ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/199,024, поданной 30 июля 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Файл с именем "MONS394WO-sequence_listing.txt", содержащий машиночитаемую форму списка последовательностей, был создан 19 июля 2016 года. Этот файл составляет 16,077 байт (измеренный в MS-Windows®), одновременно подан в электронной форме (с использованием системы регистрации EFS-Web Патентного ведомства США) и полностью включается в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Данное изобретение в целом относится к области белков, обладающих ингибиторной активностью в отношении насекомых. Раскрывается новый класс белков, проявляющих инсектицидную ингибирующую активность против сельскохозяйственных вредителей сельскохозяйственных культур и семян. В частности, описанный белок является инсектицидно активным в отношении вредителей сельскохозяйственных культур и семян, в частности видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых-вредителей. Предлагаются растения, части растений и семена, содержащие рекомбинантный полинуклеотидный конструкт, кодирующий один или более описанных белков токсина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Все большее значение приобретает повышение урожайности сельскохозяйственных культур, включая, среди прочего, кукурузу, сою, сахарный тростник, рис, пшеницу, овощи и хлопок. По прогнозам, в дополнение к растущей потребности в сельскохозяйственной продукции для обеспечения пищей, одеждой и обеспечения энергией растущего населения, климатическим последствиям и давления со стороны растущего населения на использование земли, отличной от сельскохозяйственной, уменьшается количество доступных пахотных земель для ведения сельского хозяйства. Данные факторы привели к неоптимистичным прогнозам продовольственной безопасности, особенно в условиях отсутствия значительных улучшений в области биотехнологии растений и агрономических приемов. В свете данных факторов, экологически устойчивые усовершенствования в области технологий, агротехники и борьбы с вредителями являются жизненно важными инструментами для расширения производства сельскохозяйственных культур на ограниченном количестве пахотных земель, доступных для ведения сельского хозяйства.
[0005] Насекомые, особенно насекомые в пределах отряда чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых считаются основной причиной повреждения полевых культур, тем самым снижая урожайность культур в зараженных районах. Виды чешуекрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicosta и Phyllocnistis citrella. Виды жесткокрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. и Trogoderma spp, в частности, в которых вредителем является Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный жук, WCR), Diabrotica barberi (северный кукурузный жук, NCR), Diabrotica virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук, MCR), Diabrotica balteata (бразильский кукурузный жук (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (южный кукурузный жук, SCR) и группа бразильского кукурузного жука (BCR), состоящая из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa). Виды полужесткокрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: Lygus hesperus, Lygus lineolaris и Pseudatomoscelis seriatus.
[0006] Исторически сложилось так, что интенсивное применение синтетических химических инсектицидов использовалось в качестве средства борьбы с вредителями в сельском хозяйстве. Обеспокоенность по поводу окружающей среды и здоровья человека, помимо возникающих проблем с устойчивостью, стимулировала исследования и разработку биологических пестицидов. Данное исследование привело к прогрессивному открытию и применению различных энтомопатогенных видов микроорганизмов, включая бактерии.
[0007] Парадигма биологических методов борьбы изменилась, когда был открыт потенциал энтомопатогенных бактерий, особенно бактерий, относящихся к роду Bacillus, и применен в разработке агентов для биологической борьбы с вредителями. Штаммы бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) использовали в качестве источника пестицидных белков, так как было обнаружено, что штаммы Bt проявляют высокую токсичность против конкретных насекомых. Известно, что штаммы Bt продуцируют дельта-эндотоксины, которые локализованы в параспоральных кристаллических тельцах включения в начале споруляции и во время фазы стационарного роста (например, белки Cry) и также известно, что они продуцирует секретируемый инсектицидный белок. При проглатывании восприимчивым насекомым, дельта-эндотоксины, а также секретируемые токсины оказывают свое действие на поверхность эпителия средней кишки, разрушают клеточную мембрану, приводя к разрушению и гибели клеток. Гены, кодирующие инсектицидные белки, также были идентифицированы у бактериальных видов, отличных от Bt, в том числе другие Bacillus и множество других видов бактерий, таких как Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus ("Ls" ранее известный как Bacillus sphaericus) и Paenibacillus popilliae.
[0008] Кристаллические и секретируемые растворимые инсектицидные токсины являются высокоспецифичными для их хозяев и получили мировое признание как альтернативы химическим инсектицидам. Например, инсектицидные белки-токсины применяют в различных сельскохозяйственных целях для защиты хозяйственно-ценных растений от заражения насекомыми, уменьшения потребности в применении химических пестицидов и повышения урожайности. Инсектицидные белки-токсины применяют для борьбы с сельскохозяйственными вредителями культурных растений механизированными способами, такими как распыление дисперсных микробных препаратов, содержащих различные штаммы бактерий, на поверхности растений, и с использованием методов генетической трансформации для получения трансгенных растений и семян, экспрессирующих инсектицидный белок-токсин.
[0009] Применение трансгенных растений, экспрессирующих инсектицидные белки-токсины, признано в мировом масштабе. Например, в 2012 году 26,1 миллиона гектаров были засажены трансгенными культурами, экспрессирующими токсины Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. Краткое содержание отчета ISAAA (Международная служба по сбору сведений о применении биотехнологий в сельском хозяйстве) № 44). Глобальное применение трансгенных культур, защищенных от насекомых, и ограниченное количество инсектицидных белков-токсинов, применяемых для этих культур, создало давление отбора для существующих аллелей насекомых, которые придают устойчивость к применяемым в настоящее время инсектицидным белкам.
[0010] Развитие резистентности у целевых вредителей к инсектицидным белкам-токсинам создает постоянную потребность в открытии и разработке новых форм инсектицидных токсичных белков, которые полезны для контроля над повышением резистентности насекомых к трансгенным культурам, экспрессирующим инсектицидные белки-токсины. Новые белковые токсины с повышенной эффективностью, и которые контролируют более широкий спектр восприимчивых видов насекомых, уменьшают число выживших насекомых, которые могут развить резистентные аллели. Кроме того, применение в одном растении двух или более трансгенных инсектицидных белков-токсинов, токсичных для одного и того же насекомого-вредителя и демонстрирующих различные способы воздействия, снижает вероятность резистентности у любых отдельных целевых видов насекомых.
[0011] Таким образом, авторы данного изобретения раскрывают новое семейство белковых токсинов от Bacillus thuringiensis вместе с подобными белками-токсинами, вариантными белками и типовыми рекомбинантными белками, которые проявляют инсектицидную активность к целевым видам чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых вредителей, в частности, к западному кукурузному жуку.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] В данном документе описана новая группа белков с ингибирующей активностью по отношению к насекомым (белки-токсины), упоминаемые в данном документе как TIC5290, которые, как показано, проявляют ингибирующую активность против одного или более вредителей сельскохозяйственных растений. TIC5290 белок и белки в классе белка-токсина TIC5290 могут применяться отдельно или в сочетании с другими инсектицидными белками и токсичными веществами в препаратах и in planta, таким образом обеспечивая альтернативы инсектицидным белкам и химии инсектицидов, которые в настоящее время используются в сельскохозяйственных системах.
[0013] В одном варианте реализации изобретения в данной заявке представлена молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, в котором: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (d) указанный полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, содержит полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности последовательности к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (e) указанная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с вектором, и указанный вектор выбирают из группы, состоящей из плазмиды, фагмиды, бакмиды, космиды и бактериальной или дрожжевой искусственной хромосомы. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, которая функционирует для экспрессии пестицидного белка в растении; или экспрессируется в растительной клетке для получения пестицидно эффективного количества пестицидного белка.
[0014] В другом варианте реализации изобретения данной заявки присутствуют клетки-хозяева, содержащие молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты данной заявки, причем клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной и растительной клетки. Рассматриваемые клетки-хозяева включают в себя Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea и Erwinia. В определенных вариантах реализации изобретения указанными видами Bacillus являлись Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанным Brevibacillus являлся Brevibacillus laterosperus, или указанным Escherichia являлся Escherichia coli. Рассматриваемые клетки-хозяева растений включают в себя клетку двудольных и клетку однодольных. Дополнительно, рассматриваемые клетки-хозяева растений включают в себя растительную клетку люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника (Gossypium sp.), тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[0015] В еще одном варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против жесткокрылого насекомого, в том числе западного кукурузного жука, южного кукурузного жука, северного кукурузного жука, мексиканского кукурузного жука, бразильского кукурузного жука или группы бразильского кукурузного жука, состоящей из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa.
[0016] В другом варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против чешуекрылого насекомого, в том числе совки бархатных бобов, огневки тростниковой, точильщика зернового кукурузного, совки хлопковой, табачной листовертки, соевой совки, африканской совки, южной совки, совки травяной, совки свекольной, совки американской, азиатской хлопковой совки, розового коробочного червя хлопчатника, совки-ипсилон, огневки кукурузной юго-западной, капустной моли или мотылька стеблевого кукурузного.
[0017] В еще одном варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против полужесткокрылого насекомого, в том числе слепняка западного матового, клопа травяного или хлопкового слепняка.
[0018] Также в данной заявке рассматриваются растения, содержащие молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащую гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, причем: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или приблизительно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с комплементарной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (d) указанное растение проявляет обнаруживаемое количество указанного пестицидного белка. В определенных вариантах реализации изобретения пестицидный белок содержит SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации изобретения растение является однодольным или двудольным. В другом варианте реализации изобретения растение выбирают из группы, состоящей из люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[0019] В дополнительных вариантах реализации изобретения описываются семена, содержащие молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты.
[0020] В другом варианте реализации изобретения рассматривается описанная в данной заявке композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один другой пестицидный агент, который отличается от указанного пестицидного белка. По меньшей мере один другой пестицидный агент выбирают из группы, состоящей из белка, обладающего ингибиторной активностью по отношению к насекомым, молекулы дцРНК, обладающей ингибиторной активностью по отношению к насекомым, и вспомогательного белка. По меньшей мере один другой пестицидный агент в композиции, обладающей ингибирующей активностью по отношению к насекомым, проявляет активность против одного или более видов вредителей из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых. По меньшей мере один другой пестицидный агент в композиции, обладающей ингибирующей активностью по отношению к насекомым, в одном варианте реализации изобретения является выбранным из группы, состоящей из: Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, вариантов Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, химер Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, вариантов Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113 и AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z и AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 и его вариантов, IP3 и его вариантов, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 и белка DIG-11.
