижении содержания CD71-лимфоцитов менее 3,92% и CDDR-лимфоцитов менее 28,55% через 3-4 недели после окончания лечения антибактериальную терапию считают эффективной. Использование данного способа позволяет быстро и объективно оценить состояние иммунной системы, что важно для установления необходимости дальнейшего лечения, выбора препарата и оценки эффективности антибактериальной терапии. 2 пр., 1 табл.

Способ оценки эффективности антибактериальной терапии С. pneumoniae и М. pneumoniae у детей раннего возраста, больных острыми респираторными заболеваниями с бронхообструктивным синдромом путем иммунологического анализа периферической крови, отличающийся тем, что определяют методом непрямой иммунофлюоресценции субпопуляционый состав лимфоцитов и при содержании CD71⁺-лимфоцитов менее 3,92% и CDDR⁺-лимфоцитов менее 28,55% через 3-4 недели после окончания лечения антибактериальную терапию, направленную на эрадикацию возбудителя, считают эффективной.