Настоящее изобретение относится к способам диагностики медицински релевантных состояний путем детекции уровней соответствующих маркеров, являющихся признаком медицински релевантного состояния, и уровней маркеров нормализации. Эти способы относятся к характеризации образца в форме раствора без использования информации о морфологии клеток.
Предшествующий уровень техники
Современная диагностика большого числа медицински релевантных состояний основана на использовании молекулярных маркеров в качестве инструментальных средств. Такие молекулярные средства обычно представляют собой один из аспектов комплексного исследования и позволяют учитывать ряд различных параметров, характеризующих исследуемые образцы.
В медицински релевантном анализе морфологическое исследование образцов обычно осуществляют цитологическими или гистологическими способами. Эти способы основаны на морфологической характеризации клеточных образцов и применяются для анализа медицинских образцов, таких как физиологические жидкости, кровь, хирургические срезы, секреты, мазки или лаважи.
При скрининг-анализе, например, на рак шейки матки, проводимом в целях детекции неопластических поражений шейки матки, используются мазки. В этой скрининг-процедуре обнаруживаются поражения различного происхождения. Причинами, вызывающими такие поражения, могут быть, например, воспаления (вызванные инфекционными агентами либо физическими, или химическими повреждениями) или предопухолевые и опухолевые изменения. При морфологическом анализе трудно различить поражения различного характера. Так, например, для анализа мазков цитологи и патологи должны пройти особую подготовку, и даже опытные специалисты-диагносты при проведении диагностических анализов цитологических образцов получают результаты, которые в высокой степени отличаются как от наблюдений других сотрудников, так и от их собственных наблюдений. Вообще говоря, результат такого исследования основан на субъективной интерпретации диагностических критериев патологом/цитологом, проводящим исследование. В итоге число ложноположительных и ложноотрицательных результатов в таких скрининг-анализах является недопустимо высоким.
Поэтому во многих случаях такие цитологические или гистологические анализы подтверждают с помощью молекулярных маркеров. Такие маркеры часто используют в реакциях иммуногистохимического окрашивания либо в реакциях in situ-гибридизации. В уже разработанных комбинированных исследованиях по морфологии и реакциям иммуногистохимического окрашивания, основанным на использовании маркерных молекул, характеристика различных медицински релевантных состояний тканей или клеток может давать лучшие результаты - см., например, публикацию ЕР 1,217,377. Однако морфологическое исследование все еще остается трудоемким процессом, который требует много времени, а поэтому является дорогостоящим даже при его подтверждении молекулярными методами, которые дают более надежные результаты. Кроме того, диагноз, поставленный на основе данных клеточно-морфологического анализа, даже при его подтверждении молекулярными параметрами зависит от субъективной оценки морфологии отдельными специалистами. Таким образом, диагноз зависит от специалиста, проводящего исследование.
Только в очень редких случаях молекулярные маркеры могут быть использованы в качестве диагностических средств, не требующих дополнительного подтверждения путем проведения морфологического исследования клеток. Особенно это относится к тем случаям, когда маркеры должны быть детектированы в такой среде, где они встречаются лишь в строго определенных условиях. Таким образом, методы диагностики медицинских состояний, осуществляемые лишь на молекулярном уровне и не подтвержденные информацией о морфологии клетки, ограничены лишь теми методами, где используются подходящие маркеры, которые являются строго специфичными для диагностируемого состояния. Так, например, обнаружение вирусных инфекций может быть осуществлено в растворах образцов, поскольку маркеры, указывающие на присутствие вирусов в тканях, не обнаруживаются в нормальных тканях человека.
Воспроизводимость результатов таких исследований может быть повышена путем применения подтверждающих молекулярных методов. Однако проблема, связанная с хранением и получением образцов, не может быть решена лишь дополнительным использованием молекулярных маркеров.
При использовании молекулярных методов в цитологических или гистологических анализах необходимо соблюдать жесткие меры предосторожности при хранении образцов для предотвращения образования артефактов и получения ложных результатов тестов. Это вызвано отчасти отсутствием информации о морфологии клеток, а отчасти нестабильностью молекулярных маркеров, детектируемых во время проведения тестов. Если приготовление, транспортировка или хранение образцов не соблюдаются надлежащим образом, то информация о клетках или даже молекулярная информация может быть вообще утрачена или искажена. Поэтому в данном случае диагноз не может быть установлен либо он может быть ложным. Так, например, интерпретация биоптата или цитологических препаратов часто представляет значительные трудности или вообще невозможна из-за повреждения клеток (физического или биохимического). Что касается образцов ткани или биоптатов, то сохранение молекулярной структуры образцов, которые подвергаются быстрому метаболизму, представляется довольно трудной задачей, поскольку до помещения всего образца в соответствующие консерванты проходит много времени.
Диагностические методы, подтверждаемые морфологическими анализами и осуществляемые в соответствии со стандартными процедурами, имеют два главных недостатка. Во-первых, эти методы в высокой степени зависят от субъективной оценки исследователя. Во-вторых, информация, полученная в морфологических исследованиях, является достаточно чувствительной к процессам разрушения клеток, а поэтому она может приводить к возникновению артефактов после получения образцов. Оба этих аспекта являются причиной плохой воспроизводимости результатов.
Для улучшения диагностики медицински релевантных состояний желательно разработать такие способы, которые не зависели бы от результатов морфологического исследования клеток.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу диагностики медицински релевантного состояния пациента. Этот способ включает в себя стадии получения исходного образца, содержащего клетки или клеточный дебрис, полученный из клеток, взятых у пациента; получения раствора указанного исходного образца; детекции уровней одного или нескольких релевантных маркеров, ассоциированных с указанным медицински релевантным состоянием в указанном растворе образца; детекции уровней одного или нескольких маркеров нормализации; нормализации детектируемого уровня релевантных маркеров по указанным параметрам нормализации; и диагностики медицински релевантного состояния, исходя из нормализованных уровней указанных релевантных маркеров в растворе образца. Указанные маркеры нормализации коррелируют, по меньшей мере, с одним из нижеследующих параметров нормализации: присутствием или отсутствием клетки конкретного типа среди клеток, присутствующих в растворе образца, наличием или отсутствием конкретного характера дифференцировки клеток, представленных в растворе образца; и наличием или отсутствием соответствующей способности к пролиферации данных клеток, представленных в растворе образца.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанным медицински релевантным состоянием является клеточное пролиферативное расстройство, рак или предшествующее ему поражение.
Настоящее изобретение также относится к тест-набору для диагностики медицински релевантного состояния.
Краткое описание графического материала
Настоящая патентная заявка содержит по меньшей мере одну иллюстрацию, выполненную в цвете. Копии этого патента или публикация патентной заявки с цветной(ыми) иллюстрацией(ями) будут предоставлены Патентным ведомством по требованию и после уплаты необходимой пошлины.
На фиг. 1 проиллюстрировано специфическое иммуногистохимическое окрашивание эндоцервикальных и эктоцервикальных эпителиальных клеток в цервикальных срезах. На фиг. 1А показана положительная реакция, детектируемая в цилиндрическом эпителии эндоцервикса (слизистой оболочки канала шейки матки) с использованием антитела, направленного против цитокератина 18 (СК18). На фиг. 1В показано неспецифическое окрашивание в цилиндрическом эпителии эктоцервикса с использованием антитела, направленного против цитокератина 18 (СК18). На фиг. 1С показано неспецифическое окрашивание в цилиндрическом эпителии эндоцервикса с использованием антитела против цитокератина 10/13 (СК10/13). На фиг. 1D показано интенсивное окрашивание сквамозного эпителия эктоцервикса с использованием антитела против цитокератина 10/13 (СК10/13).
На фиг. 2 проиллюстрирован Вестерн-блот-анализ солюбилизированных образцов, взятых из цервикальных мазков. Цифры 1-4 относятся к образцам (цервикальным мазкам), полученным от отдельных пациентов.
На фиг. 3 показаны Вестерн-блот-анализ и анализ ELISA, иллюстрирующие адекватность (компетентность) образцов. Образцы, взятые от четырех пациентов с высокозлокачественной дисплазией шейки матки (см. "Диагностика"), были проанализированы с использованием Вестерн-блот-анализа (верхняя часть на фигуре). В нижней части этой фигуры представлены результаты анализов ELISA.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам улучшения диагностики медицински релевантных состояний путем проведения тест-процедур с использованием растворов тестируемых образцов. Настоящее изобретение относится к способу, в котором вместо информации о морфологии клеток, получаемой на основании данных цитологических и/или гистологических анализов тест-образцов, используется молекулярная информация, полученная путем анализа раствора, где исходный тест-образец является растворенным, а поэтому он является пригодным для проведения точного и воспроизводимого анализа исходя из указанных растворенных тест-образцов. Способ согласно изобретению включает в себя стадии определения уровней одного или нескольких маркеров, ассоциированных с диагностируемым состоянием; определения уровня серии маркеров нормализации, которые могут быть использованы вместо информации, относящейся к морфологическим аспектам данного образца, и которые должны установить или подтвердить диагноз, поставленный с использованием клеточной тест-системы; сравнения и/или объединения данных, относящихся к уровням указанных маркеров; и установления диагноза медицински релевантного состояния.
В настоящем изобретении указывается, что диагностика состояний, которые обычно (в клеточных системах диагностики) определяются и/или подтверждаются гистологическими и/или цитологическими анализами, может быть осуществлена в растворах исходных образцов, содержащих клетки различных типов с различными свойствами, способом, включающим следующие стадии: получения исходного образца; растворения указанного образца в соответствующем растворе; детекции уровня одного или нескольких маркеров, ассоциированных с диагностируемым состоянием и, кроме того, одного или нескольких маркеров нормализации в растворе указанного образца; нормализации данных, коррелирующих с уровнем маркеров, ассоциированных с указанным состоянием, с использованием данных, коррелирующих с указанными маркерами нормализации; и диагностики наличия или отсутствия данного состояния исходя из анализа указанного образца.
Способ согласно изобретению может быть применен, например, для первичного скрининг-анализа в случаях, когда обычно проводят цитологический, гистологический или патологический анализ. Применение способа согласно изобретению позволяет определить, можно ли диагностировать данное состояние исходя из анализа данного образца. Если диагноз, основанный на анализе раствора, дает отрицательный результат в отношении наличия конкретного состояния, то проведение дополнительного анализа может оказаться ненужным. Если был получен положительный результат, то он может быть дополнительно подтвержден классическими методами. Таким образом, путем проведения предварительного недорогостоящего и быстрого скрининг-теста можно избежать проведения дорогостоящего и занимающего много времени микроскопического анализа или других подобных анализов.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу улучшения диагностики медицински релевантных состояний, где диагноз устанавливают с использованием растворов исходных образцов лизированных тканей или клеток. Способ диагностики согласно изобретению основан не на морфологических параметрах, а на биохимическом анализе.
Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к способу характеризации комплексного образца в растворе с помощью молекулярных маркеров, коррелирующих с представляющими интерес параметрами, что позволяет отказаться от получения информации путем проведения цитологических или гистологических анализов тем или иным способом.
В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к подходящим комбинациям маркеров для диагностики конкретного медицински релевантного состояния с использованием комплексных образцов. Маркеры для нормализации выбирают так, чтобы из исходного образца можно было определить параметры, которые помогли бы поставить или подтвердить соответствующий диагноз и которые могли бы заменить данные, утраченные при растворении образца.