[0021] Рассматриваются товарные продукты, содержащие обнаруживаемое количество молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке. Такие товарные продукты включают в себя товарную кукурузу, упакованную обработчиком зерна, кукурузные хлопья, кукурузные лепешки, кукурузную муку, кукурузную муку крупного помола, кукурузный сироп, кукурузное масло, кукурузный силос, кукурузный крахмал, кукурузную кашу и тому подобное, а также соответствующие хлопковые товарные продукты, такие как цельные или обработанные семена хлопчатника, хлопковое масло, линт, семена и части растений, обработанные для корма или продуктов питания, волокно, бумага, биомассы и топливные продукты, такие как топливо, полученное из хлопкового масла или таблеток, полученных из отходов хлопковой очистки, и соответствующие товарные продукты из сои такие как цельные или обработанные семена сои, соевое масло, соевый белок, соевая мука крупного помола, соевая мука, соевые хлопья, соевые отруби, соевое молоко, соевый сыр, соевое вино, корм для животных, содержащий соевые бобы, бумага, содержащая сою, сливки, содержащие сою, биомассу соевых бобов и топливные продукты, произведенные с использованием растений сои и частей растений сои, а также соответствующие продукты из риса, пшеницы, сорго, голубиного гороха, арахиса, фруктов, дыни и товарной продукции овощей, включая, где это применимо, соки, концентраты, джемы, желе, мармелады и другие съедобные формы таких товарных продуктов, содержащих обнаруживаемое количество таковых полинуклеотидов и или полипептидов данной заявки.
[0022] В данной заявке также рассматривается способ производства семян, содержащих молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке. Способ включает посадку, по меньшей мере, одного из семени, содержащего молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке; выращивание растения из семени; и сбор семени из растений, причем собранное семя содержит молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты данной заявки.
[0023] В другом иллюстративном варианте реализации изобретения предлагается растение, устойчивое к заражению насекомыми, в котором клетки указанного растения содержат: (a) молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующую инсектицидно эффективное количество пестицидного белка, как указано в SEQ ID NO: 2; или (b) инсектицидно эффективное количество белка, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или примерно 100% идентичность аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2.
[0024] Также в данной заявке описаны способы борьбы с вредителями видов жесткокрылых или чешуекрылых, или полужесткокрылых, и борьбы с поражением растений вредителями видов жесткокрылых или чешуекрылых, или полужесткокрылых, в частности сельскохозяйственной культуры. В одном варианте реализации изобретения способ включает (a) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, как указано в SEQ ID NO: 2; или (b) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, содержащих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или примерно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2.
[0025] Дополнительно в данном документе предлагается способ обнаружения наличия молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, в котором: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или приблизительно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. В одном варианте реализации изобретения способ включает приведение в контакт образца нуклеиновых кислот с зондом на основе нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с геномной ДНК из растения, содержащего полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, представленный в данном документе, и не гибридизуется в таких условиях гибридизации с геномной ДНК из другого изогенного растения, которое не содержит сегмент, причем зонд является гомологичным или комплементарным к SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, или последовательности, которая кодирует пестицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2. Способ может дополнительно включать в себя (a) применение к образцу и зонду жестких условий гибридизации; и (b) обнаружение гибридизации зонда с ДНК образца.
[0026] Также изобретением предусмотрены способы обнаружения наличия пестицидного белка или его фрагмента в образце, содержащем белок, причем указанный пестицидный белок, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации изобретения способ включает в себя: (a) приведение в контакт образца с иммунореактивным антителом; и (b) обнаружение наличия белка. В некоторых вариантах реализации изобретения этап обнаружения включает в себя твердофазный иммуноферментный анализ ELISA или вестерн-блоттинг.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0027] На Фиг. 1 изображена in planta ингибирующая активность типовых целевых и нецелевых белков TIC5290 хлоропласта к западному кукурузному жуку (WCR).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0028] SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность пестицидного белка TIC5290, полученную из вида Bacillus thuringiensis EG6657.
[0029] SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность белка TIC5290.
[0030] SEQ ID NO: 3 представляет собой синтетическую кодирующую последовательность, которая кодирует пестицидный белок TIC5290, используемый для экспрессии в растительных клетках.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0031] Проблема в области борьбы с сельскохозяйственными вредителями может быть охарактеризована как потребность в новых белках-токсинах, которые эффективны против целевых вредителей, проявляют токсичность широкого спектра по отношению к целевым видам вредителей, способны экспрессироваться в растениях, не вызывая нежелательных агрономических проблем, и обеспечивают альтернативный способ воздействия по сравнению с существующими на сегодняшний день токсинами, которые используют в растениях в коммерческих целях.
[0032] В данном документе описаны новые инсектицидные белки, примером которых является TIC5290 и родственные члены семейства, которые обеспечивают устойчивость к жесткокрылым, чешуекрылым и полужесткокрылым насекомым-вредителям, более конкретно к видам-вредителям кукурузных жуков. Также описанными являются синтетические кодирующие последовательности, предназначенные для экспрессии в растительной клетке, которые кодируют TIC5290. Далее описаны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие промотор в оперативной связи с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок-токсин TIC5290, или родственные члены семейства или их фрагменты.
[0033] Ссылка в этой заявке на TIC5290, "белок TIC5290", "белковый токсин TIC5290", "белок-токсин TIC5290", "пестицидный белок TIC5290", "TIC5290-подобные токсины", или "TIC5290-подобные белки-токсины" и тому подобные, относится к любому новому пестицидному белку или обладающему ингибиторной активностью по отношению к насекомым белку, который включает в себя, состоит, является по существу гомологичным, является подобным или получен из любого пестицидного белка или обладающей ингибиторной активностью по отношению к насекомым белковой последовательности TIC5290 (SEQ ID NO: 2), а также их ингибирующим пестицидным или обладающим ингибиторной активностью по отношению к насекомым сегментам или их комбинациям, которые придают активность против жесткокрылых насекомых-вредителей, чешуекрылых насекомых-вредителей и полужесткокрылых насекомых-вредителей, включая любой белок, проявляющий пестицидную или ингибирующую активность по отношению к насекомым, если выравнивание такого белка с TIC5290 приводит к идентичности аминокислотной последовательности любого процента фракции от около 65 до около 100 процентов.
[0034] Термин "сегмент" или "фрагмент" используется в данной заявке для описания непрерывных последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот, которые короче, чем полная аминокислотная или нуклеотидная последовательность, описывающая белок TIC5290 или связанный с ним член семейства инсектицидных белков. Сегмент или фрагмент, проявляющий ингибирующую активность в отношении насекомых, также раскрыт в данной заявке, если выравнивание такого сегмента или фрагмента с соответствующим участком белка TIC5290, изложенным в SEQ ID NO: 2 приводит к идентичности аминокислотной последовательности любого процента фракции от около 65 до около 100 процентов между сегментом или фрагментом и соответствующим участком белка TIC5290.
[0035] В контексте данной заявки термины "активная" или "активность", "пестицидная активность" или "пестицидная" или "инсектицидная активность", "ингибитор в отношении насекомых" или "инсектицидная" относятся к эффективности токсического вещества, такого как белок-токсин, в ингибировании (ингибировании роста, питания, плодовитости или жизнеспособности), подавлении (подавлении роста, кормления, плодовитости или жизнеспособности), борьбе (борьбе с поражением насекомыми-вредителями, контроле интенсивности питания насекомых-вредителей на определенной культуре, содержащей эффективное количество белка TIC5290), или уничтожении (вызывающем заболеваемость, смертность или снижение плодовитости) вредителя. Эти термины призваны включать в себя результат обеспечения пестицидно эффективного количества токсичного белка для вредителя, при котором предоставление вредителю токсичного белка приводит к заболеваемости, смертности, снижению плодовитости или задержке роста. Данные термины также включают отпугивание вредителя от растения, ткани растения, части растения, семян, растительных клеток или от конкретного географического местоположения, причем растение может расти, в результате обеспечения пестицидно эффективного количества токсичного белка в или на растении. В общем, пестицидная активность относится к способности токсичного белка быть эффективным в ингибировании роста, развития, жизнеспособности, кормового поведения, брачного поведения, плодовитости или любого измеримого снижения, вызванного неблагоприятными эффектами, в связи с предоставлением в рацион насекомого данного белка, фрагмента белка, сегмента белка или полинуклеотида, конкретному целевому вредителю, включая, но не ограничиваясь ими, насекомых отряда чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых. Токсичный белок может быть произведен растением или может быть применен к растению или к окружающей среде в том месте, где находится растение. Термины "биоактивность", "эффективный", "действенный" или их вариации также являются терминами, взаимозаменяемо используемыми в данной заявке, для описания воздействия белков данного изобретения на целевых насекомых-вредителей.
[0036] Пестицидно эффективное количество токсического вещества, обеспеченное в рационе целевого вредителя, проявляет пестицидную активность при контакте токсического вещества с вредителем. Токсичное вещество может представлять собой пестицидный белок или одно, или более химических веществ, известных в данной области техники. Пестицидные или инсектицидные химические вещества и пестицидные или инсектицидные белковые агенты могут быть использованы по отдельности или в сочетании друг с другом. Химические вещества включают в себя, но без ограничений, молекулы дцРНК, нацеленные на специфические гены для подавления в целевом вредителе, органохлориды, органофосфаты, карбаматы, пиретроиды, неоникотиноиды и рианоиды. Пестицидные или инсектицидные белковые агенты включают в себя белковые токсины, изложенные в данной заявке, а также другие белковые токсичные вещества, включая те, которые нацелены на виды-вредители чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых, а также белковые токсины, которые используются для борьбы с другими вредителями растений, такие как белки Cry, доступные в данной области техники для применения при борьбе с видами чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых.
[0037] Предполагается, что ссылка на вредителя, особенно вредителя сельскохозяйственного растения, означает вредителей культурных растений, особенно тех вредителей, которые контролируются белком TIC5290. Однако, ссылка на насекомого-вредителя может также включать в себя равнокрылых насекомых-вредителей, а также нематод и грибов при тех условиях, когда токсичные вещества, нацеленные на этих вредителей, совместно локализуются или присутствуют вместе с белком TIC5290 или белком, который имеет от около 65 до около 100 процентов идентичности с TIC5290.
