АССОЦИАЦИЯ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА, БИОПРЕПАРАТ, ПОВЫШАЮЩИЙ ПЛОДОРОДИЕ ПОЧВЫ И ОЗДОРАВЛИВАЮЩИЙ ЕЕ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОГРИБКОВЫМИ И СТИМУЛИРУЮЩИМИ РОСТ РАСТЕНИЙ СВОЙСТВАМИ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A01N63/02 C12N1/20 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и касается получения препаратов для улучшения плодородия почвы, ее оздоровления, и, в частности, касается получения биопрепарата на основе ассоциации бактерий.

Во многих микробиологических процессах, происходящих в почве, большую роль играют аэробные спорообразующие бактерии. На их основе приготовлены многие биологические препараты.

Известен препарат, содержащий штаммы бактерий Bacillus subtilis strain GB03 and Bacillus amyloliquefaciens strain IN937a (US №6524998, A01N 043/08, 25.02.2003), который обладает стимулирующей рост растений активностью.

Действие этого препарата ограничено только стимулирующей рост растений активностью.

Известен препарат, содержащий в своем составе композицию штаммов бактерий: Bacillus cereus NRRL B-30517 and NRRL-В-30519, Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-30518 and Bacillus subtilis NRRL B-30520, которая обладает действием против фитопатогенных грибов рода Phytophthora, в частности вида Phytophthora capsici (US №6589524, A01N 025/00, 08.07.2003).

Недостатком данного препарата является то, что он применяется как фунгицид по отношению к грибам только одного рода.

Эти препараты применяют только в период вегетации растений.

Задачей настоящего изобретения является получение ассоциации штаммов бактерий для получения препарата, повышающего плодородие почвы и оздоравливающего почву, и получение указанного препарата.

Технический эффект, который может быть получен при использовании предлагаемых объектов, заключается в улучшении плодородия почвы, ее оздоровлении, кроме того, биопрепарат обладает противогрибковыми и стимулирующими рост растений свойствами.

Технический эффект достигается тем, что предлагается ассоциация штаммов бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 для получения биопрепарата, повышающего плодородие почвы и оздоравливающего ее, обладающего противогрибковыми и стимулирующими рост растений свойствами.

Культуры, составляющие ассоциацию, выделены из ризосферы пшеницы плодородных почв. Для выделения бактерий применяли прямой высев из образцов. Многостадийное селекционирование вели по принципу отбора штаммов, растущих при пониженной температуре (+4°С) и обладающих различной ферментативной активностью [азотфиксирующей, фосфорилирующей, аммонифицирующей, гидролитической) и фунгицидной одновременно.

Культуры, составляющие ассоциацию, хранятся в музее культур микроорганизмов в ООО «БИО-АГАТ-ГРУПП» под коллекционными номерами: Bacillus subtilis БАГ-1 (st. K-4), Bacillus subtilis БАГ-2 (st. Be-12), Bacillus amyloliquefaciens БАГ-3 (st. 30-40).

Штамм бактерии Bacillus subtilis, K-40, (ВКМ В-2430D) выделен из ризосферы пшеницы, получен путем многостадийного селекционирования.

Культурально-морфологические признаки штамма.

На агаризованной среде 48-часовая культура имеет серовато-белые колонии, мелкоморщинистые, с неровными краями. На МПБ через 18-24 ч образует на поверхности среды пленку и хлопьевидный осадок и взвесь.

При микроскопии - палочки одиночные и в цепочках, 0.6-0.7×2.0-3.0 мкм, споры овальные, спорангий нераздутый, споры расположены эксцентрально. Грам-положительные.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма.

Каталазо-положительный, обладает амилолитической активностью - гидролизует крахмал до декстринов; продуцирует ферменты: протеазы, лизиндекарбоксилазу; аргининдегидролазу; орнитиндекарбоксилазу; фенилаланиндезаминазу; фитиндекарбоксилазу; уреазу; в-галактозидазу. Образует ацетоин.

Генетические особенности штамма.

Штамм не нуждается в факторах роста, стабилен и не является генетически модифицированным.

Отличительной особенностью штамма является широкий спектр ферментативной и фунгицидной активностей.

Штамм бактерии Bacillus amyloliquefaciens, 30-40, (ВКМ В-2432D) выделен из ризосферы пшеницы, получен путем многостадийного селекционирования.

Культурально-морфологические признаки.

На агаризованной среде культура имеет белые непрозрачные колонии, мелкоморщинистые, с изрезанными краями.