В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к тест-набору для установления диагноза или для проведения научных исследований в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение позволяет быстро и легко диагностировать данное состояние путем анализа исходного образца, такого как физиологические жидкости, мазки, лаважи (например, бронхоальвеолярные лаважи, лаважи млечных протоков и т.п.), аспираты (аспираты, взятые иглой; аспираты, взятые тонкой иглой) или комплексные клеточные или тканевые образцы. Вообще говоря, проблема, связанная с использованием исходных образцов, заключается в том, что в данном образце присутствуют клетки других типов, а также конкретные микроорганизмы и внеклеточные субстанции. Таким образом, исходный материал содержит смесь клеток и композиций, что может приводить к образованию артефактов. Присутствие клеток различных типов с различными пролиферативными свойствами, а также различных микроорганизмов и веществ в исходном образце приводит к появлению множества факторов, которые могут влиять на конкретный уровень маркерной молекулы. Таким образом, диагностически полезную информацию дает детекция уровня лишь одного единственного молекулярного маркера, если, кроме того определить (морфологические) параметры, относящиеся к исходному образцу. Все морфологические данные, получаемые из исходного образца, утрачиваются из-за лизиса клеток в растворе. Однако имеются подходящие молекулярные маркеры, соответствующие конкретным морфологическим или другим параметрам, получаемым гистологическими и цитологическими методами.
Так, например, информация об одном компоненте в исходном образце может быть получена классическим способом путем исследования под микроскопом. Морфологическое исследование дает сведения о дифференцировке и локализации клеток, а также об окружении указанных клеток. Так, например, конкретные клетки в цитологических препаратах цервикальных мазков могут быть идентифицированы как эпителиальные клетки и, кроме того, они могут быть классифицированы как эндоцервикальные или эктоцервикальные эпителиальные клетки. Путем исследования под микроскопом может быть легко выявлено даже присутствие не-цервикальных клеток, таких как эндометриальные клетки.
В соответствии с настоящим изобретением исходные материалы могут быть непосредственно растворены в соответствующем растворителе, без дополнительного препарирования или характеризации, независимо от гомогенности или гетерогенности исходного материала. Данные, потеря которых обусловлена лизисом материала, содержащегося в растворе образца, определяются уровнями серии маркерных молекул, а поэтому могут быть восстановлены с использованием указанных молекулярных данных для нормализации по соответствующим морфологическим параметрам. Это может быть достигнуто с использованием подходящей серии молекулярных маркеров для каждого из характеристических параметров, необходимых для установления точного диагноза. Путем детекции соответствующего массива маркеров может быть проведена оценка соответствующих параметров, характеризующих данный исходный образец, что позволяет избежать нежелательной потери информации из-за лизиса образца.
Тест-процедура согласно изобретению включает детекцию уровней маркеров, являющихся признаками рассматриваемых клеточных состояний, и маркеров для нормализации данных по параметрам, характеризующим конкретное окружение тестируемого образца. Маркеры, подходящие для использования в настоящем изобретении, могут иметь различное происхождение. Характер экспрессии маркера, подходящего для детекции рассматриваемых состояний, может зависеть от пролиферативного статуса клеток, от статуса дифференцировки клеток, от типа клеток или от вида организма. Примеры подходящих маркеров описаны ниже.
Используемый здесь термин "диагностика", по существу, означает любой анализ на наличие или отсутствие медицински релевантного состояния. Так, например, термин "диагностика" включает в себя процедуры, такие как скрининг на предрасположенность к медицински релевантному состоянию, скрининг на предвестник медицински релевантного состояния, скрининг на медицински релевантное состояние и клинический или патологический диагноз медицински релевантного состояния и т.п. Используемый здесь термин "диагностика медицински релевантного состояния" может включать в себя оценку любого состояния, детектируемого на цитологическом, гистологическом, биохимическом или молекулярно-биологическом уровне, и может относиться к здоровью и/или организму человека. Такие исследования могут включать в себя, например, анализы, проводимые методами медицинской диагностики, и научные исследования в области биологии. В одном из вариантов осуществления изобретения такой метод используется для диагностики медицински релевантных состояний, например, таких как заболевания. Такими заболеваниями могут быть, например, расстройства, характеризующиеся пролиферацией клеток или тканей дикого типа.
В одном из вариантов осуществления изобретения термин "диагностика" относится к диагностике рака и предраковых состояний, к мониторингу течения ракового заболевания, к прогностической оценке рака и к обнаружению диссеминированных опухолевых клеток, например, в процессе установления диагноза минимального остаточного заболевания. Способ согласно изобретению может быть, например, применен для клинической или патологической диагностики рака и предраковых состояний или в рутинных скрининг-тестах, осуществляемых для выявления конкретного ракового заболевания, таких как, например, анализы мазков, например, в скрининг-тестах на поражения шейки матки, анализ бронхиальных лаважей на рак легких, или анализ на поражение желудочно-кишечного тракта, например, на поражение прямой и толстой кишки.
Способ согласно изобретению может быть применен ко всем типам медицински релевантных состояний.
Используемый здесь термин "медицински релевантные состояния" может, например, включать в себя состав тканей, физиологических жидкостей, секретов, промывок или мазков. Понятие "состояния" может, например, подразумевать клеточный состав физиологических жидкостей, такой как состав крови, состав жидкости или состав спермы. В этом контексте термин "состав" будет означать, например, присутствие или отсутствие клеток конкретных типов (например, патогенов, таких как вирусы и т.п.; пренеопластических, неопластических и/или диспластических клеток и т.п.), наличие или отсутствие определенного характера дифференцировки клеток конкретного типа, общее число клеток конкретного типа (например, эритроцитов, лейкоцитов, клеток спермы и т.п.), общее число всех клеток любого типа или фракции клеток с другими свойствами, присутствующих или отсутствующих в данном образце.
Кроме того, термин "медицински релевантные состояния" может также включать в себя нарушения, относящиеся к клеткам или тканям. Термин "диагностируемые состояния" может включать параметры, относящиеся к клеткам в цитологических или гистологических образцах тканей. Термин "состояния" может включать определенный характер дифференцировки клеток в образце тканей, таком как образцы хирургических срезов, биоптаты, мазки, лаважи и т.п. Такими состояниями могут быть, например, наследственные расстройства, воспалительные заболевания, механические нарушения, травмы, сосудистые заболевания, дегенеративные нарушения, нарушения роста, доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли. В другом аспекте согласно изобретению такими расстройствами могут быть расстройства, характеризующиеся наличием или отсутствием пролиферативных свойств. Состояниями, характеризующимися наличием или отсутствием пролиферативных свойств, могут быть, например, клеточные пролиферативные расстройства.
Клеточные пролиферативные расстройства согласно изобретению включают в себя заболевания, характеризующиеся способностью клеток или тканей к аномальному росту по сравнению с нормальным ростом контрольных клеток или тканей. Рост таких клеток или тканей может быть, например, аномально ускоренным, пониженным, либо он может подвергаться аномальной регуляции. Используемый здесь термин "аномальная регуляция" может означать любую форму присутствия или отсутствия клеточного или тканевого ответа не-дикого типа на природные процессы, влияющие на регуляцию роста. Термин "аномалии роста клеток или тканей" может означать, например, неоплазию или гиперплазию.
В одном из вариантов осуществления изобретения клеточными пролиферативными расстройствами являются опухоли. Термин "опухоли" может включать опухоли головы и шеи, опухоли дыхательных путей, опухоли аногенитального тракта, опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли мочевой системы, опухоли репродуктивной системы, опухоли эндокринной системы, опухоли центральной и периферической нервной системы, опухоли кожи и ее деривата, опухоли мягких тканей и костей, опухоли лимфопоэтической и гематопоэтической системы и т.п. Термин "опухоли" может также означать неоплазмы, такие как доброкачественные и злокачественные опухоли, карциномы, саркомы, лейкозы, лимфомы или дисплазии. В конкретном варианте осуществления изобретения такими опухолями являются, например, рак головы и шеи, рак дыхательных путей, рак аногенитального тракта, рак желудочно-кишечного тракта, рак кожи и ее деривата, рак центральной и периферической нервной системы, рак мочевыделительной системы, рак репродуктивной системы, рак эндокринной системы, рак мягких тканей и костей, рак лимфопоэтической и гематопоэтической системы и т.п.
Опухоли аногенитального тракта могут включать в себя рак промежности, рак кожи промежностно-мошоночной области, рак шейки матки, рак вульвы, рак влагалища, рак пениса, рак заднего прохода и т.п. Рак шейки матки может включать в себя сквамозные поражения, железистые поражения или другие эпителиальные опухоли. Сквамозные поражения включают в себя, например, интраэпителиальные опухоли шейки матки (слабая, умеренная и значительная дисплазия), карцинома in situ, плоскоклеточная карцинома (кератинизирующие, не-кератинизирующие, сосочковые, онкопластические, папиллярные и лимфоэпителиомоподобные карциномы). Железистые поражения могут включать в себя атипичные гиперплазии, аденокарциномы in situ, аденокарциномы (например, слизеобразующая, эндометриоидная, аденокарцинома прозрачных клеток, злокачественная денома, папиллярная, серозная или мезонефрическая аденокарцинома). Другие эпителиальные опухоли могут включать в себя аденосквамозную карциному, стекловидноклеточную карциному, аденокистозную карциному, аденобазальноклеточную карциному, карциноидную опухоль, мелкоклеточную карциному и недифференцированную карциному. Для более подробной информации можно обратиться к работе "Kurman R., Norris H. et al., Tumors of the Cervix, Vagina and Vulva, Atlas of Tumor Pathology, 1992, AFIP", содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Опухоли желудочно-кишечного тракта могут включать в себя рак ободочной кишки, рак восходящей ободочной кишки, нисходящей ободочной кишки, поперечной ободочной кишки, сигмовидной ободочной кишки, рак прямой кишки, рак тонкой кишки, рак тощей кишки, рак двенадцатиперстной кишки, рак желудка, рак пищевода, рак печени, рак желчных путей, рак билиарной системы, рак поджелудочной железы и т.п. Исчерпывающее описание поражений желудочно-кишечного тракта приводится в работе "Hamilton Sr., Aaltonen LA (Eds.): World Health Organization Classification of Tumors, Pathology and Genetics of Tumors of the Digestive System, LARC Press: Lyon 2000", которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Термин "опухоли дыхательных путей" может означать любое злокачественное заболевание дыхательных путей, такое, например, как, рак легких, альвеол, бронхиол, бронхиального дерева и бронхов, рак носоглотки, рак ротовой полости, рак гортани, рак носовой полости и околоносовой пазухи. К раку легких относится мелкоклеточный рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, плоскоклеточная карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, аденокарцинома легких, крупноклеточная карцинома легких, плоскоклеточная аденокарцинома легких, карциноидная опухоль легких, опухоль бронхиальных желез или (злокачественная) мезотелиома. Общее описание опухолей дыхательных путей можно найти в работе Colby T.V. et al.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of Tumor Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFIP: Washington 1995", которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Опухоли мочевыделительной системы могут включать в себя рак мочевого пузыря, рак почек, рак почечной лоханки, рак мочеточника, рак уретры и т.п. Опухоли репродуктивной системы могут включать в себя рак и предрак яичника, матки, яичек, предстательной железы, эпидидимиса и т.п.
Во всех случаях способы согласно изобретению могут также применяться для лечения предопухолевых поражений, опухолей или рака.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ согласно изобретению предусматривает детекцию диссеминированных опухолевых клеток или метастазов.
В одном из вариантов осуществления изобретения карциномой является, например, рак шейки матки, рак ободочной кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легких, рак ротовой полости и т.п.