[0038] Инсектицидные белки, класса белковых токсинов TIC5290 связаны общей функцией и проявляют инсектицидную активность по отношению к насекомым-вредителям из видов жесткокрылых и чешуекрылых насекомых, включая взрослых особей, куколок, личинок и новорожденных, а также представителей полужесткокрылых, включая взрослых особей и нимф.
[0039] Насекомые отряда чешуекрылых, включают в себя, но без ограничений, совок луговых, совок, пядениц, и совок из семейства Noctuidae, например, кукурузную листовую совку (Spodoptera frugiperda), совку помидорную (Spodoptera exigua), совку латуковую (Mamestra configurata), южную совку (Spodoptera eridania), совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), совку капустную (Trichoplusia ni), соевую совку (Pseudoplusia includens), совку бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), совку клеверную (Hypena scabra), табачную листовертку (Heliothis virescens), совку хлопковую (Agrotis subterranea), совку луговую (Pseudaletia unipuncta), совку прямоугольную (Agrotis orthogonia); точильщиков, чехлоносок, бабочек, огневок шишковых, гусениц бабочки капустницы и пироморфид из семейства Pyralidae, например, мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis), бабочку-огневку (Amyelois transitella), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), лугового мотылька (Herpetogramma licarsisalis), огневку подсолнечниковую (Homoeosoma electellum), точильщика зернового кукурузного (Elasmopalpus lignosellus); листоверток, дымчастых листоверток, плодожорок и плодовых листоверток из семейства Tortricidae, например, плодожорку яблонную (Cydia pomonella), листовертку виноградную (Endopiza viteana), листовертку восточную (Grapholita molesta), листовертку подсолнечника (Suleima helianthana); и многих других экономически важных чешуекрылых, например, капустную моль (Plutella xylostella), розового коробочного червя (Pectinophora gossypiella) и шелкопряда непарного (Lymantria dispar). Насекомые отряда чешуекрылых, включают в себя, например, совку хлопковую американскую (Alabama argillacea), листовертку плодовых деревьев (Archips argyrospila), листовертку розанова (Archips rosana) и других представителей листоверток, (Chilo suppressalis, огневку стеблевую азиатскую или желтую рисовую огневку), листовертку рисовую (Cnaphalocrocis medinalis), блошку длинноусую (Crambus caliginosellus), гусеницу мятлика (Crambus teterrellus), огневку кукурузную юго-западную (Diatraea grandiosella), тростниковую огневку (Diatraea saccharalis), совку хлопковую египетскую (Earias insulana), совку пятнистую (Earias vittella), совку американскую (Helicoverpa armigera), американскую кукурузную совку (Helicoverpa zea, также известную как совка хлопковая), табачную листовертку (Heliothis virescens), мотылька лугового (Herpetogramma licarsisalis), листовертку виноградную (Lobesia botrana), цитрусовую минирующую моль (Phyllocnistis citrella), белянку капустную (Pieris brassicae), белянку репную (Pieris rapae, также известную как репница), капустную моль (Plutella xylostella), совку свекольную (Spodoptera exigua), табачную совку (Spodoptera litura, также известную как табачный озимый червь) и томатную минирующую моль (Tuta absoluta).
[0040] Насекомые отряда жесткокрылых включают в себя, но без ограничений, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. и Trogoderma spp, в частности, в которых вредителем является западный кукурузный жук (Diabrotica virgifera, WCR), северный кукурузный жук (Diabrotica barberi, NCR), мексиканский кукурузный жук (Diabrotica virgifera zeae, MCR), бразильский кукурузный жук (Diabrotica balteata, BZR), южный кукурузный жук (Diabrotica undecimpunctata howardii, SCR) и группа бразильского кукурузного жука (BCR, состоящая из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa).
[0041] Насекомые отряда полужесткокрылых включают в себя, но без ограничений, слепняка западного матового (Lygus hesperus), клопа травяного (Lygus lineolaris) и хлопкового слепняка (Pseudatomoscelis seriatus).
[0042] В контексте данной заявки термин "изолированная молекула ДНК" или эквивалентный термин или фраза означает, что молекула ДНК представляет собой молекулу ДНК, которая присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не в ее естественной среде. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, терминирующая последовательность транскрипции и тому подобные, которые, естественно, находятся в ДНК генома организма, не считаются "выделенными" до тех пор, пока элемент находится в геноме организма и в том месте генома, в котором он встречается в природе. Тем не менее, каждый из этих элементов и их части были бы "выделены" в рамках данного описания при условии, если элемент не находится внутри генома организма и не в том месте в геноме, в котором он встречается в природе. Точно так же нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет представлять собой выделенную нуклеотидную последовательность, если нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой естественным образом находится последовательность, кодирующая белок. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность природного инсектицидного белка, будет считаться выделенной для целей данного описания. Для целей данного описания любая трансгенная нуклеотидная последовательность, то есть, нуклеотидная последовательность ДНК, встроенная в геном клеток растения или бактерии или присутствующая во внехромосомном векторе, будет считаться выделенной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она в плазмиде или подобной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарах, полученных из растения или бактерии.
[0043] Как описано далее в данном документе, открытая рамка считывания (ОРС), кодирующая TIC5290 (SEQ ID NO: 1), была обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG6657 Bacillus thuringiensis. Кодирующую последовательность клонировали и экспрессировали в микробных клетках-хозяевах для получения белка (SEQ ID NO: 2), используемого в биологических анализах. Ближайшим гомологом токсина TIC5290 является белок Vip4Aa с идентичностью последовательности 56,9%, что указывает на то, что TIC5290 представляет собой новое подсемейство Vip4. Биологический анализ с использованием белков TIC5290, полученных из микробных клеток-хозяев, продемонстрировал активность против вредителя жесткокрылых западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR); видов чешуекрылых - кукурузной листовой совки (Spodoptera frugiperda, FAW), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea, CEW), мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis) и капустной моли (Plutella xylostella); а также вредителя полужесткокрылых слепняка западного матового (Lygus hesperus).
[0044] Предполагается, что дополнительные последовательности белка-токсина, связанные с TIC5290, могут быть созданы с использованием естественной аминокислотной последовательности TIC5290 для создания новых белков с новыми свойствами. Белок-токсин TIC5290 может быть выровнен с другими белками, подобными к TIC5290, с целью объединения различий на уровне аминокислотной последовательности для новых вариантов аминокислотных последовательностей и внесения соответствующих изменений в последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая кодирует варианты.
[0045] Дополнительно следует иметь в виду, что улучшенные варианты TIC5290 могут быть сконструированы in planta с использованием различных способов генной инженерии, известных в данной области техники. Такие технологии, используемые в генной инженерии, включают в себя, но без ограничений, ZFN (нуклеазу с цинковыми пальцами), мегануклеазы, TALEN (эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции) и системы CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками)/Cas (CRISPR-ассоциированные). Такие способы генной инженерии могут быть использованы для изменения кодирующей последовательности белка-токсина, трансформированной в растительную клетку, в другую последовательность, кодирующую токсин. В частности, с помощью этих способов один или более кодонов в кодирующей последовательности токсина изменяются с целью разработки новой белковой аминокислотной последовательности. В альтернативном варианте, фрагмент в пределах кодирующей последовательности заменяется или удаляется, или дополнительные фрагменты ДНК вставляются в кодирующую последовательность для создания новой кодирующей последовательности токсина. Новая кодирующая последовательность может кодировать белок-токсин с новыми свойствами, такими как повышенная активность или увеличенный спектр против насекомых-вредителей, а также обеспечивать активность против видов насекомых-вредителей, которые развили устойчивость против исходного белка-токсина. Растительная клетка, содержащая редактированную последовательность гена токсина, может быть использована, с помощью способов известных в данной области техники, для получения целых растений, экспрессирующих новый белок-токсин.
[0046] Также предполагается, что фрагменты белка TIC5290 или его варианты, могут быть укороченными формами с ингибирующей активностью в отношении насекомых, в которых одна или более аминокислот удаляются с N-конца, С-конца, середины белка, или их комбинаций. Эти фрагменты могут быть естественного происхождения или синтетическими вариантами TIC5290 или вариантами производного белка, но должны сохранять ингибирующую активность TIC5290 в отношении насекомых.
[0047] Белки, которые напоминают белок TIC5290, могут быть идентифицированы путем сравнения друг с другом с использованием различных компьютерных алгоритмов, известных в данной области техники. Например, идентичности аминокислотных последовательностей белков, связанных с TIC5290, может быть проанализирована с использованием выравнивания Clustal W с использованием данных параметров по умолчанию: Матрица сравнения: blosum, штраф на внесение делеции в выравнивание: 10,0, штраф на продолжение делеции: 0,05, гидрофильные делеции: Вкл., гидрофильные остатки: GPSNDQERK, штраф на остаткоспецифичные делеции: Вкл. (Thompson, и соавт (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Процент идентичности аминокислот далее рассчитывается в виде выражения 100% умноженных на (идентичности аминокислот/длина искомого белка). Другие алгоритмы выравнивания также доступны в данной области техники и обеспечивают результаты, аналогичные тем, которые получены с использованием выравнивания Clustal W.
[0048] Предполагается, что белок, проявляющий ингибирующую активность в отношении видов чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых насекомых, является связанным с TIC5290, если выравнивание такого искомого белка с TIC5290 демонстрирует, по меньшей мере, от 65% до 100% идентичности аминокислот по длине искомого белка что составляет около 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичности аминокислотной последовательности (или любой процент в данном диапазоне) между искомым и исследуемым белком.
[0049] Белок TIC5290 также может быть связан первичной структурой (консервативные аминокислотные мотивы), длиной (около 937 аминокислот) и другими характеристиками. Биоинформационный анализ показывает, что TIC5290 является порообразующим белком, имеет домен PA14 Pfam (PF07691), который, вероятно, вовлечен в связывание с клеточным рецептором(-ами) в желудке целевого насекомого, домен находится в позиции аминокислот с 16 по 140 аминокислоту, а затем следует домен Binary_toxB Pfam (PF03495) в позиции аминокислот с 186 по 593, что может способствовать образованию бета-складчатой трансмембранной поры. Оба этих Pfam, вероятно, способствуют инсектицидной активности белка. Характеристики белкового токсина TIC5290 представлены в таблице 1.
