Изобретение относится к биотехнологии, в частности к модифицированным токсинам Cry3А и кодирующим их нуклеотидным последовательностям. Встраивают сайт, распознаваемый катепсином G, который может распознаваться кишечной протеазой насекомого-мишени, по меньшей мере, в один из участков нуклеиновой кислоты, кодирующий токсин Cry3А. Создают химерную конструкцию для трансформации бактериальной или растительной клетки, содержащую одну из модифицированных нуклеотидных последовательностей и рекомбинантный вектор, содержащий данную химерную конструкцию. Получают трансгенное растение кукурузы, которое включает указанную нуклеотидную последовательность и которое проявляет устойчивость к блошке длинноусой западной или блошке длинноусой северной. Изобретение позволяет эффективно бороться с вредителями, в частности с блошкой длинноусой западной или блошкой длинноусой северной. 7 н. и 41 з.п. ф-лы, 3 табл.
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный токсин Cry3А, включающий не встречающийся в естественных условиях сайт, распознаваемый протеазой катепсином G, где сайт, распознаваемый протеазой, модифицирует токсин Cry3А и локализован по меньшей мере в одном положении, выбранном из ряда, включающего
а) положение между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 107 и 115 SEQ ID NO: 4; и
б) положение между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 536 и 542 SEQ ID NO: 4;
где сайт, распознаваемый протеазой, распознается кишечной протеазой блошки длинноусой западной и где по данным биологического анализа с использованием искусственной питательной среды модифицированный токсин Cry3А вызывает более высокий уровень смертности блошки длинноусой западной или блошки длинноусой северной, чем уровень смертности блошки длинноусой западной или блошки длинноусой северной, вызываемый токсином Cry3А.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 115 SEQ ID NO: 4.3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 113 SEQ ID NO: 4.4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4.5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 536 и 542 SEQ ID NO: 4.6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 536 и 541 SEQ ID NO: 4.7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 540 и 541 SEQ ID NO: 4.8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 115 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 536 и 542 SEQ ID NO: 4.9. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 113 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 540 и 541 SEQ ID NO: 4.10. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 536 и 541 SEQ ID NO: 4.11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 540 и 541 SEQ ID NO: 4.12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где модифицированный токсин Cry3А вызывает по меньшей мере 50%-ную смертность блошки длинноусой западной, в то время как токсин Cry3А вызывает смертность, не превышающую 30%.13. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где нуклеотидная последовательность включает открытую рамку считывания SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 8, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 16, или SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 20.14. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где модифицированный токсин Cry3А содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 17, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO:21.15. Химерная конструкция для трансформации бактериальной или растительной клетки, включающая гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты по п.1.16. Рекомбинантный вектор для экспрессии химерной конструкции по п.15 в бактериальной или растительной клетке.17. Трансгенное растение кукурузы, которое включает нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный токсин Cry3А, включающий не встречающийся в естественных условиях сайт, распознаваемый протеазой катепсином G, где сайт, распознаваемый протеазой, модифицирует токсин Cry3А и локализован по меньшей мере в одном положении, выбранном из ряда, включающегоа) положение между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 107 и 115 SEQ ID NO: 4; и
б) положение между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 536 и 542 SEQ ID NO: 4;
где сайт, распознаваемый протеазой, распознается кишечной протеазой блошки длинноусой западной и где трансгенное растение экспрессирует модифицированный токсин Cry3А в корневой ткани, в количестве, достаточном для того, чтобы вызывать смертность блошки длинноусой западной или блошки длинноусой северной.
18. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4.19. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 540 и 541 SEQ ID NO: 4.20. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 540 и 541 SEQ ID NO: 4.21. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где нуклеотидная последовательность включает нуклеотиды 1-1806 SEQ ID NO: 8, нуклеотиды 1-1816 SEQ ID NO: 14 или нуклеотиды 1-1791 SEQ ID NO: 18.22. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где модифицированный токсин Cry3А содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 19.23. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где корневая ткань вызывает 100%-ную смертность блошки длинноусой западной.24. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где корневая ткань вызывает 90%-ную смертность блошки длинноусой западной.25. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где корневая ткань вызывает 80%-ную смертность блошки длинноусой западной.26. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где корневая ткань вызывает 70%-ную смертность блошки длинноусой западной.27. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где корневая ткань вызывает 60%-ную смертность блошки длинноусой западной.28. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где корневая ткань вызывает 50%-ную смертность блошки длинноусой западной.29. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где корневая ткань вызывает 40%-ную смертность блошки длинноусой западной.30. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где трансгенное растение экспрессирует модифицированный токсин Cry3А в количестве, достаточном для того, чтобы препятствовать серьезному подгрызанию корней трансгенного растения блошкой длинноусой западной.31. Трансгенное растение кукурузы по п.17, где трансгенное растение экспрессирует модифицированный токсин Cry3А в количестве, достаточном для того, чтобы препятствовать повреждению, связанному с питанием на нем блошки длинноусой, которое вызывает полегание растения.32. Трансгенное растение кукурузы по одному из пп.17-31, представляющее собой инбредное или гибридное растение.33. Трансгенный семенной материал трансгенного растения по п.32, где указанные семена содержат молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-14.34. Модифицированный токсин Cry3А, который включает не встречающийся в естественных условиях сайт, распознаваемый протеазой катепсином G, где сайт, распознаваемый протеазой, модифицирует токсин Cry3А и локализован по меньшей мере в одном положении, выбранном из ряда, включающегоа) положение между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 107 и 115 SEQ ID NO:4; и
б) положение между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 536 и 542 SEQ ID NO: 4;
где сайт, распознаваемый протеазой, распознается кишечной протеазой блошки длинноусой западной и по данным биологического анализа с использованием искусственной питательной среды модифицированный токсин Cry3А вызывает более высокий уровень смертности блошки длинноусой западной или блошки длинноусой северной, чем уровень смертности блошки длинноусой западной или блошки длинноусой северной, вызываемый токсином Cry3А.
35. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 115 SEQ ID NO: 4.36. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 113 SEQ ID NO: 4.37. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4.38. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 536 и 542 SEQ ID NO: 4.39. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, расположен между аминокислотами 536 и 541 SEQ ID NO: 4.40. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 540 и 541 SEQ ID NO: 4.41. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 115 и между аминокислотами 536 и 542 SEQ ID NO: 4.42. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 113 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 536 и 541 SEQ ID NO: 4.43. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 536 и 541 SEQ ID NO: 4.44. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где сайт, распознаваемый протеазой, локализован между аминокислотами 107 и 111 SEQ ID NO: 4 и между аминокислотами 540 и 541 SEQ ID NO: 4.45. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, где модифицированный токсин Cry3А вызывает по меньшей мере 50%-ную смертность блошки длинноусой западной, в то время как токсин Cry3А вызывает смертность, не превышающую 30%.46. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, который кодируется открытой рамкой считывания, содержащейся в SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 8, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 16, или SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 20.47. Модифицированный токсин Cry3А по п.34, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 17, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 21.48. Способ получения модифицированного токсина Cry3А, предусматривающий(а) получение гена cry3А, кодирующего токсин Cry3А;
(б) идентификацию кишечной протеазы блошки длинноусой западной;
(в) получение нуклеотидной последовательности, которая кодирует сайт, распознаваемый кишечной протеазой;
(г) встраивание нуклеотидной последовательности в ген cry3А, таким образом, чтобы распознаваемый сайт был локализован в токсине Cry3А по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, включающей положение между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 107 и 115 SEQ ID NO: 4, и в положении между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 536 и 542 SEQ ID NO: 4, получая тем самым модифицированный ген cry3А;
(д) встраивание модифицированного гена cry3А в кассету экспрессии;
(е) трансформацию кассетой экспрессии клетки-хозяина организма, кроме человека, где клетка-хозяин продуцирует модифицированный токсин Cry3А.