Настоящее изобретение относится к ряду надежных, быстрых и легких способов сохранения молекулярных свойств образцов и тем самым предотвращения потери морфологической информации, которую содержат данные образцы. Такие образцы могут быть, например, получены в воспроизводимой и удобной для хранения и транспортировки форме путем растворения клеточных компонентов исходного образца в подходящем растворителе сразу после получения образца или даже во время его получения. Физиологические жидкости могут быть непосредственно перенесены из организма индивидуума в раствор, содержащий подходящие детергенты и консерванты. Кроме того, образцы тканей могут быть непосредственно перенесены в условия денатурирующего лизиса (фактически поддерживаемые физическими силами) и таким образом они могут быть сохранены. Молекулярные компоненты исходного образца могут быть сохранены с использованием соответствующих ингредиентов в растворителе, а поэтому они не могут подвергаться деградации. Деградация ферментативных активностей может быть, например, минимизирована с использованием ингибиторов ферментов. Таким образом, в растворе тест-образцов могут легко сохраняться молекулярные свойства тест-образца в процессе растворения и при этом не требуется соблюдения каких-либо дополнительных условий хранения.
Термин "исходные образцы" может включать в себя клинические образцы, такие как секреты, мазки, лаважи, физиологические жидкости, пробы крови, мочи, спермы, кала, желчи и жидкости, образцы костного мозга, биоптаты и образцы клеток и тканей. Термин "биоптат", используемый в контексте настоящего изобретения, может включать, например, срезы опухолей, образцы тканей, взятые эндоскопическими методами или путем трепанобиопсии или пункционной (аспирационной) биопсии органов. Кроме того, образцом согласно изобретению может быть любой образец, потенциально содержащий детектируемые маркерные молекулы. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный образец включает цервикальные мазки, бронхиальные лаважи, кал и т.п. Термин "исходный образец", используемый в контексте настоящего изобретения, может включать в себя фиксированные или находящиеся на хранении образцы клеток или тканей. Так, например, клетки, сохраненные в подходящих растворах (спиртах и т.п.), или фиксированные образцы тканей могут быть использованы в качестве исходных образцов в способах согласно изобретению.
Исходным образцом, используемым в способе согласно изобретению, является любой образец, содержащий клетки или клеточный дебрис. Такими клетками могут быть, например, прокариотические или эукариотические клетки.
В случае, если настоящее изобретение относится к обнаружению инфекционных заболеваний, то определяемыми клетками могут быть клетки микроорганизмов, таких как хламидии, E.coli, Candida и т.п.
В соответствии с настоящим изобретением все молекулярные компоненты исходных образцов или их часть являются солюбилизированными в подходящем буфере для лизиса, содержащем, например, растворители. Такими растворителями могут быть, например, водные растворы хаотропных агентов, таких как мочевина, GuaSCN, формамид, водные растворы детергентов, таких как анионогенные детергенты (например, ДСН, N-лаурилсаркозин, дезоксихолат натрия, алкиларилсульфонаты, сульфаты длинноцепочечных (жирных) спиртов, сульфаты и сульфонаты олефинов, сульфаты и сульфонаты альфа-олефинов, сульфированные моноглицериды, сульфированные эфиры, сульфосукцинаты, алкансульфонаты, сложные эфиры фосфорной кислоты, алкилизетионаты, сложные эфиры сахарозы), катионогенные детергенты (например, хлорид цетилтриметиламмония), неионогенные детергенты (например, Твин-20, Nonidet P-40, Тритон Х-100, NP-40, Igepal CA-630, N-октилглюкозид) или амфотерные детергенты (например, CHAPS, 3-додецилдиметиламмонийпропан-1-сульфонат, оксид лаурилдиметиламина) и/или водные растворы гидроксидов щелочных металлов, таких как, например, NaOH или КОН. Растворитель выбирают так, чтобы в нем могли растворяться клетки, клеточный дебрис, нуклеиновые кислоты, полипептиды, липиды и другие биомолекулы, которые, возможно, присутствуют в исходном образце. Раствор для растворения исходных образцов согласно изобретению может, кроме того, содержать один или несколько агентов, предотвращающих деградацию компонентов в данных исходных образцах. Такими компонентами могут быть, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеиназы, ингибиторы РНКазы, ингибиторы ДНКазы и т.п. В одном из вариантов осуществления изобретения образец подвергают лизису в той форме, в которой он был непосредственно взят у индивидуумов, подвергаемых обследованию. В другом варианте осуществления изобретения данный образец может быть, кроме того, очищен, а затем подвергнут лизису. Такие процедуры очистки могут, например, включать удаление (путем промывки) примесей, таких как слизь или т.п., выделение или концентрирование клеточных компонентов, сохранение и транспортировку клеток. Так, например, клеточные компоненты исходных образцов могут быть включены в один раствор образца.
Получение образца для его использования в описанном здесь способе может также включать в себя несколько дополнительных стадий приготовления образца, таких как отделение нерастворимых компонентов, выделение полипептидов или нуклеиновых кислот, получение фиксированных на твердой фазе пептидов или нуклеиновых кислот, или получение сфер, мембран или предметных стекол, с которыми могут ковалентно или нековалентно связываться определяемые молекулы.
В соответствии с настоящим изобретением детекцию маркерных молекул осуществляют непосредственно в этом растворе. Такая детекция может быть осуществлена в растворе или с использованием реагентов, фиксированных на твердой фазе. В некоторых вариантах осуществления изобретения детекцию маркерных молекул осуществляют в растворе растворенных в нем физиологических образцов. Поэтому такая детекция может быть проведена в растворе или с использованием реагентов, фиксированных на твердой фазе. Твердой фазой, используемой в контексте настоящего изобретения, могут быть твердые вещества различных типов, такие как плоские поверхности и частицы (включая микро- и наночастицы или даже более мелкие частицы). В некоторых вариантах осуществления изобретения такими частицами могут быть сферы, коллоиды или т.п. Фиксация реагентов на твердой фазе в тест-наборе или в устройстве для in vitro-диагностики может быть осуществлена путем прямой или непрямой фиксации. Прямая фиксация может быть, например, осуществлена путем ковалентного или нековалентного связывания или ассоциации с поверхностями. Непрямая фиксация может быть осуществлена путем связывания реагентов (например, антител, зондов и т.п.) с агентами, которые сами являются непосредственно фиксированными на твердых фазах. Такими агентами могут быть антитела или другие связывающие агенты, такие как стрептавидин, биотин или т.п. Детекция одного или нескольких молекулярных маркеров может быть осуществлена в одной реакционной смеси либо в двух или в нескольких отдельных реакционных смесях. Реакции детекции нескольких маркерных молекул могут быть, например, осуществлены одновременно в мультилуночных реакционных сосудах либо в данном случае она может быть осуществлена на одной, двух или более отдельных тест-пластинах. Маркеры, являющиеся признаками клеточных пролиферативных расстройств, могут быть детектированы с использованием реагентов, которые специфически распознают эти молекулы. Одновременно с этим маркеры нормализации могут быть детектированы с использованием реагентов, специфически распознающих эти маркеры. Реакция детекции маркеров каждого класса может включать одну или несколько дополнительных реакций с детектирующими агентами, которые либо распознают исходные маркерные молекулы либо предпочтительно распознают молекулы-предшественники (например, "первые" антитела), используемые для распознавания исходных маркеров. Реакция детекции, кроме того, может включать "репортерную" реакцию, указывающую на уровень маркеров, являющихся признаком клеточно-пролиферативных расстройств или маркеров нормализации.
Термины "маркер" или "маркерная молекула", используемые в контексте настоящего изобретения во всех грамматических формах, означают нуклеиновую кислоту, а также полипептидные молекулы. Так, например, термины "маркер" или "маркерная молекула" означают, например, РНК (мРНК, чРНК и т.п.), ДНК (кДНК, геномную ДНК и т.п.), белки, полипептиды, протеогликаны, гликопротеины и соответствующие фрагменты этих молекул. Термин "релевантный маркер" означает маркерные молекулы, являющиеся признаками медицински релевантного состояния. Термин "маркер нормализации" означает маркерные молекулы, используемые в целях нормализации.
Используемый здесь термин "уровень маркерной молекулы" означает полуколичественную, а также количественную величину, относящуюся к количеству соответствующего маркера, присутствующего в образце. Количественная величина может быть, например, определена как концентрация. Полуколичественная величина может быть выражена в виде шкалы уровней, например, недетектируемых уровней, низких уровней, промежуточных уровней, высоких уровней или любым другим подходящим способом. Уровень маркера может быть также представлен как зависимый параметр, такой как интенсивность сигнала, генерируемого в формате анализа в ответ на присутствие маркерной молекулы.
Зондом для детекции маркерных молекул, используемым в настоящем изобретении, может быть любая молекула, специфически связывающаяся с указанными маркерными молекулами. Таким зондом может быть, например, антигенсвязывающий агент, такой как антитела (моноклональные или поликлональные антитела), фрагменты антител или искусственные молекулы, содержащие антигенсвязывающие эпитопы, ДНК- или РНК-связывающие молекулы, такие как белки или нуклеиновые кислоты. Нуклеиновыми кислотами, связывающимися с другими нуклеиновыми кислотами, могут быть, например, связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA), олигонуклеотиды (РНК, ДНК, PNA, искусственные нуклеиновые кислоты и т.п.), используемые для детекции, или праймеры.
Говорят, что молекула распознает другие молекулы, если она специфически взаимодействует с этими молекулами. Таким специфическим взаимодействием может быть, например, специфическое связывание этой молекулы с другой молекулой.
"Репортерной" реакцией может быть, например, реакция, продуцирующая окраску соединения. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные "репортерные" вещества, ассоциированные с конкретными маркерами, продуцируют различные цветовые реакции. В другом варианте осуществления изобретения "репортером", специфичным к маркеру нормализации, может быть молекула, гасящая сигнал, продуцированный репортерной молекулой, специфичной к маркеру, ассоциированному с данным медицински релевантным состоянием, в зависимости от уровня маркера нормализации, присутствующего в образце. В еще одном варианте осуществления изобретения, "репортерные" реакции могут продуцировать флуоресцентные красители, излучающие на различных длинах волн. В еще одном варианте осуществления изобретения такой репортерной реакцией может быть излучение света на различных длинах волн, характерных для данных репортерных веществ, специфичных к любому детектируемому маркеру. В другом варианте изобретения такой репортерной реакцией может быть радиоактивное излучение и другие пути, обеспечивающие визуализацию или количественную оценку данного излучения. В одном из вариантов осуществления изобретения различные маркерные молекулы могут распознаваться агентами, несущими радионуклиды, излучающие на различных энергетических уровнях, в результате чего могут распознаваться сигналы, выявляющие маркерные молекулы.