Таблица 1. Отдельные характеристики белка TIC5290.
[0050] Как описано далее в примерах данной заявки, последовательности молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие TIC5290, были сконструированы для применения в растениях. Иллюстративная, оптимизированная для растений, последовательность молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая белок TIC5290, которая была сконструирована для применения в растениях, изложена в SEQ ID NO: 3.
[0051] Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие эти синтетические последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть сконструированы и введены в клетки растений кукурузы, сои, хлопчатника или клетки других растений в соответствии со способами и методиками трансформации, известными в данной области техники. Например, опосредованная Agrobacterium трансформация описана в публикациях патентной заявки США 2009/0138985A1 (соя), 2008/0280361A1 (соя), 2009/0142837A1 (кукуруза), 2008/0282432 (хлопчатник), 2008/0256667 (хлопчатник), 2003/0110531 (пшеница), 2001/0042257 A1 (сахарная свекла), патентах США №5,750,871 (канола), 7,026,528 (пшеница) и 6,365,807 (рис), и в Arencibia и соавт. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (сахарный тростник) полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Трансформированные клетки могут быть воспроизведены в трансформированные растения, которые экспрессируют TIC5290 и демонстрируют пестицидную активность посредством биологических анализов, проводимых в присутствии личинок вредителей чешуекрылых или полужесткокрылых, использующих листовые диски, полученные из трансформированных растений. Для испытания пестицидной активности к вредителям жесткокрылых, трансформированные растения генерации Ro и F1 использовались в анализе влияния вредителя на корень, как описано в примере ниже.
[0052] В качестве альтернативы традиционным способам трансформации, последовательность ДНК, такая как трансген, экспрессионная кассета(-ты) и тому подобные, может быть вставлена или интегрирована в конкретный сайт или локус в геноме растения или растительной клетки через сайт-направленную интеграцию. Таким образом, конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК и молекула(-ы) данного описания могут включать в себя последовательность донорной матрицы, содержащую, по меньшей мере, один трансген, экспрессионную кассету или другую последовательность ДНК для вставки в геном растения или растительной клетки. Такая донорная матрица для сайт-направленной интеграции может дополнительно включать в себя одно или два гомологичных "плеча", фланкирующие последовательность вставки (то есть, последовательность, трансген, кассету и тому подобное, которые должны быть вставлены в растительный геном). Конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК данного описания может дополнительно содержать экспрессионную кассету(-ты), кодирующую сайт-специфическую нуклеазу и/или любой связанный белок(-ки) для осуществления сайт-направленной интеграции. Такая кассета(-ты), экспрессирующая нуклеазу, может присутствовать в той же молекуле или векторе, что и донорная матрица (в цис) или на отдельной молекуле или векторе (в транс). В данной области техники известно несколько способов сайт-направленной интеграции с участием различных белков (или комплексов белков и/или направляющей РНК), которые режут геномную ДНК для получения двухцепочечного разрыва (ДЦР, DSB-double strand break) или ника на желаемом геномном сайте или локусе. Как понятно из уровня техники, в процессе репарации ДЦР или ника, произведенных ферментом нуклеазы, ДНК донорной матрицы может интегрироваться в геном в месте ДЦР или ника. Наличие гомологичного "плеча"(-чей) в донорной матрице может способствовать внедрению и нацеливанию последовательности вставки в геном растения во время процесса репарации посредством гомологичной рекомбинации, хотя вставка может происходить посредством негомологичного соединения концов (NHEJ-non-homologous end joining). Примерами использующихся сайт-специфичных нуклеаз являются нуклеазы с цинковыми пальцами, сконструированные или нативные мегануклеазы, TALE-эндонуклеазы и управляемые при помощи РНК-гидов эндонуклеазы (например, Cas9 или Cpf1). Для способов использования управляемых при помощи РНК-гидов сайт-специфических эндонуклеаз (например, Cas9 или Cpf1), конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК также будет содержать последовательность, кодирующую одну или более направляющих РНК для направления нуклеазы на желаемый участок в геноме растения.
[0053] Рассматриваются композиции молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые кодируют TIC5290. Например, белок TIC5290 может быть экспрессирован конструктами рекомбинантной ДНК, в которых молекула полинуклеотида с ОРС (открытой рамкой считывания), кодирующая белок, функционально связана с элементами генетической экспрессии, такими как промотор и любой другой регуляторный элемент, необходимый для экспрессии в системе для которой предназначен данный конструкт. Неограничивающие примеры включают функциональный промотор растения, функционально связанный с кодирующими последовательностями белка TIC5290, для экспрессии белка в растениях, или Bt-функциональный промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью белка TIC5290, для экспрессии белка в Bt бактерии или других видах рода Bacillus. Другие элементы могут быть функционально связаны с кодирующими последовательностями белка TIC5290, включая, но не ограничиваясь ими, энхансеры, интроны, нетранслируемые лидеры, кодированные белковые иммобилизационные метки (гистидиновые метки), транслокационные пептиды (то есть, пластидные транзитные пептиды, сигнальные пептиды) полипептидные последовательности для посттрансляционных модифицирующих ферментов, сайты связывания рибосом и сайты-мишени РНКи. Типичные рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, представленные в данном документе, включают в себя, но без ограничений, гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, таким как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, который кодирует полипептид или белок, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2. Гетерологичный промотор также может быть функционально связан с синтетическими кодирующими последовательностями ДНК, кодирующими TIC5290, нацеленный на пластид, и ненацеленный TIC5290. Кодоны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие белок, описанный в данном документе, могут быть заменены синонимичными кодонами (известны в данной области техники как молчащие замены).
[0054] Конструкт рекомбинантной ДНК, содержащий последовательность, кодирующую белок TIC5290, может дополнительно содержать область ДНК, которая кодирует одно или более веществ, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, которые могут быть сконструированы для одновременной экспрессии или коэкспрессии с последовательностью ДНК, кодирующей белок TIC5290, белок отличный от белка TIC5290, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых, или вспомогательный белок. Вспомогательные белки включают в себя, но без исключений, кофакторы, ферменты, партнеры по связыванию или другие агенты, которые способствуют повышению эффективности агента, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, например, способствуя его экспрессии, влияя на его стабильность в растениях, оптимизируя свободную энергию для олигомеризации, увеличивая его токсичность и увеличивая спектр его активности. Вспомогательный белок может облегчать захват одного или более веществ, обладающих ингибирующих активностью в отношении насекомых, например, или усиливать токсическое действие токсического вещества.
[0055] Конструкт рекомбинантной ДНК можно собирать так, чтобы все белки или молекулы дцРНК были экспрессированы из одного промотора, или каждый белок или молекула дцРНК экспрессировались под контролем отдельного промотора, или в определенной их комбинации. Белки согласно данному изобретению могут быть экспрессированы из мультигенной система экспрессии, в которой белок TIC5290 экспрессируется из общего нуклеотидного сегмента, который также содержит другие открытые рамки считывания и промоторы, в зависимости от выбранного типа системы экспрессии. Например, мультигенная система экспрессии растений может использовать единственный промотор для управления экспрессией многократносвязанных/тандемных открытых рамок считывания из одного оперона. В другом примере мультигенная система экспрессии растений может использовать многократно несвязанные экспрессионные кассеты, каждая из которых экспрессирует другой белок или другой агент, такой как одна или более молекул дцРНК.
[0056] Рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции рекомбинантной ДНК, содержащие последовательность, кодирующую белок TIC5290, могут быть доставлены в клетки-хозяева векторами, например, плазмидой, бакуловирусом, синтетической хромосомой, вирионом, космидой, фагмидой, фагом или вирусным вектором. Такие векторы могут быть использованы для достижения стабильной или транзиентной экспрессии последовательности, кодирующей белок TIC5290, в клетке-хозяине, или более поздней экспрессии кодируемого полипептида. Экзогенный рекомбинантный полинуклеотид или конструкт рекомбинантной ДНК, который содержит последовательность, кодирующую белок TIC5290, и который вводится в клетку-хозяина, упоминаемая в данном документе как "трансген".
[0057] В данном документе представлены трансгенные бактерии, трансгенные клетки растений, трансгенные растения и части трансгенных растений, которые содержат рекомбинантный полинуклеотид, экспрессирующий любую одну или более из кодирующих последовательностей белка TIC5290. Термин "бактериальная клетка" или "бактерия" может включать в себя, но без ограничений, клетку Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, или Rhizobium. Термин "клетка растения" или "растение" может включать в себя, но без ограничений, клетку двудольного растения или клетку однодольного растения. Рассматриваемые растения и клетки растений включают в себя, но без ограничений, клетку или растение люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, грецкого ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены трансгенные растения и части трансгенных растений, которые регенерировали из трансгенной растительной клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенные растения могут быть получены из трансгенного семени путем разрезания, срывания, измельчения или иного отделения части от растения. В определенных вариантах реализации изобретения часть растения может быть семенем, коробочкой, листом, цветком, стеблем, корнем или любой его частью или нерегенерируемой частью трансгенной части растения. Как используется в данном контексте, "нерегенерируемая" часть трансгенной части растения представляет собой часть, которая не может быть индуцирована для образования целого растения или которая не может быть индуцирована для образования целого растения, способного к половому и/или бесполому размножению. В некоторых вариантах реализации изобретения нерегенерируемая часть отбираемой части растения представляет собой часть трансгенного семени, коробочки, листа, цветка, стебля или корня.
[0058] Приведены способы получения трансгенных растений, которые содержат ингибирующее в отношении жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых количества белков TIC5290. Такие растения могут быть получены путем введения рекомбинантного полинуклеотида, который кодирует белок TIC5290, предусмотренный в данной заявке, в растительную клетку и отбора растения, полученного из указанной растительной клетки, которое экспрессирует ингибирующее в отношении видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых количество белка TIC5290. Растения могут быть получены из растительных клеток путем регенерации, из семян, пыльцы или меристемы, полученных способами трансформации. Способы трансформации растений известны в данной области техники.