При микроскопии - палочки одиночные и в цепочках, 0.7-0.9×3 мкм, споры овальные, спорангий нераздутый, споры расположены эксцентрально. Грам-положительные.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма.

Каталазо-положительный, обладает амилолитической активностью - гидролизует крахмал до декстринов; образует ацетоин, рН больше 6.0. Использует пропионат как источник углерода и не использует цитрат. Не растет в анаэробных условиях. Растет при 7% NaCl. Переводит нитраты в нитриты.

Авторами была установлена азотфиксирующая активность штамма, которая является его отличительной особенностью, не характерной для бацилл.

Генетические особенности штамма.

Штамм не нуждается в факторах роста, стабилен и не является генетически модифицированным.

Штамм бактерии Bacillus subtilis Be12 (ВКМ В-2431D) выделен из луговой почвы, получен путем многостадийного селекционирования.

Культурально-морфологические особенности штамма.

На агаризованной среде культура имеет плотные непрозрачные колонии, с возрастом становящиеся темно-коричневого цвета. Колонии неправильной формы с валиком по краю.

При микроскопии - палочки одиночные и в цепочках, 0.9-1.0×3.0-3.6 мкм, споры овальные, спорангий нераздутый, споры расположены эксцентрально. Грам-положительные.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма.

Каталазо-положительный, обладает амилолитической активностью, продуцирует ферменты: протеазы. Образует ацетоин. Образует кислоту из D-глюкозы и L-арабинозы. Не способен расти в анаэробных условиях. Растет при 7% NaCl. Обладает нитратредукцией. Использует пропионат как источник углерода и не использует цитрат. Не растет при 55°С.

Генетические особенности штамма.

Штамм не нуждается в факторах роста, стабилен и не является генетически модифицированным.

Особенностью этого штамма в отличие от других штаммов, входящих в ассоциацию, является продукция вторичных метаболитов, относящихся к гексаенам (соединениям с шестью сопряженными двойными связями), - фунгицидов в количестве 100 мг/л - 200 мг/л, а также способность переводить нерастворимые соединения фосфорной кислоты в растворимое состояние - форму, доступную для растений.

Штаммы Bacillus subtilis K-4 и Bacillus amyloliquefaciens 30-40 также синтезируют соединения группы гексаенов.

Таким образом, основными свойствами бактерий ассоциации являются: азотфиксирующая, фосфорилирующая, аммонифицирующая, гидролитическая и фунгицидная активности.

Фунгицидная активность предлагаемой ассоциации штаммов бактерий показана в отношении фитопатогенных грибов родов Fusarium, Alternaria, Botrytis, Helminthosporium, Phytophtora методом дисков на чашках Петри, при этом зона подавления роста фитопатогенов составляла 7-65 мм в диаметре.

В процессе жизнедеятельности штаммы бактерий, входящие в ассоциацию, продуцируют вещества, которые оказывают регулирующее и стимулирующее рост действие на растения. Кроме того, они ведут к оздоровлению почвы за счет подавления и вытеснения фитопатогенных микроорганизмов, так как в ассоциацию входят бактерии, продуцирующие фунгициды.

Культуры сохраняют при температуре 4°С, методом субкультивирования на питательном агаре под вазелиновым маслом.

Предлагается способ получения биопрепарата, повышающего плодородие почвы и оздоравливающего ее, обладающего противогрибковыми и стимулирующими рост растений свойствами, отличающийся тем, что каждую культуру ассоциации штаммы бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 выращивают отдельно на питательной среде, затем полученные культуральные жидкости смешивают в соотношении (1-5):(1-5):(1-5).

Культуральная жидкость содержит живые бактериальные клетки, их споры и метаболиты.

В качестве питательной среды может быть использована, в частности, известная среда (Sato К., Agric. Biol. Chem. 1984, v.48, №8, p.2047-2053).

В смесь культуральных жидкостей для достижения различных целей вносят специальные наполнители.

Так для увеличения срока жизнеспособности микроорганизмов и придания препарату формы пасты в смесь культуральных жидкостей вносят, в частности, каолин в количестве 20-30% от общего состава препарата и соевую муку в количестве 20-30%.

Кроме того, в качестве отдушки препарата и источника микроэлементов и витаминов для штаммов бактерий ассоциации в полученный состав дополнительно вносят гидролизат смеси хвойного экстракта и хлорофилло-каротиновой пасты в концентрации 2.3-4.0%.