Форматами, применяемыми для реакции детекции согласно изобретению, могут быть методы блоттинга, такие как Вестерн-блот-анализ, Саузерн-блот-анализ и Нозерн-блот-анализ. Методы блоттинга известны специалистам и могут быть осуществлены, например, в формате электроблоттинга, "полусухого" блоттинга, "вакуум"-блоттинга или дот-блоттигна. Кроме того, для детекции молекул могут быть использованы иммунологические методы, такие как, например, иммунопреципитация или иммунологические анализы, такие как ИФА, ELISA, РИА, анализ методом боковых потоков, анализ методом проточной цитометрии, анализ на иммунохроматографических пластинах и т.п. Иммуноанализы, используемые в настоящем изобретении, могут включать как конкурентные, так и не-конкурентные иммуноанализы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения тестирование, проводимое иммунохимическими методами или методами с использованием нуклеиновых кислот, может быть осуществлено с помощью тест-устройства для клинических лабораторий. Таким тест-устройством может быть любое устройство, подходящее для тестирования, проводимого иммунохимическими методами или методами любого формата с использованием нуклеиновых кислот, например точные контрольно-измерительные приборы для испытаний, а также настольные или лабораторные устройства. Эти устройства могут быть также снабжены открытыми или закрытыми системами типа платформ. Эти системы могут быть разработаны на основе любой подходящей методики, такой как, например, использование микротитрационных планшетов, многолуночных планшетов, систем сквозных или боковых потоков, микрочипов или матричных систем, либо систем с использованием сфер или мембран. Используемыми методами детекции могут быть любые методы, известные специалистам, которые обычно применяются для осуществления иммунохимических реакций детекции или реакций детекции на уровне нуклеиновых кислот. Такими системами детекции могут быть, например, люминесцентные системы (электролюминесцентные, биолюминесцентные, фотолюминесцентные, радиолюминесцентные, хемилюминесцентные, электрохемилюминесцентные системы), системы, основанные на флуоресценции, системы, основанные на проводимости, системы, основанные на облучении (видимым светом, УФ-излучением, рентгеновским излучением, гамма-излучением и т.п.), или системы, основанные на применении любого другого известного метода.
В одном из вариантов осуществления изобретения методом детекции уровня маркерных молекул является любой метод, подходящий для детекции даже очень небольшого количества конкретных молекул в биологических образцах. Кроме того, может быть применен любой способ детекции маркерных молекул независимо от его чувствительности. Реакция детекции согласно изобретению может включать, например, реакции детекции на уровне нуклеиновых кислот и/или реакции детекции на уровне полипептидов. В одном из вариантов осуществления изобретения детекция маркерных молекул может включать детекцию конкретных вариантов сплайсинга. В другом варианте осуществления изобретения указанный способ детекции может предусматривать детекцию модификаций маркерных молекул, таких как фосфорилирование, гликозилирование или т.п. полипептидов, или метилирования молекул нуклеиновой кислоты в образцах.
В одном из вариантов осуществления изобретения детекцию уровня маркерных молекул осуществляют путем определения уровня нуклеиновых кислот, кодирующих маркерные молекулы или их фрагменты, присутствующие в образце. Методы детекции молекул нуклеиновых кислот известны специалистам. Процедура детекции нуклеиновых кислот может быть осуществлена, например, посредством реакции связывания детектируемой молекулы с комплементарными нуклеиновокислотными зондами, с белками, обладающими специфичностью связывания с нуклеиновыми кислотами, или с любыми другими молекулами, специфически распознающими указанные нуклеиновые кислоты и связывающимися с ними. Такой способ может быть осуществлен in vitro, а также непосредственно in situ, например, в процессе детекции, проводимой посредством реакции окрашивания. Другим методом детекции маркерных молекул в образце на уровне нуклеиновых кислот осуществляемым в способе согласно изобретению является реакция амплификации нуклеиновых кислот, которая может быть осуществлена количественно, например, полимеразная цепная реакция. В одном из вариантов осуществления изобретения количественная оценка уровня маркерной РНК в образцах для диагностики клеточно-пролиферативных расстройств может быть проведена, например, с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.
В другом варианте осуществления изобретения детекцию уровня маркерных молекул осуществляют путем определения уровня экспрессии белка. Детекция маркерных молекул на уровне белка может быть осуществлена, например, в реакционной смеси, содержащей связывающий агент, специфичный для детекции маркерных молекул. Такими связывающими агентами могут быть, например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, бифункциональные гибридные антитела, пептидомиметики, содержащие минимальное количество антигенсвязывающих эпитопов. Указанные связывающие агенты могут быть использованы во многих различных методах детекции, таких как, например, Вестерн-блоттинг, ELISA, РИА, ИФА, проточная цитометрия, анализ методом боковых потоков, метод латекс-агглютинации, анализ на иммунохроматографических пластинах и иммунопреципитация. Обычно детекция с применением связывающих агентов может быть осуществлена in vitro, а также непосредственно in situ, например, в процессе реакции иммуноцитохимического окрашивания. В настоящем изобретении может быть использован любой способ, подходящий для определения количества конкретных полипептидов в растворах биологических образцов.
Методы детекции модифицированных молекул нуклеиновой кислоты и/или полипептидов известны специалистам.
Методы детекции метилирования нуклеиновых кислот известны специалистам и такими методами могут быть, например, методы с применением предварительной химической обработки, например, бисульфитом натрия, перманганатом или гидразином с последующей детекцией указанной модификации с помощью специфических рестрикционных эндонуклеаз или специфических зондов, например, в процессе реакции амплификации. Детекция метилирования может быть также осуществлена с использованием рестрикционных эндонуклеаз, ответственных за метилирование. Способы детекции метилирования нуклеиновых кислот описаны, например, в патентных заявках ЕР02010272.9, US 5856094, WO 0031294, US6331393 и т.п. Цитируемые документы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Детекция модификаций в полипептидах может быть, например, осуществлена с использованием связывающих агентов, специфически распознающих модифицированные или немодифицированные формы полипептидов. Альтернативно для удаления модификаций в молекулах могут быть использованы ферменты, такие как фосфатазы или гликолазы. Таким образом, присутствие или отсутствие модификаций может быть детектировано путем определения массы или заряда молекул путем электрофореза, хроматографии, масс-спектрометрии и т.п. до или после инкубирования с соответствующим ферментом.
В еще одном варианте осуществления изобретения детекция серии маркеров может быть осуществлена на полипептидном уровне и одновременно может быть осуществлена детекция серии маркерных молекул и/или всех или некоторых из этих маркерных молекул на уровне нуклеиновых кислот.
Маркерами, ассоциированными с медицински релевантными состояниями, могут быть, например, молекулы, которые влияют и/или отражают характер пролиферации и/или дифференцировки клеток и/или тканей. Такие молекулы могут включать, например, белки регуляции клеточного цикла; белки, ассоциированные с репликацией ДНК; трансмембранные белки, рецепторные белки; сигнальные трансдуцирующие белки; кальций-связывающие белки; белки, содержащие ДНК-связывающие домены; металлопротеиназы; киназы; ингибиторы киназ; шапероны; белки эмбриогенеза; белки теплового шока или ферменты, обеспечивающие посттрансляционную модификацию других белков и тем самым регулирующие их активность; или нуклеиновые кислоты, кодирующие названные белки. Маркерными молекулами, используемыми в настоящем изобретении, могут быть также мРНК, кодирующие указанные белки. В одном из вариантов осуществления изобретения маркер, ассоциированный с клеточно-пролиферативным расстройством, может, например, уникально экспрессироваться в пораженных клетках, но может и не экспрессироваться в указанных клетках или сверхэкспрессироваться в этих клетках.
Маркерные молекулы, используемые в настоящем изобретении, могут включать один или более маркеров, выбранных из р13.5, р14, р15, р16 (также обозначаемого р16INK4а), р19, р21, р27, р53, pRb, р14АRF, циклина А, циклина В, циклина Е, MDM-2, МСМ2, МСМ5, МСМ6, CDС2, CDС6, Id1, остеопонтина, GRP, почечной дипептидазы, her2/neu, TGFβII-рецептора, HPV-ассоциированных маркеров, например, происходящих от генов HPV, L1, L2, Е1, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7 и т.п. Отбор маркеров, которые могут быть использованы в одном из вариантов осуществления согласно изобретению для детекции медицински релевантных состояний, проиллюстрирован ниже в таблице 1.
В одном из вариантов осуществления изобретения маркером для медицински релевантного состояния может быть маркер, ассоциированный с опухолями (опухолевые маркеры). Маркерными молекулами, ассоциированными с опухолями, могут быть, например, белки, которые подвергаются экспрессии не-дикого типа, в отличие от нормальной контрольной ткани. Используемый здесь термин "экспрессия не-дикого типа" может означать повышенные или пониженные уровни экспрессии, отсутствие экспрессии или экспрессию соответствующих молекул в формах не-дикого типа. Экспрессия белка не-дикого типа может включать экспрессию мутированных форм белков, имеющих мутации, вызванные инсерцией, делецией, заменой или сдвигом рамки, или экспрессию белков или нуклеиновых кислот с другими известными типами мутаций. Во всех случаях экспрессии белков не-дикого типа или уровней белков не-дикого типа, белки, полипептиды или их фрагменты или нуклеиновые кислоты, кодирующие эти белки, полипептиды или их фрагменты, могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров, ассоциированных с опухолями, и таким образом могут подпадать под понятие "опухолевый маркер", используемое в контексте согласно изобретению. Белки, которые обнаруживают экспрессию не-дикого типа, ассоциированную с опухолями, описаны, например, в документах WO 9904265А2, WO 0149716А2, WO 0055633А2 и WO 0142792А2, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
В одном из вариантов осуществления изобретения маркер, являющийся признаком медицински релевантного состояния, может представлять собой белок регуляции клеточного цикла, такой как, например, циклин, циклин-зависимая киназа или ингибитор циклин-зависимой киназы. В другом варианте осуществления изобретения маркером, являющимся признаком медицински релевантного состояния, может быть маркер, ассоциированный с временной или персистентной вирусной инфекцией. Такой вирусной инфекцией может быть инфекция, вызванная папилломавирусом человека (HPV), таким как HPV высокого или низкого риска. HPV высокого риска может включать такие подтипы HPV, как, например, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 и 58. Маркерами для HPV-инфекции могут быть, например, продукты экспрессии генов HPV, таких как L1, L2, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7. В третьем варианте осуществления изобретения маркер, ассоциированный с вирусной инфекцией, может быть использован в комбинации с любым другим маркером для медицински релевантного состояния, например в комбинации с белком регуляции клеточного цикла. Комбинации маркерных молекул, которые могут представлять особый интерес с точки зрения их ассоциации с HPV, описаны, например, в документе WO 0208764, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В одном из вариантов осуществления изобретения белки регуляции клеточного цикла, используемые в комбинации с маркерами HPV, могут быть выбраны, например, из группы, включающей pRb, р53, р14АRF и ингибиторы циклин-зависимой киназы. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения, например, р16INK4а может быть использован в комбинации с маркерами для HPV-инфекции (например, L1, L2, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7).
При этом, следует отметить, что в данном случае маркеры, которые в некоторых вариантах изобретения используются в качестве маркеров медицински релевантных состояний, в некоторых других вариантах осуществления изобретения могут служить маркерами нормализации и наоборот. Однако в каждом отельном варианте осуществления изобретения маркер может служить либо маркером медицински релевантного состояния либо маркером нормализации. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, Ki67, используемый в качестве маркера клеточной пролиферации, может быть использован в качестве маркера нормализации (например, в комбинации с р16, р14АRF, клаудином-1 или другими маркерами медицински релевантного состояния); в других вариантах Ki67 может служить маркером медицински релевантного состояния (например, маркером дисплазии шейки матки или других диспластических заболеваний) в комбинации с соответствующими маркерами нормализации (например, цитокератинами, катенинами или т.п.). Различные другие маркеры также могут служить либо в качестве маркера медицински релевантных состояний либо в качестве маркера нормализации в зависимости от конкретного варианта применения.