[0059] Обработанные растительные продукты, причем процессированный продукт содержит обнаруживаемое количество белка TIC5290, сегменты и фрагменты, обладающие ингибиторной активностью в отношении насекомых, или его фрагмент или любую его отличительную часть, также описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения обработанный продукт выбирают из группы, состоящей из частей растения, биомассы растений, масла, муки, сахара, корма для животных, муки, хлопьев, отрубей, пуха, кожуры, обработанных семян и семян. В определенных вариантах реализации изобретения обработанный продукт является нерегенерируемым. Растительный продукт может включать в себя товар или другие коммерческие продукты, полученные из трансгенного растения или части трансгенных растений, причем товар или другие продукты можно отследить путем обнаружения нуклеотидных сегментов или экспрессированных РНК или белков, которые кодируют или содержат отличающиеся части белка TIC5290.
[0060] Растения, экспрессирующие белок TIC5290, можно скрещивать путем селекции с трансгенными объектами, экспрессирующими другие белки-токсины и/или экспрессирующими другие трансгенные признаки, такие как гены устойчивости к гербицидам, гены, повышающие урожайность или устойчивость к стрессу, и тому подобное, или признаки могут быть объединены в одном векторе, так что все признаки будут связаны между собой.
[0061] Как описано далее в примерах, синтетические или искусственные последовательности, кодирующие TIC5290, которые были предназначены для использования в растениях, изложены в SEQ ID NO: 3.
[0062] Для экспрессии в растительных клетках белок TIC5290 может экспрессироваться так, чтобы он находился в цитозоле или был нацелен на различные органеллы растительной клетки. Например, нацеливание белка на хлоропласт может приводить к увеличению уровней экспрессированного белка в трансгенном растении, предотвращая появление признаков иных фенотипов. Нацеливание может также приводить к повышению резистентности к вредителям у трансгенного объекта. Целевой пептид или транзитный пептид представляет собой короткую пептидную цепь (длиной 3-70 аминокислот), которая направляет транспортировку белка в определенную область клетки, включая ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), хлоропласт, апопласт, пероксисому и плазматическую мембрану. Некоторые сигнальные пептиды отщепляются от белка под действием сигнальной пептидазы после транспортирования белков. Для нацеливания на хлоропласт, белки содержат транзитные пептиды, которые содержат около 40-50 аминокислот. Для описания применения транзитных пептидов хлоропласта, см. патенты США № 5,188,642 и 5,728,925. Многие локализованные на хлоропласте белки экспрессируются из ядерных генов как предшественники и нацелены на хлоропласт транзитным пептидом хлоропласта (ТПХ). Примеры таких выделенных хлоропластных белков включают, но без ограничений, такие, которые связаны с малой субъединицей (МСУ) рибулозо-1,5,-бисфосфаткарбоксилазы, ферредоксином, ферредоксин-оксидоредуктазой, белком I и белком II светособирающего комлекса, тиоредоксином F, 5-енолпируват-шикимат-З-фосфатсинтазой (ЕПШФС) и транзитными пептидами, описанными в патенте США №7,193,133. В условиях in vivo и in vitro было продемонстрировано, что нехлоропластные белки могут быть нацелены на хлоропласт с использованием белковых гибридов с гетерологичным ТПХ и что наличия ТПХ достаточно для нацеливания белка на хлоропласт. Включение подходящего хлоропластного транзитного пептида, такого как ЕПШФС ТПХ Arabidopsis thaliana (ТПХ2) (см., Klee и соавт., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) или ЕПШФС ТПХ Petunia hybrida (ТПХ4) (см., della-Cioppa и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986) было показано, что они нацеливают гетерологичные последовательности белка ЕПШФС на хлоропласты в трансгенных растениях (см., патентах США №5,627,061; 5,633,435; и 5,312,910; и EP 0218571; EP 189707; EP 508909; и EP 924299). Для нацеливания белка TIC5290 на хлоропласт, последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропласта, расположена 5' в функциональной связи и в рамке к синтетической кодирующей последовательности, кодирующей белок TIC5290, который был сконструирован для оптимальной экспрессии в растительных клетках.
[0063] Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие данные синтетические или искусственные нуклеотидные последовательности, могут быть сконструированы и введены в клетки растений кукурузы, хлопка и сои в соответствии со способами и методиками трансформации, которые известны в данной области техники. Трансформированные клетки регенерировали в трансформированные растения, которые, как было обнаружено, экспрессировали TIC5290. Для проверки пестицидной активности, биологическое тестирование проводили в присутствии чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых вредителей.
[0064] Последовательности, кодирующие белок TIC5290, и последовательности, имеющие значительную процентную идентичность с TIC5290, могут быть идентифицированы с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), термическая амплификация и гибридизация. Например, белок TIC5290 может быть использован для получения антител, которые специфически связываются с подобными белками, и могут быть использованы для скрининга и поиска других белков, которые тесно связаны.
[0065] Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок-токсин TIC5290, могут быть использованы в качестве зондов и праймеров для скрининга и идентификации других членов класса с использованием способов термоциклической или изотермической амплификации и гибридизации. Например, олигонуклеотиды, полученные из последовательности, как указано в SEQ ID NO: 3, могут быть использованы для определения присутствия или отсутствия трансгена TIC5290 в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной из товарного продукта. Учитывая чувствительность определенных способов обнаружения нуклеиновых кислот, которые используют олигонуклеотиды, предполагается, что олигонуклеотиды, полученные из последовательности, как указано в SEQ ID NO: 3, могут быть использованы для обнаружения трансгена TIC5290 в товарных продуктах, полученных из объединенных источников, где только часть товарного продукта получена из трансгенного растения, содержащего SEQ ID NO: 3. Кроме того, признано, что такие олигонуклеотиды могут быть использованы для введения изменения последовательности нуклеотидов в SEQ ID NO: 3. Такие "мутагенезные" олигонуклеотиды полезны для идентификации вариантов аминокислотной последовательности TIC5290, проявляющих диапазон ингибирующей активности в отношении насекомых или различную экспрессию в клетках-хозяевах трансгенного растения.
[0066] Гомологи нуклеотидной последовательности, например, инсектицидные белки, кодируемые нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются с каждой или любой из последовательностей, раскрытых в данной заявке в условиях гибридизации, также являются вариантом реализации данного изобретения. Изобретение также относится к способу обнаружения первой нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью, причем первая нуклеотидная последовательность (или ее обратная комплементарная последовательность) кодирует пестицидный белок или его пестицидный фрагмент и гибридизуется в условиях жесткой гибридизации со второй нуклеотидной последовательностью. В таком случае вторая нуклеотидная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 в условиях жесткой гибридизации. Кодирующие нуклеотидные последовательности гибридизуются друг с другом в соответствующих условиях гибридизации, а белки, кодируемые этими нуклеотидными последовательностями, перекрестно реагируют с антисывороткой к любому из других белков. Жесткие условия гибридизации, как определено в данном документе, включают в себя, по меньшей мере, гибридизацию при 42 °С с последующими двумя промывками в течение пяти минут каждая при комнатной температуре с 2X SSC, 0,1% ДСН, с последующими двумя промывками в течение 30 минут каждая при 65 °C в 0,5X SSC, 0,1% ДСН. Промывки при еще более высоких температурах представляют собой еще более жесткие условия, например, условия гибридизации 68°C с последующим промыванием при 68oC, в 2x SSC, содержащем 0,1% ДСН.
[0067] Специалисту в данной области техники будет понятно, что из-за вырожденности генетического кода многие другие последовательности способны кодировать белки, подобные TIC5290, и эти последовательности в той степени, в которой они функционируют для экспрессии пестицидных белков либо в штаммах Bacillus или в растительных клетках являются вариантами реализации данного изобретения, подразумевая, конечно, что многие такие вырожденные кодирующие последовательности не будут гибридизоваться в этих условиях с нативными последовательностями Bacillus, кодирующими TIC5290. Данная заявка рассматривает применение этих и других способов идентификации, известных специалистам в данной области техники, для идентификации последовательностей, кодирующих белок TIC5290 и последовательностей, имеющих значительную процентную идентичность с последовательностями, кодирующими белок TIC5290.
[0068] Также в данной заявке раскрыты способы борьбы с насекомыми, в частности, заражениями культурных растений чешуекрылыми или жесткокрылыми, или полужесткокрылыми насекомыми с использованием белка TIC5290. Такие способы могут включать в себя выращивание растения, содержащего ингибирующее в отношении чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых насекомых количество белка-токсина TIC5290. В некоторых вариантах реализации изобретения такие способы могут дополнительно включать любое одно или более из: (I) нанесения любой композиции, содержащей или кодирующей белок-токсин TIC5290, на растение или семя, которое дает начало растению; и (II) трансформацию растения или клетки растения, которые дают начало растению, полинуклеотидом, кодирующим белок-токсин TIC5290. В общем, предполагается, что белок-токсин TIC5290 может быть обеспечен в композиции, имеющейся в микроорганизме, или имеющейся в трансгенном растении, чтобы обеспечить ингибирующую активность против чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых насекомых.
[0069] В некоторых вариантах реализации изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты белка-токсина TIC5290 является инсектицидно активным ингредиентом композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, полученной культивированием рекомбинантной клетки Bacillus или любой другой рекомбинантной бактериальной клетки, трансформированной с целью экспрессии белка-токсина TIC5290 в условиях, подходящих для экспрессии белка-токсина TIC5290. Такая композиция может быть получена путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, седиментации или концентрирования культуры таких рекомбинантных клеток, экспрессирующих/продуцирующих указанный рекомбинантный полипептид. Такой процесс может привести к образованию экстракта бактериальных клеток, суспензии клеток, клеточного гомогената, клеточного лизата, клеточного супернатанта, клеточного фильтрата или осаждению клеток Bacillus или другого энтомопатогена. Получив таким образом сконструированный рекомбинантный полипептид, создают композицию, которая содержит рекомбинантный полипептид, может содержать бактериальные клетки, бактериальные споры, а также параспоральные тельца и может поставляться для различных применений, включая продукты-спреи, обладающие ингибирующей активностью в отношении сельскохозяйственные насекомых или препараты кормовой биомассы, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых в кормовых биологических тестах.