Гидролизат готовят путем автоклавирования смеси хвойного экстракта и хлорофилло-каротиновой пасты в присутствии едкого калия при 121°С в течение 30 минут. Хвойный экстракт, хлорофилло-каротиновую пасту и едкий калий берут в соотношении 8: 2,5: 1.

Предлагается также биопрепарат, повышающий плодородие почвы и оздоравлиающий ее, обладающий противогрибковыми и стимулирующими рост растений свойствами, который содержит ассоциацию штаммов бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 в виде смеси культуральных жидкостей, в соотношении (1-5):(1-5):(1-5) и специальные наполнители. Биопрепарат содержит ассоциацию штаммов бактерий в виде смеси культуральных жидкостей, содержащей клетки бактерий, споры и их метаболиты.

Предлагаемый биопрепарат отличается тем, что он содержит каолин в количестве 20-30% от общего состава препарата и соевую муку в количестве 20-30%.

Предлагаемый биопрепарат отличается тем, что он содержит микроэлементы, витамины и одновременно отдушку в виде гидролизата смеси хвойного экстракта и хлорофилло-каротиновой пасты, в количестве 2.3-4%.

Определение биологической активности препарата проводят путем биологического титрования культур.

Возможность использования предлагаемых изобретений подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Каждую культуру ассоциации штаммов бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 выращивают отдельно при 29°С в течение 48 ч на среде, содержащей (г/л):

глюкозы19.00цитрата натрия1.29аммония сульфата1.92калия фосфорнокислого однозамещенного9.30сульфат магния × 7Н₂O0.18водадо 1 л

рН 7,0.

Получают культуральную жидкость с оптической плотностью не менее 30 ед., а титром клеток 1×10⁸-1×10⁹.

Затем полученные культуральные жидкости штаммов указанных бактерий смешивают в соотношении (1:1:1) для образования ассоциации.

В смесь культуральных жидкостей штаммов бактерий ассоциации добавляют 200 г каолина и 200 г соевой муки, перемешивают, выдерживают 30 минут, затем в полученную смесь добавляют 40 г заранее приготовленного гидролизата смеси хвойного экстракта и хлорофилло-каротиновой пасты. Полученный биопрепарат используют для обработки почвы.

Пример 2.

Полученным биопрепаратом в концентрации 12.5 г/га и 25 г/л обработали участки, расположенные в разных районах, после уборки урожая с последующим пожнивным лущением. В таком состоянии участки уходили в зиму. Весной следующего года провели отбор проб почвы в горизонте 0-20 см. Провели анализ проб на содержание азота, фосфора, калия (NPK). Контролем служили данные анализа почвы без обработки препаратом.

Результаты показали, что на обработанных препаратом участках содержание К₂О (мг/100 г) увеличилось при дозе 12.5 г/га на 11.4-20.2, при дозе 25 г/л на 10.9-25.3, в контроле 7.9-15.6; показатели обеспеченности почвы Р₂О₅ (мг/100 г) при дозе 12.5 г/га увеличилось на 4.3-31.3, при дозе 25 г/га увеличилось на 3.4-35, в контроле (-1.2)-7.5; показатели обеспеченности почвы NO₂ (мг/100 г) увеличились при дозе 12.5 г/га на 0.5, при дозе 25 г/га на 1.4-14.6 (таблица 1).

Таким образом, показано, что препарат улучшает плодородие почвы.

Пример 3.

Препаратом в концентрациях 12.5 г/га и 25 г/л обработали участки после уборки урожая с последующим пожнивным лущением. В таком состоянии участки уходили в зиму. Весной следующего года провели отбор проб почвы в горизонте 0-20 см. Контролем служили данные анализа почвы без обработки препаратом.

Анализ проб почвы весной следующего года показывает уменьшение обсемененности возбудителями гельминтоспориоза (шт. на 1 г сух. почвы) по сравнению с контролем на 54-57% при используемой дозе препарата 12.5 г/га и на 43-77% при 25 г/л препарата; уменьшение зараженности возбудителями ржавчины на 40-78% при концентрации 12.5 г/га и на 78-80% при концентрации 25 г/л препарата.

Таким образом, установлено, что препарат обладает способностью подавлять рост некоторых фитопатогенов, т.е. оказывает оздоравливающий эффект на почву и на растения, препятствуя их инфицированию.

Пример 4.