В соответствии с настоящим изобретением маркерами нормализации могут быть, например, гены "домашнего хозяйства", такие как гены актина, gapth, гистоновых белков, фосфолипазы, β2-микроглобулина, белков, ассоциированных с активной пролиферацией клеток, таких как Ki67, PCNA или статин, либо белков, характерных для конкретных клеточных типов, таких как СК20 в эпителиальных клетках, или любых клеткоспецифических антигенов клеточной поверхности. Кроме того, в качестве маркеров нормализации могут также служить углеводные структуры, присутствующие на гликопротеинах, протеогликанах, лектиновых рецепторах, таких как рецептор конканавалина А, муцинах и ферментах, которые участвуют в биосинтезе этих молекул, например, таких как GalNac-трансферазы и олигосахарилтрансферазы. Тип маркерного белка выбирают в зависимости от информации, сообщаемой указанным маркером. В принципе, маркеры, используемые для выявления конкретных медицински релевантных состояний, могут в определенных случаях использоваться в качестве маркеров нормализации. Выбор маркеров, подходящих для осуществления способов согласно изобретению, проиллюстрирован в таблице 1.
Что касается маркеров медицински релевантных состояний, а также маркеров нормализации, то в качестве таких маркеров в способе согласно изобретению могут быть использованы молекулы в модифицированной форме (такие как полипептиды и нуклеиновые кислоты). Так, например, в способе согласно изобретению в качестве маркеров могут быть использованы фосфорилированные, гликозилированные или как-либо иначе модифицированные полипептиды или метилированные нуклеиновые кислоты.
Термин "нормализация", используемый в настоящем изобретении, означает любой способ, подходящий для определения соотношения между детектируемыми уровнями маркеров и параметрами, необходимыми для установления диагноза. В одном из аспектов согласно изобретению такой нормализацией может быть восстановление соответствующей цитологической и гистологической информации, содержащейся в исходном образце, с помощью подходящих молекулярных маркеров, детектируемых в растворах образца. Такая нормализация может включать, например, определение общего числа клеток, присутствующих в образце; присутствия или отсутствия клеток конкретного типа в образце; присутствия или отсутствия микроорганизмов или их клеток в образце; числа клеток конкретного типа или клеток микроорганизма, присутствующего в образце, пролиферативных свойств клеток, присутствующих в образце; или характера дифференцировки клеток, присутствующих в образце.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нормализация может также включать подтверждение адекватности проводимого теста, где в данном случае неадекватные результаты теста могут либо не приниматься во внимание либо могут быть классифицированы как недействительные. Поэтому термин "нормализация", используемый в контексте согласно изобретению, может означать качественные или полуколичественные методы нормализации. В некоторых вариантах осуществления изобретения полуколичественная нормализация может предусматривать определение порогового значения для маркера нормализации. В одном из вариантов осуществления изобретения полуколичественная нормализация может быть использована для следующих интерпретаций результатов: уровень, определенный для данного релевантного маркера, может рассматриваться как истинный результат теста только в том случае, если уровень такого маркера нормализации превышает определенное пороговое значение; в случае, если не достигается указанное пороговое значение, то результат теста для релевантного маркера считается неверным, и диагноз не может быть установлен на основании этого теста. В других вариантах осуществления изобретения, может быть установлено пороговое значение, которое не может быть превышено. В некоторых вариантах изобретения может быть осуществлена качественная нормализация по присутствию или отсутствию маркера нормализации. В этих случаях, например, величину, определенную для релевантного маркера, сравнивают с величиной, полученной в присутствии или в отсутствии маркера нормализации. Как уже было определено ранее, величина считается истинной только в том случае, когда был установлен параметр нормализации (присутствие или отсутствие детектируемого уровня маркера нормализации).
IgG1 (W, IHC, ICC, IF)
IgG1
(Elisa)
(34+39 кД)
1004-6
Олигосахарилтрансфераза
Versura et al., Basic Appl Histochem. 1988; 32(2):219-27
Гранулоциты
Макрофаги
FACS
(CD8)
Rogers et al., Eur J Cancer Clin Oncol. 1984 Oct; 20(10):1279-86
В соответствии с настоящим изобретением нормализация может предусматривать определение присутствия определенного числа рассматриваемых клеток (человека) в образце. Это является очень важным аспектом настоящего изобретения. Например, получения ложных (в частности, ложноотрицательных) результатов тестов можно избежать, если процедура теста подтверждает, что тест-образец содержит материалы (например, клетки, ткани, микроорганизмы и т.п.), необходимые для проведения конкретного теста. В различных тестах это будет означать гарантию того, что данный образец содержит клетки. При широком рассмотрении вариантов осуществления изобретения подтверждение адекватности данного образца предусматривает не только подтверждение присутствия клеток, но также и детекцию присутствия клеток различной природы или клеток определенного типа.
Таким образом, нормализация может включать детекцию клеток конкретного происхождения, таких как, например, клетки конкретного органа или конкретной гистологической локализации, например детекцию клеток различных областей эпителия, клеток соединительной ткани, клеток, происходящих от базальной мембраны ткани, или клеток гетерологичного происхождения, таких как клетки метастазов. В конкретных случаях это может оказаться необходимым, поскольку среди них могут присутствовать клетки, которые при определенных условиях экспрессируют маркер, который может быть использован для детекции медицински релевантного состояния, такого как, например, неоплазия или дисплазия, в некоторых нормальных условиях. Таким образом, термин "нормализация", используемый в настоящем изобретении, может означать детекцию присутствия или отсутствия и/или определение уровня клеток любых типов, которые могут вносить определенный вклад в общий уровень конкретных маркеров, выбранных для диагностики медицински релевантного состояния.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ может быть применен для детекции поражений шейки матки. Поражение шейки матки может означать дисплазию шейки матки любого типа, такую как рак шейки матки, как было определено выше, и предшествующие ему стадии. Маркеры и их комбинации, используемые в целях детекции, описаны, например, в документах WO 0208764 и ЕР1217377, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В этом варианте осуществления изобретения указанный тест может быть осуществлен с использованием любого подходящего образца, взятого из шейки матки (цервикального образца). Такими образцами могут быть, например, биоптаты или микробиоптаты, взятые из шейки матки, или мазки, взятые из области шейки матки. Используемыми здесь цервикальными мазками являются образцы, которые могут быть, например, получены с использованием подходящего устройства, такого как щетка, тампон, шпатель или т.п., которые контактируют с шейкой матки во время процедуры сбора образцов. Устройством для сбора образцов может быть любое подходящее устройство, которое может быть использовано в стандартных процедурах тестирования, проводимых врачом или автоматически самим устройством для взятия образцов.
Перспективными молекулярными маркерами, которые могут быть использованы для повышения эффективности анализов цервикальных образцов, являются, например, р16INK4а, р14АRF, циклин Е, циклин А, циклин В, MN, her2/neu, mdm-2, bcl-2, EGF-рецептор, mcm-2, mcm-5, клаудин-1, маркеры-индикаторы инфекции, вызываемой папилломавирусом человека, pRb, р53 и т.п., которые могут быть использованы для детекции диспластических и неопластических клеток. В соответствии с настоящим изобретением нормализация, применяемая для анализа цервикальных мазков, может предусматривать детекцию присутствия всех человеческих клеток, детекцию клеток эпителия шейки матки, детекцию присутствия эндоцервикальных, а также эктоцервикальных клеток и детекцию клеток эндометриального происхождения. Эндоцервикальным эпителием является железистый цилиндрический эпителий. Клетки, происходящие от эндоцервикса, могут быть идентифицированы маркерами, которые селективно экспрессируются цилиндрическими эпителиальными клетками или клетками железистого эпителия. Эктоцервикальным эпителием является сквамозный эпителий. Идентификация эктоцервикальных клеток может быть достигнута путем детекции маркеров, ассоциированных со сквамозными эпителиальными клетками. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться достаточной детекция эпителиальных клеток (содержащих сквамозный, а также цилиндрический эпителий). В других вариантах осуществления изобретения очень важным параметром может оказаться дифференцировка эндоцервикальных клеток. Эта важная стадия служит подтверждением присутствия экто- и эндоцервикальных клеток в данном образце, то есть подтверждением того, что этот образец был взят из трансформированной зоны шейки матки, где наблюдается наибольшая дисплазия и неоплазия. Если такие клетки отсутствуют, то данный образец является неподходящим для процедуры тестирования, то есть, он может давать ложноотрицательные результаты. Поскольку р16INK4а может экспрессироваться в нормальных эндометриальных клетках, то может оказаться необходимой нормализация уровней экспрессии р16INK4а по числу эндометриальных клеток.
Поэтому для надежного диагноза нормализация может включать детекцию присутствия или отсутствия названных клеточных компонентов в образце, и, кроме того, детекцию общего уровня клеток конкретного типа или их фракции, которые вносят определенный вклад в общее число клеток, присутствующих в образце.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения детектируемый уровень белка р16INK4а может быть нормализован по цитологическим условиям, имеющимся в данном конкретном образце, так, чтобы можно было установить, является ли детектированный уровень белка р16INK4а показателем сверхэкспрессии р16INK4а в цервикальных клетках, или в данном образце присутствует избыточное число эндометриальных клеток, что может симулировать сверхэкспрессию р16INK4а. В этой связи нормализация может включать определение количества эндометриальных клеток в цервикальном образце исходя из уровней молекулярного маркера. Путем сравнения уровня, например, р16INK4а, используемого в качестве маркера медицински релевантного состояния, определяемого в цервикальном образце, с количеством эндометриальных клеток, оцениваемых с помощью молекулярных маркеров, можно установить, принадлежит ли все количество р16 только эндометриальным клеткам, присутствующим в данном растворе образца. Таким образом, при диагностике цервикальной дисплазии могут быть исключены ложноположительные результаты, получаемые из-за того, что повышенные уровни р16INK4а, обусловленные присутствием высоких уровней эндометриальных клеток, ошибочно приписываются сверхэкспрессии р16INK4а в цервикальных клетках. Термин "количество", используемый в контексте настоящего изобретения, может означать количественную или полуколичественную оценку. Этот термин может, например, означать оценку общего числа клеток или оценку клеточной фракции по отношению к общему числу клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин "определение количества" может означать оценку фракции от общего уровня маркеров, который обеспечивается клетками конкретного типа.
В целях получения маркера нормализации для анализа цервикальных образцов может быть использовано несколько маркеров нормализации и эти маркеры могут быть выбраны, например, из цитокератинов, Е-кадгеринов, инволюкрина, урокиназоподобного активатора плазминогена, SCCA (антигена плоскоклеточной карциномы), катенинов (например, альфа-катенина, бета-катенина, гамма-катенина (плакоглобина)), Ер-Cam.
Некоторые кандидаты для маркеров нормализации были рассмотрены с точки зрения их способности к характеризации цервикальных образцов. Результаты представлены в таблице 2 и в таблице 3.
Маркеры нормализации могут быть, например, использованы как индикаторы присутствия клеток со специфическим характером дифференцировки, например терминальной дифференцировки или дифференцировки, специфичной для эпителиальных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения маркеры нормализации могут служить в качестве маркерных молекул, характерных для сквамозных эпителиальных клеток, например, в качестве индикаторов присутствия эктоцервикальных клеток в цервикальном образце. Подходящими маркерами могут служить, например, СК13, Е-кадгерин, гамма-катенин или инволюкрин. В другом варианте осуществления изобретения такие маркеры могут служит индикаторами присутствия цилиндрических эпителиальных клеток, указывающих на присутствие эндоцервикальных клеток в данном образце. Подходящими маркерами являются: Ер-Cam, СК18, СК8.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нормализация может предусматривать детекцию в основном эпителиальных клеток, и для этих целей может быть использован любой маркер, подходящий для детекции эпителиальных клеток. Такими маркерами могут быть, например, маркеры, описанные в таблицах 2 и 3.