[0070] В одном варианте реализации изобретения для снижения вероятности развития резистентности, композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая TIC5290, может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность против тех же видов чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых насекомых, но который отличается от белка-токсина TIC5290. Возможные дополнительные полипептиды для такой композиции содержат белок, обладающий ингибирующей активностью против насекомых, и молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью против насекомых. Одним из примеров использования таких рибонуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми-вредителями описаны в Baum и соавт. (публикация патента США 2006/0021087 A1). Такой дополнительный полипептид для борьбы с чешуекрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry1A (публикация патента США №5,880,275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B (публикация патента США №10/525,318), Cry1C (публикация патента США №6,033,874), Cry1D, Cry1Da и их вариантов, Cry1E, Cry1F, и химер Cry1A/F (публикация патента США №7,070,982; 6,962,705; и 6,713,063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, химеры типа Cry1, такие как, но без ограничений, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 и TIC1100 (публикация международной заявки WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (публикация международной заявки WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (публикация патента США №7,064,249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 и AXMI-045 (публикация патента США 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (публикация патента США 2013-0310543 A1 ), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (публикация патента США 2013-0104259 A1), AXMI-134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-150 (публикация патента США 2010-0160231 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, axmi209 (публикация патента США 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-238 (публикация патента США 2014-0033363 A1), AXMI-270 (публикация патента США 2014-0223598 A1), AXMI-345 (публикация патента США 2014-0373195 A1), AXMI-335 (международная публикация заявки WO2013/134523(A2)), DIG-3 (публикация патента США 2013-0219570 A1), DIG-5 (публикация патента США 2010-0317569 A1), DIG-11 (публикация патента США 2010-0319093 A1), AfIP-1A и его производные (публикация патента США 2014-0033361 A1), AfIP-1B и его производные (публикация патента США 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (публикация патента США 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (публикация патента США 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (публикация патента США 2014-0007292 A1), Pput_1063 (публикация патента США 2014-0007292 A1), DIG-657 (международная публикация заявки WO2015/195594(A2)), Pput_1064 (публикация патента США 2014-0007292 A1), GS-135 и его производные (публикация патента США 2012-0233726 A1), GS153 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS154 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS155 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2012-0047606 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2011-0112013 A1, SEQ ID NO: 2 и 4, и их производные, как описано в публикация патента США 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2010-0077508 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 или 4, и их производные, как описано в публикация патента США 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США №7,772,465 (B2), CF161_0085 и его производные, как описано в WO2014/008054 A2, токсичные к чешуекрылым белки и их производные, как описано в публикации патентов США US 2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 и US 2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в US 7510878(B2), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США № 7812129(B1); и тому подобное.
[0071] Такой дополнительный полипептид для борьбы с жесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry3Bb (публикация патента США №№ 6,501,009), варианты Cry1C, варианты Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-205 (публикация патента США 2014-0298538 A1), axmi207 (публикация патента США 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-279 (публикация патента США 2014-0223599 A1), AXMI-R1 и его варианты (публикация патента США 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (публикация патента США 2010-0319092 A1), eHIPs (публикация патента на патент США №2010/0017914), IP3 и его варианты (публикация патента США 2012-0210462 A1) и ϖ-Hexatoxin-Hv1a (публикация заявки на патент США US2014-0366227 A1).
[0072] Такой дополнительный полипептид для борьбы с полужесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белков, активных в отношении полужестокрылых, таких как, без ограничения, TIC1415 (публикация патента США 2013-0097735 A1), TIC807 (публикация патента США №8609936), TIC834 (публикация патента США 2013-0269060 A1), AXMI-036 (публикация патента США 2010-0137216 A1) и AXMI-171 (публикация патента США 2013-0055469 A1). Дополнительные полипептиды для борьбы с жесткокрылыми, чешуекрылыми и полужесткокрылыми насекомыми-вредителями можно найти на сайте номенклатуры токсина Bacillus thuringiensis поддерживаемом Neil Crickmore (во всемирной паутине по адресу btnomenclature.info).
[0073] В других вариантах реализации изобретения такая композиция/препарат может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность в отношении насекомых-вредителей, которые не ингибируются белком данного изобретения, в прочих случаях обладающим ингибирующей активностью против насекомых, с тем чтобы расширить спектр ингибирующей активности в отношении насекомых.
[0074] Способность насекомых развивать устойчивость к определенным инсектицидам была описана в данной области техники. Одна стратегия управления устойчивостью насекомых заключается в использовании трансгенных культур, которые экспрессируют два различных вещества, обладающих ингибирующей активностью против насекомых, которые действуют через различные механизмы действия. Таким образом, любые насекомые с устойчивостью к одному из веществ, обладающих ингибирующей активностью против насекомых, могут контролироваться с помощью другого вещества, обладающего ингибирующей активностью против насекомых. Другая стратегия борьбы с устойчивостью насекомых состоит в применении растений, которые не защищены от целевых видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых, с целью обеспечения укрытия для таких незащищенных растений. Один конкретный пример описан в патенте США №6,551,962, полное содержание которого включено посредством ссылки.
[0075] Другие варианты реализации изобретения, такие как локально применяемые пестицидные химикаты, которые разработаны для борьбы с вредителями, которые также регулируются белками, описанными в данном документе, для применения с белками в препаратах для обработки семян, опыления, точечного полива или протирания, и которые могут быть нанесены непосредственно на почву (поливка почвы), нанесены на выращиваемые растения, экспрессирующие белки, описанные в данном документе, или приготовлены для нанесения на семена, содержащие один или более трансгенов, кодирующих один или более описанных белков. Такие препараты для применения при обработке семян можно наносить с помощью различных наклеек и липких веществ, известных в данной области техники. Такие препараты могут содержать пестициды, которые являются синергичными в способе действия с описанными белками, так что пестициды препарата действуют посредством другого способа действия для борьбы с теми же или похожими вредителями, которые могут регулироваться описанными белками, или что такие пестициды действуют для борьбы с вредителями в более широком диапазоне хозяев или видов вредителей растений, которые неэффективно регулируются пестицидными белками TIC5290.
[0076] Вышеупомянутая композиция/препарат может дополнительно содержать сельскохозяйственно приемлемый носитель, такой как приманка, порошок, дуст, таблетки, гранулы, спреи, эмульсия, коллоидная суспензия, водный раствор, препараты спор/кристаллов Bacillus, протравливание семян, рекомбинантная растительная клетка/растительная ткань/семена/растение, трансформированные для экспрессии одного или более белков, или бактерия, трансформированная для экспрессии одного или более белков. В зависимости от уровня ингибирования в отношении насекомых или инсектицидного ингибирования, присущего рекомбинантному полипептиду, и уровня препарата, который должен применяться в анализе растений или рациона, состав/препарат может содержать различные массовые количества рекомбинантного полипептида, например, от 0,0001% до 0,001%, до 0,01%, до 1%, до 99% от массы рекомбинантного полипептида.
ПРИМЕРЫ
[0077] Ввиду вышеизложенного специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть сделаны изменения в конкретных описанных аспектах, и все же будет получен подобный или аналогичный результат, не отходя от сущности и объема изобретения. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, описанные в данном документе, не должны интерпретироваться как ограничивающие. Следует понимать, что полное раскрытие каждой из указанных выше публикаций включено в описании данной заявки.
ПРИМЕР 1
Обнаружение TIC5290
[0078] В этом примере описано обнаружение пестицидного белка TIC5290.
[0079] Последовательность, кодирующая новый пестицидный белок Bacillus thuringiensis (Bt) была идентифицирована, клонирована, подтверждена и протестирована в биологическом анализе насекомых. Пестицидный белок TIC5290, представленный в данном документе как SEQ ID NO: 1 (кодирующая последовательность Bt) и 2 (белок), был выделен из штамма Bt EG6657. TIC5290 представляет собой белок длиной 937 аминокислот, идентифицированный на основе гомологии с известными инсектицидными белковыми токсинами и с помощью анализа Pfam, с целью распределения по известным семействам инсектицидных белков. Биоинформатический анализ указывает на то, что TIC5290 является порообразующим белком. Домен PA14 Pfam (PF07691) в пределах аминокислот с 16 по 140, вероятно, вовлечен в функции связывания. За этим доменом следует домен Binary_toxB Pfam (PF03495) в пределах аминокислот с 186 по 593, что может способствовать образованию бета-складчатой трансмембранной поры. Ближайшим гомологом Bt -токсина TIC5209 является белок Vip4Aa с идентичностью последовательности 56,9%, что указывает на то, что TIC5290 представляет собой новое подсемейство Vip4.
[0080] ПЦР-праймеры были разработаны для амплификации полноразмерной копии кодирующей области для TIC5290 из общей геномной ДНК, выделенной из штамма EG6657. ПЦР-ампликон также включал в себя инициирующий и терминирующий кодоны кодирующей последовательности.
[0081] Ампликон TIC5290 клонировали с использованием способов, известных в данной области техники, в экспрессирующий вектор плазмиды Bt в функциональной связи с экспрессируемым промотором Bt, который является активным во время споруляции бациллы. Кроме того, ампликон клонировали в вектор, используемый для экспрессии белка, в системе экспрессии Escherichia coli (E. coli). Было обнаружено, что рекомбинантные штаммы экспрессируют рекомбинантный белок.
ПРИМЕР 2
TIC5290 демонстрирует активность, по отношению к жесткокрылым, чешуекрылым и полужесткокрылым в биологическом анализе насекомых.
[0082] Данный пример иллюстрирует ингибирующую активность, проявляемую белками TIC5290, по отношению к различным видам жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых.
[0083] Новый пестицидный белок TIC5290 экспрессировали в Bt и E. coli и анализировали на токсичность по отношению к различным видам жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых и двукрылых. Препараты каждого токсина из Bt и E. coli были проанализированы против видов жесткокрылых Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук, КЖ) и Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный жук, WCR). Препараты токсина также анализировались против видов чешуекрылых американской кукурузной совки (CEW, Helicoverpa zea), мотылька стеблевого кукурузного (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), огневки кукурузной юго-западной (SWC, Diatraea grandiosella), табачной листовертки (TBW, Heliothis virescens) и капустной моли (DBM, (Plutella xylostella). Препараты токсина также анализировались против видов полужесткокрылых клопа травяного (TPB, Lygus lineolaris) и слепняка западного матового (WTP, Lygus hesperus); а также видов двукрылых, комара желтолихорадочного (YFM, Aedes aegypti). Американская кукурузная совка (CEW, Helicoverpa zea) также упоминается как коробочный червь (SPW) и совка хлопковая (CBW).