Препарат разводили водопроводной водой до концентрации 0.25%. Опытные участки после уборки озимых колосовых опрыскивают препаратом с нормой расхода рабочей жидкости 400 л/га, с последующей заделкой пожнивных остатков. Контролем служили не обработанные препаратом участки. В конце сентября (сроки оптимальные для зоны) был проведен сев озимой пшеницы сорта Дельта (с нормой высева 220 кг/га) на все участки опыта. Ранней весной следующего года проведена подкормка озимой пшеницы аммиачной селитрой на всех участках опыта, в т.ч. контрольном.

Отмечено в весенний период вегетации увеличение количества аммонификаторов на участках, обработанных препаратом на 0.726-1.164 млрд/г по сравнению с контролем.

Таким образом, показано влияние препарата на улучшение плодородия почвы за счет изменения ее микробиологического состояния.

Пример 5.

Препарат разводили водопроводной водой до концентрации 0.25%. Опытные участки после уборки озимых колосовых обрабатывали препаратом с нормой расхода рабочей жидкости 400 л/га, с последующей заделкой пожнивных остатков.

Контролем служили не обработанные препаратом участки. В конце сентября (сроки оптимальные для зоны) был проведен сев озимой пшеницы сорта Дельта (с нормой высева 220 кг/га) на все участки опыта. Ранней весной следующего года проведена подкормка озимой пшеницы аммиачной селитрой на всех участках опыта, в т.ч. контрольном.

В результате опыта отмечено, что наиболее высокорослые растения формировались на участках, обработанных препаратом, высота растений в фазу выхода в трубку была выше в среднем на 7-10.6 см по сравнению с высотой растений на участках без применения препарата. Масса зерна на участках, обработанных биопрепаратом, возросла на 28.9-24.6%.

Урожайность на участках, где применяли обработку препаратом, увеличилась на 3.8-4.9 ц/га по сравнению с аналогичными без применения биопрепарата. Масса зерна на участках при внесении осенью биопрепарата с минеральной подкормкой аммиачной селитрой возросла на 28.9% (N₃₀ и биопрепарат +N₃₀) и на 24.6% (N₆₀ и биопрепарат +N₆₀) (таблица 2).

Данные урожайности на основе фактически полученной продукции (валовому сбору) показывают, что применение биопрепарата ведет к увеличению зерновой продукции (таблица 3).

Урожайность сельскохозяйственных культур является интегральным показателем эффективности плодородия почвы. Таким образом, показано, что применение биопрепарата ведет к повышению плодородия почвы за счет увеличения ее биологической активности.

Получена новая ассоциация аэробных спорообразующих бактерий, обладающих комплексом активностей, способных размножаться и расти, не подавляя друг друга, при температурах, характерных для условий применения биопрепарата в различных почвенно-климатических регионах в осенний период, в отличие от известных препаратов, применяемых летом.

Противогрибковое действие ассоциации, состоящей из штаммов Bacillus subtilis БАГ-1 (st. K-4), Bacillus subtilis БАГ-2 (st. Be-12), Bacillus amyloliquefaciens БАГ-3 (st. 30-40), подтверждается результатами полевых испытаний предлагаемого препарата.

Препарат вносили в почву перед вспашкой по стерне пшеницы и озимой ржи в дозах 125 и 250 г/га. Анализ микробиологических и агрохимических свойств почвы выявил в таксономической структуре грибов снижение фитопатогенных видов родов Helminthosporium, Fusarium, Alternaria, на 36-52%. В пересчете на 1 га, биомасса грибного мицелия сократилась в корнеобитаемом слое с 85,8 ц/га в контроле до 42,4-53,6 ц/га в опыте. Наибольший фунгистатический эффект на почвенное микробное сообщество препарат оказал в дозе 250 г/га.

Содержание гумуса в результате применения предлагаемого препарата повысилось на 0,33-0,43% (с 1,34-1,37 до 1,67-1,80%), составила при дозе препарата 125 г/га 0,18-0,22% и при дозе 250 г/га 0,35-0,40%; содержание подвижных форм фосфора повысилось, содержание P₂O₅ в почве увеличилось после обработки препаратом в дозе 125 г/га на 30 мг/кг и на 37 мг/кг в дозе 250 г/га.

Предлагаемая ассоциация позволяет получить биопрепарат широкого спектра действия: повышающий плодородие почвы и оздоравливающий почву, который к тому же обладает противогрибковыми свойствами и стимулирующими рост растений свойствами.