В еще одном варианте осуществления изобретения описанный здесь способ может быть использован для детекции расстройств дыхательных путей. Одним из маркеров, используемых для диагностики мелкоклеточного рака легких, является нейрон-специфическая енолаза (NSE). Опухолевые образцы получают путем бронхоскопии со сбором клеток с использованием щеток или бронхоальвеолярных лаважей. Поскольку NSE также экспрессируется в некоторых нормальных клетках легких, то уровень экспрессии NSE, детектированный в растворенном образце, должен быть определен по отношению к уровню маркера нормализации (например, актина) для детекции количества клеток, присутствующих в образце.
В своем третьем варианте настоящее изобретение относится к детекции поражений желудочно-кишечного тракта, например к детекции поражений толстой и прямой кишки путем анализа кала. В этом случае происхождение индикаторных нуклеиновых кислот и/или полипептидов, детектируемых в пробах фекалий, может иметь решающее значение для установления диагноза. В соответствии с настоящим изобретением может быть определено происхождение (типов клеток/микроорганизмов) используемых маркерных молекул. Таким образом, ложноположительный результат, основанный, например, на детекции маркерных молекул, происходящих от пищи, перевариваемой индивидуумом, а не от поражений слизистой желудочно-кишечного тракта, может быть исключен. Кроме того, с использованием методики, описанной в настоящей заявке, могут быть исключены артефакты, возникающие из-за присутствия следовых количеств маркеров, поступающих из кровотока или происходящих от проглоченной мокроты, и т.п.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к тест-набору для осуществления способа согласно изобретению. Этот набор может быть, например, диагностическим набором, аналитическим набором или набором для научных исследований.
Термин "набор", используемый в настоящем изобретении, может включать наборы, а также диагностические устройства. Такими наборами могут быть, например, наборы, предназначенные для проведения анализов: ELISA (например, "сэндвич"-анализов, конкурентных или не-конкурентных анализов, и т.п.), ИФА (конкурентных или не-конкурентных) или РИА; тест-системы с использованием сфер, систем сквозных или боковых потоков, аналитических тест-пластин, или любых других известных лабораторных, настольных или точных контрольно-измерительных приборов для испытаний. В некоторых вариантах набор согласно изобретению может включать in vitro диагностические устройства для осуществления диагностических тестов. Такими in vitro-диагностическими устройствами могут быть устройства для ELISA любого типа, известные специалистам. Такими устройствами могут быть устройства для анализа в формате "сэндвич"-ELISA, в формате конкурентного ELISA и в любых других форматах анализов ELISA. В другом варианте осуществления изобретения, in vitro-диагностическими устройствами могут быть устройства для анализов методами боковых потоков или сквозных потоков (проточной цитометрии), проводимых, например, с использованием, по меньшей мере, одного реагента, связывающегося с маркером-индикатором медицински релевантного состояния, и одного реагента, связывающегося с маркером нормализации, оба из которых фиксированы на твердой фазе. В таких устройствах могут быть использованы различные механизмы визуализации результатов тестов. В некоторых вариантах осуществления изобретения в указанных тестах могут быть использованы "вторые" детектирующие реагенты, направленные против маркерных молекул, связанных с детектируемыми молекулами. Такими детектируемыми молекулами могут быть коллоидное золото (окрашенные), латексные частицы и другие молекулы.
В еще одном варианте осуществления изобретения устройством для in vitro-диагностического теста может быть устройство для проточного анализа, основанного на использовании капиллярных или пористых мембран (таких как мембраны, сферы или другие трехмерные структуры пористых веществ). В зависимости от варианта осуществления настоящего изобретения размер пор или капилляров должен быть скорректирован в целях обеспечения оптимальных условий проточного анализа.
Набор согласно изобретению может включать:
а) реагенты для детекции маркерных молекул,
b) реагенты и буферы, которые обычно используются для осуществления реакции детекции, такие как буферы, детектируемые маркеры, носители и др.;
с) один или несколько маркеров и/или образцов, репрезентативных для диагностируемых медицински релевантных условий и используемых для осуществления реакций позитивного и/или негативного контроля, и
d) один или несколько образцов с маркерами нормализации для осуществления реакций позитивного и/или негативного контроля,
Такой тест-набор может, но необязательно, включать буфер для лизиса в целях солюбилизации исходного образца. В основном буфером для лизиса может быть любой подходящий растворитель, известный специалистам. Буферами для лизиса, используемыми в указанном наборе, могут быть, например, водные растворы хаотропных агентов, таких как мочевина, GuaSCN, формамид, водные растворы детергентов, таких как анионогенные детергенты (например, ДСН, N-лаурилсаркозин, дезоксихолат натрия, алкиларилсульфонаты, сульфаты длинноцепочечных (жирных) спиртов, сульфаты и сульфонаты олефинов, сульфаты и сульфонаты альфа-олефинов, сульфированные моноглицериды, сульфированные эфиры, сульфосукцинаты, алкансульфонаты, сложные эфиры фосфорной кислоты, алкилизетионаты, сложные эфиры сахарозы), катионогенные детергенты (например, хлорид цетилтриметиламмония), неионогенные детергенты (например, Твин-20, Nonidet P-40, Тритон Х-100, NP-40, Igepal CA-630, N-октилглюкозид) или амфотерные детергенты (например, CHAPS, 3-додецилдиметиламмонийпропан-1-сульфонат, оксид лаурилдиметиламина) и/или водные растворы гидроксидов щелочных металлов, таких как, например, NaOH или КОН.
Примеры буферов для лизиса представлены в таблице 4.
Буфер для лизиса, кроме того, может содержать один или несколько агентов, предотвращающих деградацию компонентов в исходных образцах. Такие компоненты могут, например, содержать ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеиназы, ингибиторы РНКазы, ингибиторы ДНКазы и т.п. Такими ингибиторами могут быть, например, ингибиторы протеиназы, выбранные из композиций, указанных в таблице 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения буферы для лизиса благодаря присутствию ингибитора деградации могут обеспечивать детекцию р16 в данном образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор циклин-зависимой киназы р16 разлагается в солюбилизированных образцах, а поэтому он не может быть детектирован. Это особенно справедливо в том случае, когда образцы непосредственно переносят в лизирующую среду и хранят там в течение определенного периода времени.
AEBSF
Буфер для лизиса, используемый в целях стабилизации, может также содержать объемный белок (например, альбумин, такой как альбумин бычьей сыворотки или альбумин телячьей сыворотки или другие объемные белки) для предотвращения разложения белками образца. Объемные белки могут, например, присутствовать в комбинации с ингибиторами протеиназы либо они могут быть добавлены вместо ингибиторов протеиназы. В одном из вариантов осуществления изобретения растворитель может быть выбран так, чтобы он был совместим с условиями проведения данного теста (ИФА, ELISA или анализа на пластинах) и чтобы солюбилизированные образцы можно было непосредственно использовать в данном тесте. Термин "тест", используемый в контексте настоящего изобретения, означает любую процедуру, проводимую для детекции присутствия или отсутствия маркерных молекул и/или определения их уровней.
Реагент, используемый для детекции маркерных молекул, может включать любой агент, способный связываться с маркерной молекулой. Такими реагентами могут быть белки, (поли)пептиды, нуклеиновые кислоты, связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA), гликопротеины, протеогликаны, полисахариды или липиды.
Образцы, включающие маркеры, ассоциированные с медицински релевантными состояниями, и/или маркеры нормализации, используемые для позитивного и/или негативного контроля, могут содержать, например, нуклеиновые кислоты в подходящей форме, такой как раствор или соль, пептиды в подходящей форме, образцы срезов тканей, микроорганизмы и позитивные или негативные клеточные линии.
В одном из вариантов осуществления изобретения детекцию маркерных молекул осуществляют на уровне полипептидов. В этом варианте связывающим агентом может быть, например, антитело, специфичное к указанным маркерным молекулам, или его фрагменты. Кроме того, связывающими агентами могут быть антигенсвязывающие фрагменты, такие как Fab-фрагменты, одноцепочечные антитела, бифункциональные гибридные антитела, пептидомиметики, содержащие минимальные антигенсвязывающие эпитопы и т.п. Кроме того, связывающим агентом может быть лектин, связывающийся со специфической углеводной структурой на маркерной молекуле.
В другом варианте тест-набора детекцию маркерных молекул осуществляют на уровне нуклеиновых кислот. В этом варианте осуществления изобретения таким реагентом для детекции может быть, например, нуклеиновокислотный зонд или обратный праймер, комплементарный указанной маркерной нуклеиновой кислоте.
Нижеследующие примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1: Специфическая иммуногистохимическая детекция эндоцервикальных и эктоцервикальных эпителиальных клеток в цервикальных срезах
Для оценки маркеров, указывающих на адекватность цервикальных мазков, цервикальные срезы (фиксированные в 4% растворе формальдегида и залитые парафином) окрашивали антителом против цитокератина 18 (маркера для эндоцервикального цилиндрического эпителия) и антителом против цитокератина 10/13 (маркера для эктоцервикального сквамозного эпителия). На фиг. 1 показано специфическое окрашивание эндоцервикального эпителия антителом против цитокератина 18 и специфическое окрашивание эктоцервикального эпителия антителом против цитокератина 10/13. Этот эксперимент проводили следующим образом:
Фиксированные формалином и залитые в парафин срезы подвергали депарафинизации в ксилоловой бане в течение 5 минут (стадию повторяли еще один раз), избыток жидкости удаляли и предметные стекла помещали в 95-96% этанол на 3 (±1) минуты, затем в 70% этанол на 3 (±1) минуты (стадию повторяли еще один раз), и наконец в дистиллированную воду минимум на 30 сек. Для восстановления эпитопа предметные стекла помещали в сосуд Коплина и кипятили 40 минут при 95-99°С в 10 мМ цитратном буфере, рН 6,0. Затем предметные стекла оставляли в этом буфере на 20 минут (± 1 мин) для охлаждения до комнатной температуры. После этого предметные стекла покрывали реагентом, блокирующим пероксидазу (3% H2O2; 15 мМ NaN3), и инкубировали в течение 5 (±1) минут при комнатной температуре. После 5-минутной промывки в промывочном буфере предметные стекла инкубировали с "первыми" антителами (СК 10/13: DE-К13, 1:50, DAKO; СК 18: К18.7, 1 мкг/мл, Dianova) в течение 30 минут. Затем предметные стекла ополаскивали промывочным буфером и промывали в промывочном буфере в течение 5 минут при комнатной температуре. После 30-минутного инкубирования с препаратом EnVision (с готовым для использования комплексом "антимышиное антитело - пероксидаза хрена"; DAKO), предметные стекла 3 раза промывали в течение 5 минут и инкубировали в субстрате DAB в течение 10 минут, затем подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином и переносили в поддерживающую среду (Faramount).
С использованием антитела против цитокератина 18 (СК 18) в процедуре иммуногистохимического окрашивания положительная реакция наблюдалась в цилиндрическом эпителии эндоцервикса (фиг. 1А), тогда как сквамозный эпителий эктоцервикса не обнаруживал специфического окрашивания (фиг. 1В). При иммуногистохимическом окрашивании антителом, направленным против цитокератина 10/13 (СК 10/13), не обнаруживалось окрашивания цилиндрического эпителия эндоцервикса (фиг. 1С), но наблюдалось интенсивное окрашивание сквамозного эпителия эктоцервикса (фиг. 1D). Поэтому СК18 может быть использовано в качестве специфического маркера для детекции цилиндрических эпителиальных клеток эндоцервикса, а СК10/13 может быть использовано в качестве специфического маркера для детекции сквамозных эпителиальных клеток эктоцервикса.