[0084] Анализ белков, экспрессирующихся в каждом из векторов, требует различных препаратов, добавленных к рациону насекомых. Для векторов, использующих активный во время споруляции промотор, смесь кристаллов/спор собирали после трех дней роста в культуре и использовали в рационе насекомых (обычно применяли в искусственных рационах насекомых и кормили отдельно различных насекомых). Препараты белка, полученные путем экспрессии в E. coli были очищены и также представлены в рационе насекомых.
[0085] TIC5290 продемонстрировал активность против WCR, CEW, ECB, FAW, DBM и WTP, как показано в таблице 2 ниже, в которой "+" обозначает активность.
Таблица 2. Биологический анализ активности TIC5290 против жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых и двукрылых насекомых-вредителей.
ПРИМЕР 3
Разработка синтетических кодирующих последовательностей, которые кодируют TIC5290 для экспрессии в клетках растений
[0086] Синтетические или искусственные кодирующие последовательности были сконструированы для применения в экспрессии TIC5290 в растениях, клонированы в бинарный вектор для трансформации растения и использовались для трансформации растительных клеток. Синтетические последовательности нуклеиновой кислоты синтезировали в соответствии со способами, в целом описанными в патенте США 5,500,365, избегая некоторых неподходящих проблемных последовательностей, таких как последовательности полиаденилирования растений, обогащенные ATTTA и A/T, при сохранении аминокислотной последовательности нативного бека Bt. Синтетическая кодирующая последовательность для пестицидного белка TIC5290 представлена в виде SEQ ID NO: 3 и кодирует белок, представленный в виде SEQ ID NO: 2.
ПРИМЕР 4
Экспрессионные кассеты для экспрессии TIC5290 в клетках растений
[0087] Разнообразные экспрессионные кассеты растений были сконструированы с последовательностями, как изложено в SEQ ID NO: 3. Такие экспрессионные кассеты являются полезными для транзиентной экспрессии в протопластах растений или трансформации растительных клеток. Типичные экспрессионные кассеты были разработаны с учетом возможного размещения белка внутри клетки растения. Для белка, ориентированного на пластид, синтетическую последовательность, кодирующую пестицидный белок TIC5290, функционально связывали в рамке с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, для доставки в хлоропласт. Полученные векторы трансформации растений содержат первую трансгенную кассету для экспрессии пестицидного белка, которая содержит конститутивный промотор, функционально связанный 5' с лидерной последовательностью, функционально связанным 5' с интроном (или при необходимости без интрона), функционально связанный 5' с синтетической кодирующей последовательностью, которая кодирует нацеленный или не нацеленный на пластид белок TIC5290, который, в свою очередь, функционально связан 5' с 3'-нетранслируемой областью и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием глифосата или антибиотиков. Все элементы, описанные выше, были расположены рядом, часто с дополнительной последовательностью, предусмотренной для создания экспрессионной кассеты, такой как сайты эндонуклеазы рестрикции или сайты безлигазного клонирования.
ПРИМЕР 5
TIC5290 обеспечивает эффективную устойчивость к западному кукурузному жуку (Diabrotica virgifera virgifera) в случае экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы
[0088] Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую TIC5290 в отношении жесткокрылых, таких как злаковый корневой червь, в случае экспрессии в растениях и предлагается в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей.
[0089] Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленных, так и не нацеленных на пластид пестицидных белков TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы использовались для стабильной трансформации кукурузных растений. Отбирались и выращивались объекты с одиночными вставками Т-ДНК. Пестицидную активность анализировали по отношению к жесткокрылому западному кукурузному жуку (Diabrotica virgifera virgifera), питающемуся корнями стабильно трансформированных кукурузных растений.
[0090] Стабильно трансформированные растения R0 использовали для анализа устойчивости жесткокрылых, а также для получения потомства F1. Из каждой трансформации бинарным вектором отбирали множество объектов с одной копией. Часть этих объектов, возникающих из каждой трансформации бинарным вектором, использовалась в анализе жесткокрылых, в то время как другая часть объектов использовалась для получения потомства F1 с целью дальнейшего тестирования.
[0091] Растения для анализа R0 пересаживали в двадцатисантиметровые горшки. Растения были инокулированы яйцами западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR). Яйца инкубировали в течение примерно десяти дней до инокуляции с целью их вылупления через четыре дня после инокуляции, для обеспечения достаточного количества выживших и способных атаковать корни кукурузы личинок. Трансформированные растения инокулировали примерно с V2 до V3 стадии. Растения выращивали после заражения в течение примерно двадцати восьми дней. Растения удаляли из горшков, тщательно промывая корни, чтобы удалить всю почву. Ущерб корням оценивали с использованием шкалы оценки повреждений 1-5, как показано в таблице 3 ниже по тексту. Для гарантии правильного выполнения анализа сравнение также делали с негативным контролем. Низкие оценки повреждения корней указывают на устойчивость, передаваемую белком TIC5290 к вредителю жесткокрылых. При анализе WCR использовали множество объектов R0 для каждой трансформации бинарным вектором. Многие из объектов R0, экспрессирующих как нацеленный, так и не нацеленный на пластид TIC5290, продемонстрировали устойчивость к WCR, определяемую шкалой оценок повреждения корней, по сравнению с трансгенными контролями.
Таблица 3. Шкала оценок повреждения корней R0.
[0092] Часть стабильно трансформированных объектов R0, возникающих из каждой трансформации бинарным вектором, использовалась для получения потомства F1. Стабильно трансформированные растений R0 самоопылялись, давая потомство F1. Семена F1 высаживали. Гетерозиготные растения идентифицировали с помощью молекулярных методов, известных в данной области техники, и использовали для анализа против WCR, а также для измерения экспрессии белка-токсина TIC5290 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA. Часть гетерозиготного потомства F1 от каждого объекта использовалась для анализа на насекомых, в то время как другая часть использовалась для измерения экспрессии TIC5290.
[0093] Яйца от западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR) инкубировали в течение примерно десяти дней для вылупления в течение четырех дней после инокуляции. Растения инокулировали примерно с V2 до V3 стадии. В случае с WCR, в каждый горшок инокулировали около двух тысяч яиц. Растения выращивали после заражения в течение примерно двадцати восьми дней. Растения удаляли из горшков, тщательно промывая корни, чтобы удалить всю почву. Ущерб корням оценивали с использованием шкалы оценки повреждений 0-3, как показано в таблице 4 ниже по тексту. Для гарантии правильного выполнения анализа сравнение делали с негативным контролем. Низкие оценки повреждения корней указывали на устойчивость, передаваемую белком TIC5290 к вредителю жесткокрылых. Многие из объектов F1 демонстрировали эффективную устойчивость к WCR по сравнению с контролями. На фигуре 1 изображена средняя оценка повреждения корней нескольких объектов для TIC5290, когда он экспрессируется в растениях кукурузы F1, независимо от того, нацелен белок на хлоропласт или нет.
Таблица 4. Шкала оценок повреждения корней F1.
Пример 5
Анализ активности TIC5290 по отношению к чешуекрылым вредителям, при экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы, сои или хлопка.
[0094] Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленного, так и не нацеленного на пластид пестицидного белка TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники.
[0095] Кукурузу, сою или хлопок трансформировали с помощью бинарных векторов трансформации, описанных выше, с применением способа трансформации, опосредованной Agrobacterium. Трансформированные клетки индуцировали для образования растений при помощи способов, известных в данной области техники. Биотестирование с использованием листовых дисков растения выполняли по аналогии с теми, которые описаны в публикации патента США №8,344,207. Ткань, полученную из нетрансформированных растений кукурузы, сои или хлопка, использовали в качестве негативного контроля. Множественные объекты трансформации от каждого бинарного вектора оценивались против вредителей чешуекрылых таких как, но без ограничений, американская кукурузная совка (CEW, Helicoverpa zea), мотылек стеблевой кукурузный (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузная листовая совка (FAW, Spodoptera frugiperda), соевая совка (SBL, Chrysodeixis includens), огневка кукурузная юго-западная (SWCB, Diatraea grandiosella), табачная листовертка (TBW, Heliothis virescens) и капустная моль (DBM, Plutella xylostella). Установлено, что те насекомые, которые демонстрируют задержку роста и/или смертность в биологическом анализе насекомых, подвержены воздействию токсина TIC5290.
Пример 6
Анализ активности против полужесткокрылых вредителей с применением стабильно трансформированных хлопчатников, экспрессирующих TIC5290.
[0096] Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленных, так и не нацеленных на пластид пестицидных белков TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы использовались для стабильной трансформации хлопчатников. Пестицидную активность анализировали против полужесткокрылых вредителей, питающихся стабильно трансформированными растениями хлопчатника.
[0097] Бинарные векторы, описанные ранее в примере 3, в которых экспрессируется как нацеленный, так и не нацеленный на пластид TIC5290, применяли для стабильной трансформации растений хлопчатника. Отбирались и выращивались объекты с одиночными вставками Т-ДНК. Стабильно трансформированные растения R0 самоопылялись, давая потомство R1.