Препарат является экологически чистым и безопасным, т.к. микроорганизмы, входящие в него, выделены из почвы, являются непатогенными для человека, животных и растений, генетически немодифицированными. Другие компоненты, входящие в состав, в процессе действия препарата полностью потребляются, являясь компонентами питания микроорганизмов почвы.

Таблица 1
Показатели увеличения обеспеченности почвы NPK (мг/100 г) весной следующего года.Вариант опытаNO₂Р₂O₅К₂ОКонтроль0.4-1.2-7.57.9-15.6Биопрепарат   (12.5 г/га)0.54.3-31.411.4-20.2Биопрепарат   (25 г/га)1.4-14.63.4-35.010.9-25.3Таблица 2
Биологический урожай озимой пшеницы (сорта Дельта) в зависимости от применения биопрепарата (анализ метровок)Вариант опытаСтеблестой (шт/м²)Масса колосьев (г/м²)Масса зерна (г/м²)Выход зерна (%)Биологический урожай (ц/га)общийпродуктивныйN₃₀458.0441.0386.8280.072.428.0N₆₀567.0531.0438.8320.774.532.1Биопрепарат + N₃₀686.0585.8450.6360.980.136.1Биопрепарат + N₅₀704.0676.0486.3399.782.240.0НСР₀₅22.121.216.612.9 1.3

НСР₀₅ - наименьшая существенная разница на 5% уровне значимости. (Общепринятый обязательный показатель статистической обработки данных опыта).

Данный показатель позволяет определить, являются ли различия результатов между вариантами опыта достоверными.

Таблица 3
Влияние осенней обработки почвы (по стерне) биопрепаратом на величину хозяйственного урожаяВариант опытаУрожайность ц/гаПрибавка к контролюц/га%N₃₀23.9--N₆₀25.21.35.4Биопрепарат + N₃₀27.73.815.9Биопрепарат + N₆₀30.16.225.9

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и касается получения препаратов для улучшения плодородия почвы, ее оздоровления, и, в частности, касается получения биопрепарата на основе ассоциации бактерий. Биопрепарат содержит бактерии в виде ассоциации штаммов бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40, в соотношении (1-5):(1-5):(1-5) и наполнители. Культуры микроорганизмов, входящие в ассоциацию, хранятся в коллекции микроорганизмов ООО «БИО-АГАТ-ГРУПП» под номерами Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40. Способ получения биопрепарата заключается в том, что каждую культуру ассоциции выращивают отдельно, полученные культуральные жидкости смешивают в соотношении (1-5):(1-5):(1-5) и в смесь культуральных жидкостей вносят наполнители: каолин, соевую муку, гидролизат смеси хвойного экстракта и хлорофилло-каротиновой пасты. Изобретение позволяет улучшить плодородие почвы, способствует ее оздоровлению и стимулирует рост растений. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Ассоциация штаммов бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 для получения биопрепарата, повышающего плодородие почвы и оздоравливающего ее, обладающего противогрибковыми и стимулирующими рост растений свойствами.2. Биопрепарат, повышающий плодородие почвы и оздоравливающий ее, обладающий противогрибковыми и стимулирующими рост растений свойствами, отличающийся тем, что он содержит бактерии в виде ассоциации штаммов бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 в соотношении (1-5):(1-5):(1-5) и наполнители.3. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что он содержит ассоциацию указанных штаммов бактерий в виде смеси культуральных жидкостей, содержащей клетки бактерий, споры и их метаболиты.4. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что он содержит в качестве наполнителя каолин и соевую муку.5. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что каолин и соевую муку используют в количестве 20-30% от общего состава препарата.6. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что он содержит в качестве наполнителя микроэлементы, витамины и одновременно отдушку в виде гидролизата смеси хвойного экстракта и хлорофиллокаротиновой пасты.7. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что он содержит гидролизат смеси хвойного экстракта и хлорофиллокаротиновой пасты в количестве 2,3-4,0%.8. Способ получения биопрепарата по п.2, заключающийся в том, что каждую культуру ассоциации - штаммы бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 выращивают отдельно, полученные культуральные жидкости смешивают в соотношении (1-5):(1-5):(1-5) и в смесь культуральных жидкостей вносят наполнители.9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве наполнителей в культуральную жидкость вносят последовательно каолин и соевую муку в количестве 20-30%.10. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве наполнителей вносят источник микроэлементов и витаминов и отдушки - гидролизат смеси хвойного экстракта и хлорофиллокаротиновой пасты в количестве 2,3-4,0%.