Пример 2: Вестерн-блот-анализ солюбилизированных образцов, полученных из цервикальных мазков
Для того чтобы определить, можно ли с помощью Вестерн-блот-анализа солюбилизированных образцов диагностировать поражения шейки матки, клинические образцы, взятые у пациента с установленным диагнозом, подвергали иммунохимическому анализу, основанному на детекции маркерных молекул после лизиса исходного материала.
Образцы клинического материала (цервикальные мазки) анализировали с помощью стандартного Вестерн-анализа следующим образом.
Вкратце, на первой стадии клинический материал солюбилизировали путем кипячения (5 мин, 95°С) в буфере Лэммли для образцов белка (100 мМ трис, рН 6,8, 2% ДСН, 200 мМ ДТТ, 0,05% ВрВ), а затем обрабатывали ультразвуком. Во второй стадии образцы белка разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (12% акриламид), а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану путем блоттинга в резервуаре (Towbin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci.: 76:4350-4354). В другой стадии мембраны блокировали для предотвращения неспецифического связывания с антителом (в 10% обезжиренном сухом молоке в PBS), а затем инкубировали со специфическим моноклональным мышиным антителом (СК 8:35βН11, 1:100, DAKO; р16INK4а: D7D7, 1:140, МТМ Laboratories). Связывание специфического антитела визуализировали с использованием "вторых" реагентов, конъюгированных с пероксидазой хрена (связывающимися с маркер-специфическим антителом), и катализирующих фотон-испускающих субстратов.
Цитокератин 8 (СК 8) был использован в качестве маркера, специфичного к эндоцервикальным клеткам, присутствие которых указывало на адекватность сбора образцов в экспериментах согласно изобретению. Ингибитор циклин-зависимой киназы р16INK4а использовали в качестве маркера, специфичного для конкретного заболевания.
Результаты эксперимента настоящего изобретения приводятся на фиг. 2. Цифры 1-4 относятся к образцам (цервикальным мазкам), взятым от отдельных пациентов. Иммуно-блот-детекцию осуществляли с использованием специфических антител против цитокератина 8 (СК8) и специфических антител против р16INK4а (р16). Образцы, взятые у пациенток 1, 2 и 3, не обнаруживали какого-либо сигнала на р16INK4а. Это означает, что в этих образцах отсутствуют диспластические цервикальные клетки. Образец, взятый у пациентки 4, давал интенсивный сигнал для р16INK4а. Это означает, что в данном образце присутствуют диспластические цервикальные клетки. Верхние полосы обнаруживали специфические сигналы на цитокератин 8. В образцах 1, 3 и 4 мог быть детектирован цитокератин 8, тогда как в образце 2 какого-либо сигнала обнаружено не было. Это указывает на то, что эндоцервикальные цилиндрические клетки присутствуют в образцах 1, 3 и 4, но отсутствуют в образце 2. Поскольку присутствие эндоцервикальных цилиндрических эпителиальных клеток является одним из показателей адекватности цервикальных мазков, то образец 2 рассматривался как неадекватный, а если результат детекции на р16INK4а был отрицательным то, в данном случае диагноз не может быть установлен. Образцы 1, 3 и 4 рассматривались как адекватные. Поэтому на основании отрицательного сигнала образцов 1 и 3 на р16INK4а можно сделать заключение, что у этих пациенток отсутствовала дисплазия шейки матки. Образец 4 давал положительный сигнал на р16INK4а, что указывало на наличие у данной пациентки диспластического поражения шейки матки.
Параллельный цитологический анализ мазков указывал на нормальный клеточный состав у женщин 1 и 3. У женщины 2 диагноз не был поставлен из-за недостатка клеточного материала. У женщины 4 была диагностирована высокозлокачественная дисплазия. Следует отметить, что верхняя полоса (СК 8) соответствует маркеру нормализации, специфичному к эндоцервикальным клеткам, а именно цитокератину 8, что указывает на адекватность сбора образцов. Нижняя полоса относится к маркеру р16INK4а, ассоциированному с конкретным заболеванием. Этот блот для пациентки 4 давал положительный сигнал на р16INK4а, что указывало на наличие у нее высокозлокачественной дисплазии шейки матки. Образцы, взятые у пациенток 1 и 3, обнаруживали лишь СК8-специфическую полосу, которая указывала на "правильный" сбор образцов, но не указывала на присутствие маркера, ассоциированного с данным заболеванием (р16INK4а), и соответствовала нормальному, здоровому эпителию шейки матки. Образец для пациентки 2 не обнаруживал СК8-сигнала, что соответствовало низкому числу клеток в этом образце, а поэтому, если результат детекции на р16INK4а был отрицательным, то в данном случае диагноз не мог быть установлен.
Пример 3: Вестерн-блот-анализ и анализ ELISA, проводимые для демонстрации адекватности образцов
Для того чтобы определить могут ли отличия результатов диагноза, установленного исходя из анализа раствора, от результатов диагноза, установленного исходя из анализа образцов, объясняться неадекватностью образца, проводили Вестерн-блот-анализ цервикальных мазков, взятых от четырех различных пациенток с установленным диагнозом (диагнозом высокозлокачественная внутриэпителиальная неоплазия шейки матки, поставленным в соответствии с цитологической диагностикой Рар IVa и Рар IVb). Для выявления присутствия диспластических клеток использовали антитело против р16INK4а, а для демонстрации адекватности образца использовали антитела против СК18 и СК 10/13.
Вестерн-блот-анализ осуществляли следующим образом: образцы, взятые у пациенток, собирали цервикальной щеткой и непосредственно лизировали в буфере Лэммли для образцов (2% ДСН, 60 мМ трис, рН 6,8, 0,01%, 100 мМ ДТТ) в течение 5 минут при 95°С (1 х 107 клеток/мл), а затем обрабатывали ультразвуком (5 импульсов по 5 секунд, максимальная интенсивность). Лизаты центрифугировали в течение 12 минут при 16600 х g в микроцентрифуге, и супернатант переносили в новую пробирку. В предварительно полученные гели в линейном градиенте 4-20% акриламида (Criterion System, Bio-Rad) загружали 10 мкл (105 клеток) экстрактов целых клеток, и белки разделяли под действием постоянного электрического тока в 25 мА в течение 45 минут. Белки переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану HybondECL (Amersham) методом стандартного блоттинга в резервуаре с использованием устройства для блоттинга Bio Rad Criterion Blotter (15 минут при постоянном напряжении 100 Вольт, а затем 45 минут при постоянном напряжении 50 Вольт). Нитроцеллюлозные мембраны окрашивали в течение 5 минут в растворе Ponceau S для подтверждения переноса белка. Раствор Ponceau S удаляли путем проведения двух 10-минутных промывок в PBS. Для иммунодетекции блоты блокировали в течение ночи в блокирующем буфере (10% сухое молоко в PBS с 0,1% твина-20). "Первые" антитела инкубировали при разведениях, рекомендованных производителем, в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре с перемешиванием (СК18:МАВ 3236), 1:1000, CHEMICON; СК 10/13: DE-K13, 1:500, DAKO, р16INK4а: D7D7, 1:140, МТМ Laboratories). После шести 10-минутных промывок PBS/0,1% твина 20 блоты инкубировали с кроличьим антимышиным антителом, конъюгированным с ПХ (DAKO, разведенным 1:5000 в блокирующем буфере), в течение 1 часа при комнатной температуре. После шести 10-минутных промывок PBS/0,1% твина 20 мембраны инкубировали в течение 5 минут в растворе субстрата (Super Signal West Femto Maximum Substrate, Pierce), заворачивали в пластиковую оболочку и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 1-5 минут. И наконец, рентгеновские пленки проявляли, фиксировали, сушили и считывали с помощью системы визуализации (Bio-Rad). Те же самые образцы использовали для проведения ELISA-анализа на р16INK4а, СК 10/13, СК18. Детектируемые сигналы и результаты были аналогичны результатам Вестерн-блот-анализа, на основании чего были сделаны заключительные выводы.
ELISA-анализ проводили следующим образом. Плоскодонные 96-луночные планшеты (MaxiSorb; Nunc) сенсибилизировали иммобилизованным антителом (р16INK4а: МТМ-Е6Н4, 2 мкг/мл в PBS, MTM Laboratories; CK10: MS481P1ABX, 2 мкг/мл, dianova; СК18: К18.7,2 мкг/мл, Dianova; 50 мкл/лунку) в течение ночи при 4°С. Планшеты 6 раз промывали PBS/0,1% Твина-20 и блокировали буфером Superblock (Pierce). Экстракт солюбилизированного белка, выделенный из цервикальных мазков, растворяли в буфере для инкубирования (PBS, 3% Superblock, 0,1% Твина-20) и добавляли в каждую лунку с тремя повторениями. После инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре планшеты 6 раз промывали PBS/0,1% Твина-20 и инкубировали с биотинилированным антителом для детекции (р16INK4а: МТМ-D7D7 (0,2 мкг/мл, MTM Laboratories, CK10:MS481-BO, 200 мкг/мл, Dianova; CK18: MS142-BO, 200 мкг/мл, Dianova; в буфере для инкубирования) в течение 1 часа при комнатной температуре. После проведения шести промывок PBS/0,1% Твина-20 ТМВ в течение 30 минут добавляли 50 мкл щелочной фосфатазы, связанной со стрептавидином (разведение 1:1000, Dianova). Затем планшеты 6 раз промывали PBS/0,1% Твином-20 и в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата п-нитрофенилфосфата (PnPP; растворенный в диэтаноламиновом буфере). OD 405 нм (сравниваемая длина волны 620 нм) измеряли на ELISA-ридере (Tecan) через 30 минут, 1 час и 2 часа. Этот пример показал, что анализ в формате "сэндвич"-ELISA обнаруживал чувствительность, подходящую для использования в способах согласно изобретению. Используемый в способе согласно изобретению анализ "сэндвич"-ELISA, описанный в этом примере, может быть применен к множеству маркерных молекул, таких как маркеры нормализации/адекватности и маркеры, являющиеся признаками медицински релевантных состояний.
Образцы, взятые от четырех пациенток с установленным диагнозом высокозлокачественная дисплазия шейки матки (см. "Диагностика"), анализировали с использованием Вестерн-блот-анализа (верхняя панель на фигуре). Для левого блота иммуноблот-детекцию осуществляли с использованием антител, специфичных к β-актину и р16INK4а, для среднего блота - с использованием антител, специфичных к цитокератину 10/13, а для правого блота - с использованием антител, специфичных к цитокератину 18. В качестве маркеров использовали β-актин, СК18 и СК 10/13, которые продемонстрировали адекватность образца. β-актин указывал на присутствие любых клеток, СК10/13 указывал на присутствие эктоцервикальных сквамозных клеток, а СК 18 указывал на присутствие эндоцервикальных цилиндрических клеток.
Как показано на фиг. 3, для образцов, взятых у пациенток 1 и 2, иммуноблоты обнаруживали положительные сигналы для всех используемых маркеров адекватности (СК10/13, СК18, β-актин) и для маркера (р16INK4а), являющегося индикатором присутствия диспластических клеток. Образцы 3 и 4 в Вестерн-блот-анализе были негативными в отношении р16INK4а-полос. Однако в этих Вестерн-блот-анализах β-актин и два цитокератиновых маркера давали крайне слабый сигнал (пациентка 3, β-актин) или вообще не давали сигнала (пациентка 4, все маркеры; пациентка 3, маркеры СК). Поэтому на основании отсутствия сигнала на р16INK4а диагноз не может быть установлен.