[0098] Трансгенные семена R1, содержащие экспрессионные кассеты для TIC5290, высевали в 25-сантиметровые горшки, как и семена, соответствующие не трансгенному контролю. Растения выращивались в камере с контролируемой средой с фотопериодом шестнадцать часов света при тридцати двух градусах Цельсия и восемь часов темноты при двадцати трех градусах Цельсия, и интенсивностью света от восьмисот до девятьсот микроэйнштейнов. По истечению от сорока до сорока пяти дней после посадки, отдельные растения помещали в изолятор, сделанный из пропускающий воздух пластиковых листов "опыления" (Vilutis and Company Inc, Франкфорт, штат Иллинойс). Листы крепились к основному стержню непосредственно над поверхностью почвы, с использованием застежки Velcro®. Две пары взрослых особей (в возрасте 6-ти дней), половозрелых самцов и самок Lygus lineolaris или Lygus hesparus из лабораторной культуры собирали в четырнадцатимиллиметровую пластиковую трубку с круглым дном (Becton Dickson Labware, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси) и использовали для каждого растения. Взрослые особи высвобождали в каждый отдельный изолятор через небольшую щель на стороне изолятора и затем изолятор надежно закрывали, гарантируя, что насекомые не сбегут. Насекомых, имеющих возможность спариваться, и растения содержали в изоляторе в течение двадцати одного дня. Через двадцать один день растения подрезали под изоляторами и перемещали в лабораторию, где насекомых собирали с каждого растения и подсчитывали. Перед открытием изолятора, растения интенсивно встряхивали, чтобы все насекомые отцепились от мест кормления и упали до основания изолятора. Затем основание изолятора открывали и весь растительный помещали на черный лист. Насекомые собирались с помощью аспиратора. Затем растение тщательно проверяли с целью удаления любых оставшихся насекомых. Для каждого растения фиксировали количество насекомых и их стадию развития. Подсчет насекомых делили на несколько групп, основанных на зрелость организма Лигуса; нимфы до 3-го возраста, 4-го возраста, 5-го возраста и взрослые особи. Трансгенные растения хлопчатника, демонстрирующие сокращение числа личинок и взрослых особей по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями хлопчатника, демонстрируют устойчивость к полужесткокрылым вредителям, посредством экспрессии белка-токсина TIC5290.
[0099] Все композиции, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть сделаны и выполнены без излишнего экспериментирования в свете данного описания. Хотя композиции данного изобретения были описаны с точки зрения вышеизложенных иллюстративных вариантов реализации изобретения, специалистам в данной области техники будет понятно, что варианты, изменения, модификации и перестройки могут быть применены к композиции, описанной в данном документе, без отступления от концепции, сущности и объема данного изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые вещества, являющиеся как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены на вещества, которые описаны в данном изобретении, при этом будут достигнуты такие же или сходные результаты. Все таковые аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы сущности, объема и концепции данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
[00100] Все публикации и опубликованные патентные документы, цитируемые в данной спецификации, включены в данный документ посредством ссылки в том же объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| НОВЫЕ БЕЛКИ, ИМЕЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ В ОТНОШЕНИИ НАСЕКОМЫХ | 2017 |
|
RU2781075C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ | 2017 |
|
RU2765722C2 |
| НОВЫЕ БЕЛКИ, ОБЛАДАЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ НАСЕКОМЫХ | 2015 |
|
RU2740313C2 |
| СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ПЕСТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2017 |
|
RU2772947C2 |
| ТОКСИН AXMI277 ПРОТИВ НЕМАТОД И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2012 |
|
RU2706488C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ | 2010 |
|
RU2613778C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ | 2017 |
|
RU2765304C2 |
| ГЕН АХМ1554, КОДИРУЮЩИЙ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИН, И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2755282C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2016 |
|
RU2759224C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2016 |
|
RU2745306C2 |
Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, для обеспечения растению устойчивости к насекомым из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых. Также раскрыты трансформированное растение и его часть, семя, композиция, товарный продукт, содержащие указанную молекулу, полипептид, кодируемый указанной молекулой. Раскрыты способ борьбы с чешуекрылыми и жесткокрылыми насекомыми-вредителями с помощью указанной молекулы, способ детекции указанной молекулы. Изобретение позволяет эффективно бороться с чешуекрылыми и жесткокрылыми насекомыми-вредителями. 10 н. и 24 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 6 пр.
1. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты для обеспечения растению устойчивости к насекомым из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, содержащая гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его пестицидный фрагмент, при этом:
a. указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или
b. указанный пестицидный белок обладает пестицидной активностью, содержит домен PA14 Pfam и домен Binary_toxB Pfam и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
2. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
3. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что:
a. молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая функционирует, экспрессируя пестицидный белок в растении; или
b. молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты экспрессируется в растительной клетке, продуцируя пестицидно эффективное количество пестицидного белка; или
c. молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с вектором и указанный вектор выбран из группы, состоящей из плазмиды, фагмиды, бакмиды, космиды и бактериальной или дрожжевой искусственной хромосомы.
4. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, которая определяется как присутствующая в клетке-хозяине, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной и растительной клетки.
5. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 4, отличающаяся тем, что бактериальная клетка-хозяин происходит из рода бактерий, выбранных из группы, состоящей из: Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea и Erwinia.
6. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 5, отличающаяся тем, что вид Bacillus представляет собой Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанный Brevibacillus представляет собой Brevibacillus laterosperus или указанный Escherichia представляет собой Escherichia coli.
7. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 4, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка представляет собой клетку двудольного или однодольного растения.
8. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 7, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из [растительной клетки] люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквенных, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, корневищных злаков, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
9. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок проявляет активность против насекомого отряда жесткокрылых.
10. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 9, отличающаяся тем, что указанное насекомое представляет собой западного кукурузного жука, южного кукурузного жука, северного кукурузного жука, мексиканского кукурузного жука, бразильского кукурузного жука или группу бразильского кукурузного жука, состоящую из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa.
11. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок проявляет активность против вида насекомого отряда чешуекрылых.
12. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 11, отличающаяся тем, что указанное насекомое представляет собой совку бархатных бобов, огневку тростниковую, точильщика зернового кукурузного, совку хлопковую, табачную листовертку, соевую совку, африканскую совку, южную совку, совку травяную, совку свекольную, совку американскую, азиатскую хлопковую совку, розового коробочного червя хлопчатника, совку-ипсилон, огневку кукурузную юго-западную или мотылька стеблевого кукурузного.
13. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок проявляет активность против насекомого отряда полужесткокрылых.
14. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 13, отличающаяся тем, что указанное насекомое представляет собой слепняка западного матового, клопа травяного или хлопкового слепняка.
15. Трансформированное растение, которое обладает устойчивостью к насекомым из отрядов жесткокрылых, чешуекрылых и/или полужесткокрылых, содержащее молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
16. Часть трансформированного растения, которое обладает устойчивостью к насекомым из отрядов жесткокрылых, чешуекрылых и/или полужесткокрылых, содержащая молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
17. Растение по п. 15 или часть растения по п. 16, где указанное растение является однодольным растением или двудольным растением.
18. Растение по п. 15 или часть растения по п. 16, где растение выбирают из группы, состоящей из люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквенных, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, корневищных злаков, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
19. Семя растения по п. 15, отличающееся тем, что указанное семя предназначено для получения растения, обладающего устойчивостью к насекомым из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, и где семя содержит молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
20. Композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, содержащая пестицидно эффективное количество молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
21. Композиция по п. 20, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один другой пестицидный агент, который отличается от указанного пестицидного белка.
22. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один другой пестицидный агент выбирают из группы, состоящей из белка, обладающего ингибиторной активностью в отношении насекомых, молекулы дцРНК, обладающей ингибиторной активностью в отношении насекомых, и вспомогательного белка.
23. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один другой пестицидный агент проявляет активность в отношении одного или более видов вредителей отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых.
24. Композиция по п. 23, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один другой пестицидный белок выбран из группы, состоящей из Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C; вариантов Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, химер Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, вариантов Cry3A; Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113 и AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z и AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 и их вариантов, IP3 и его вариантов, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 и белка DIG-11.
25. Композиция по п. 20, которая определяется как содержащая растительную клетку, которая экспрессирует указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты.
26. Товарный продукт для подачи в качестве корма, полученный из растения по п. 15 или части растения по п. 16, отличающийся тем, что товарный продукт содержит определимое количество указанной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты или пестицидного белка, кодируемого ею.
27. Товарный продукт для подачи в качестве продуктов питания, полученный из растения по п. 15 или части растения по п. 16, отличающийся тем, что товарный продукт содержит определимое количество указанной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты или пестицидного белка, кодируемого ею.
28. Товарный продукт по п. 26 или 27, выбранный из группы, состоящей из товарной кукурузы, упакованной обработчиком зерна, кукурузных хлопьев, кукурузных лепешек, кукурузной муки, кукурузной муки крупного помола, кукурузного сиропа, кукурузного масла, кукурузного силоса, кукурузного крахмала, кукурузной каши и тому подобного, цельных или обработанных семян хлопчатника, хлопкового масла, линта, семян и частей растений, обработанных для корма или продуктов питания, волокна, бумаги, биомассы и топливных продуктов, таких как топливо, полученное из хлопкового масла или пеллетов, полученных из отходов хлопковой очистки, цельных или обработанных семян сои, соевого масла, соевого белка, соевой муки крупного помола, соевой муки, соевых хлопьев, соевых отрубей, соевого молока, соевого сыра, соевого вина, корма для животных, содержащего соевые бобы, бумаги, содержащей сою, сливок, содержащих сою, биомассы соевых бобов и топливных продуктов, произведенных с использованием растений сои и частей растений сои.
29. Способ борьбы с чешуекрылыми, или жесткокрылыми, или полужесткокрылыми насекомыми-вредителями или поражением насекомыми из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, причем указанный способ включает:
a. приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством пестицидного белка, как указано в SEQ ID NO: 2; или
b. приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, которые имеют домен PA14 Pfam и домен Binary_toxB Pfam, и содержащих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
30. Способ по п. 29, в котором указанный один или более пестицидных белков содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
31. Способ детекции наличия молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 в образце, содержащем геномную ДНК растений, включающий:
a. приведение в контакт образца с зондом нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с геномной ДНК из растения, содержащего молекулу ДНК по п. 1, и не гибридизуется в таких условиях гибридизации с геномной ДНК из другого изогенного растения, которое не содержит молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2;
b. применение к образцу жестких условий гибридизации; и
c. обнаружение гибридизации зонда с ДНК образца.
32. Способ обнаружения наличия пестицидного белка в образце, содержащем белок, при этом указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или указанный пестицидный белок обладает пестицидной активностью, содержит домен PA14 Pfam и домен Binary_toxB Pfam и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2, включающий:
a. приведение в контакт образца с иммунореактивным антителом; и
b. обнаружение наличия белка.
33. Способ по п. 32, в котором указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
34. Способ по п. 32 или 33, отличающийся тем, что этап обнаружения включает твердофазный иммуноферментный анализ ELISA или вестерн-блоттинг.
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2004 |
|
RU2382822C2 |
| DE 602004030044 D1, 23.12.2010 | |||
| US 8895306 B2, 25.11.2014. | |||