На нижней панели этой фигуры представлены результаты ELISA-анализов. Положительные сигналы на маркеры адекватности (СК10/13, СК18) были детектированы для образца, взятого у пациенток 1 и 2, тогда как для образцов, взятых у пациенток 3 и 4, сигналы на СК10/13 и СК 18 не наблюдались. Таким образом, результаты ELISA-анализа совпадали с результатами Вестерн-блот-анализа, на основании чего были сделаны аналогичные заключения.
Пример 4: Вестерн-блот-анализ различных образцов, взятых из легких
Для того чтобы определить, можно ли с помощью Вестерн-блот-анализа солюбилизированных образцов диагностировать поражения легких, клинические образцы, взятые у пациента с установленным диагнозом, солюбилизировали и подвергали иммунохимическому анализу на основе маркерных молекул и молекул нормализации.
Клинические образцы (клетки, собранные щеткой или с помощью бронхоальвеолярного лаважа) анализировали с помощью стандартного Вестерн-анализа следующим образом. Клетки, собранные с помощью бронхоальвеолярного лаважа, осаждали центрифугированием (5 минут, 1000 об/мин), и осадок растворяли в буфере Лэммли для образцов белка (100 мМ трис, рН 6,8, 2% ДСН, 200 мМ ДТТ, 0,05% ВрВ). Клетки, собранные с помощью щетки, непосредственно растворяли в буфере Лэммли для образцов белка (100 мМ трис, рН 6,8, 2% ДСН, 200 мМ ДТТ, 0,05% ВрВ). Этот материал кипятили (5 мин, 95°С) а затем обрабатывали ультразвуком. Во второй стадии аликвоты образцов белка в дубликатах разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (12% акриламид), а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом блоттинга в резервуаре (Towbin et al., 1979, Proc.Natl. Acad. Sci.: 76:4350-4354). В другой стадии мембраны блокировали для предотвращения неспецифического связывания с антителом (в 10% обезжиренном сухом молоке в PBS), а затем одну мембрану инкубировали со специфическими моноклональными мышиными антителами против NSE (DAKO Germany, клон BSS/NC/VI-Н14, мышиное моноклональное антитело, разведенное 1:1000), а другую мембрану инкубировали с маркером нормализации, актином (ICN, USA, клон С4, мышиное моноклональное антитело, разведенное 1:400). Связывание специфического антитела визуализировали с использованием "вторых" реагентов, конъюгированных с пероксидазой хрена (связывающимися с маркер-специфическим антителом), и катализирующих, фотон-испускающих субстратов.
В бронхоальвеолярных лаважах пациентов с установленным диагнозом мелкоклеточный рак легких были обнаружены высокие уровни NSE по сравнению с уровнями экспрессии актина, тогда как у пациентов, не имеющих опухоли, NSE любого типа почти не обнаруживались, однако, уровни актина у этих пациентов были сравнимы с уровнем актина у пациентов с раком. (Данные не приводятся).
Эти результаты показали, что нормализация тест-процедуры, проводимой в растворе в соответствии с описанным здесь способом, позволяет установить диагноз заболеваний без использования данных морфологических исследований.
Пример 5: Детекция цервикальной внутриэпителиальной неоплазии в ELISA-тесте
34 цервикальных мазка, помещенных в буфер для лизиса, подвергали ELISA-детекции на сверхэкспрессию ингибитора циклин-зависимой киназы р16INK4а в растворах, полученных из клеток, содержащихся в указанных мазках. ELISA-тест проводили как описано ниже.
(А) Лизис клеток
Щетки с цервикальными мазками помещали в 15 мл-сосуды, содержащие 2 мл буфера для лизиса mtm. Цервикальные клетки, присутствующие на щетке, подвергали лизису, по меньшей мере, в течение 20 ч. Затем лизаты образцов цервикальных мазков переносили в 2 мл-пробирки и центрифугировали при 4°С (15 минут при 28000 х g (16600 об/мин, в высокоскоростной центрифуге JEC Multi RF)). Супернатант переносили в чистую пробирку. В данном случае супернатант может быть помещен на хранение при -20°С.
(В) Осуществление ELISA
Сенсибилизация ELISA-планшетов
Маточные растворы клона р16INK4а-специфического антитела mtm Е6Н4, клона Ер-Cam-специфического антитела Ber-Ep4 и клона антитела 15 против гамма-катенина разводили в PBS с получением готового раствора для сенсибилизации.
50 мкл каждого готового раствора, используемого для сенсибилизации иммобилизованным антителом, добавляли в ELISA-планшеты.
Для сенсибилизации планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С.
Растворы для сенсибилизации удаляли из ELISA-планшетов, и эти планшеты ополаскивали в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием 7 х 250 мкл промывочного буфера (0,1% твина 20 (об/об) в PBS).
После удаления остатков промывочного буфера в каждую лунку добавляли 300 мкл блокирующего буфера (2% BSA в PBS). Планшеты инкубировали в течение 1 часа на качалке при температуре окружающей среды.
Инкубирование с образцами
После удаления блокирующего буфера в каждую лунку добавляли 100 мкл образца клеток, подвергнутых лизису. Лизаты клеток HeLa использовали в качестве позитивного контроля для антител, специфически распознающих р16INK4а и гамма-катенин; лизаты клеток НТ29 использовали в качестве позитивного контроля для антител, специфически распознающих Ер-Cam.
Для калибровки теста в данном тесте были использованы различные концентрации рекомбинантного белка р16, рекомбинантного гамма-катенина и Ер-Cam (0 пг/мл, 50 пг/мл, 100 пг/мл, 200 пг/мл, 400 пг/мл, 800 пг/мл).
Образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
Затем проводили промывку в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием 7 х 250 мкл промывочного буфера. Остаточный буфер удаляли.
Инкубирование с антителом для детекции
Рабочие растворы биотинилированных "вторых" антител (клон антитела mtm D7D7, специфичного к р16INK4а, клона антитела А5В4, специфичного к Ер-Cam, и клона МАВ 2083, специфичного к гамма-катенину) получали путем разведения маточных растворов.
100 мкл рабочих растворов биотинилированных "вторых" антител добавляли в лунки, инкубируемые с соответствующим антигеном и иммобилизованным антителом. После инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре растворы антител удаляли и ELISA-планшеты промывали в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием 7 х 250 мкл промывочного буфера.
Детекция
Полимеры "стрептавидин-ПХ" (1 мг/мл) предварительно разводили 1:10 (4 мкл + 36 мкл буфера для инкубирования). Конечный раствор для инкубирования получали путем разведения 1:300 в буфере для инкубирования (0,1% BSA в PBS) до конечной концентрации 0,33 мкг/мл.
В каждую лунку добавляли 100 мкл полученного раствора и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
Затем буфер удаляли и планшеты 5 раз вручную промывали 200 мкл промывочного буфера на лунку.
Инкубирование субстрата
ТМВ-субстрат уравновешивали до 25°С в течение 1 часа в темноте.
В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата.
ELISA-планшеты инкубировали при 25°С в темноте в течение ровно 15 минут. Затем реакцию прекращали добавлением 80 мкл 2,5 М Н2SO4.
Через 5 минут после прекращения реакции определяли OD 450 нм. После оценки результатов снова определяли значение OD для каждого образца.
Оценка результатов
Для установления адекватности образцов OD-величины всех образцов для гамма-катенина должны превышать определенное пороговое значение, что будет подтверждать "правильный" сбор образцов, содержащих минимальное количество клеток. Кроме того, для подтверждения "правильного" сбора образцов пороговое значение для OD-величины Ер-Cam, указывающей на присутствие эндоцервикальных клеток, должно быть выше.
Для детекции диспластических клеток OD-величины для р16INK4а должны превышать определенное пороговое значение, что будет подтверждать присутствие минимального количества р16-положительных диспластических клеток.
Результаты этого эксперимента приводятся в таблице 6.
Сравнение OD-величин для р16INK4а и гамма-катенина, полученных для 34 образцов, с соответствующими пороговыми уровнями выявило, что 33 образца были адекватными и могли быть дополнительно исследованы. Из этих 33 образцов 30 образцов были отрицательными по р16INK4а, а 3 образца были положительными.
Результаты ELISA-анализа сравнивали с диагностическими результатами, полученными с помощью теста Папаниколау (Papanicolaou) (РАР-тест, цервикальная цитология) для тех же самых пациентов. Цервикальный цитологический тест проводили в соответствии с Мюнхенской классификацией II (1990). Рар II охватывает доброкачественные клетки, клетки области цервицита и метаплазии, Рар IV охватывает значительную дисплазию и карциному in situ. При этом оказалось, что образцы, дававшие OD для р16INK4а более чем 0,9 в анализе ELISA, соответствовали образцам, которые в соответствии со стандартным цитологическим РАР-тестом были классифицированы как диспластические.
Принимая OD=0,9 за пороговое значение при оценке образцов в ELISA, были получены следующие результаты (см. табл.7).
ELISA-тест был положительным для всех 3 образцов (100%), взятых у женщин со значительной дисплазией, и отрицательным для всех 30 образцов (100%), взятых у женщин, не имеющих дисплазии. И лишь один образец содержал очень мало клеток, а поэтому он был исключен из исследования, поскольку его сбор был неадекватным.
Нормализация уровней белка р16INK4а в солюбилизированных образцах пациентов по маркерам нормализации, указывающим на присутствие эпителиальных клеток, позволяет установить диагноз дисплазии исходя из аналогов этих образцов. В данном случае такая нормализация позволяет исключить ложноотрицательные результаты, обусловленные неадекватностью сбора образцов (например, если общее количество материала, полученного от пациента, является недостаточным для проведения анализа, или, если этот материал был собран не из нужного анатомического участка). Такую нормализацию осуществляли в тест-формате с использованием порогового значения OD для маркера нормализации гамма-катенина, определенного в ELISA как описано выше, и взятый образец был классифицирован как адекватный. Если величина OD была ниже определенного порогового значения (соответствующего 200000 сквамозных эктоцервикальных клеток), то делалось заключение, что данный образец не содержит адекватное количество материала, взятого у пациента. Использование второго маркера нормализации указывало на присутствие эндоцервикальных клеток и давало дополнительную информацию относительно адекватности образца. Такую нормализацию осуществляли в тест-формате с использованием порогового значения OD для маркера нормализации Ер-Cam, определенного в ELISA, как описано выше, и взятый образец был классифицирован как адекватный. Если величина OD была ниже определенного порогового значения (соответствующего 2000 цилиндрических эндоцервикальных клеток), то было сделано заключение, что данный образец не содержит адекватного количества эндоцервикальных клеток. (При этом следует отметить, что пороговое значение, используемое в данном примере, было скорректировано в соответствии с конкретными реакционными условиями. Это значение для данных клеток, а также для OD может варьироваться в зависимости от реакционных условий. Таким образом, используемые здесь величины приводятся лишь для иллюстрации условий теста и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. При этом каждый специалист может самостоятельно определить соответствующее пороговое значение для конкретного формата теста). Присутствие эндоцервикальных клеток дает информацию о контакте мазка или щетки с цилиндрическим эпителием эндоцервикса, а следовательно, указывает на контакт мазка или щетки с зоной трансформации, в которой обычно возникает дисплазия шейки матки. В частности, обнаружение определенного количества эктоцервикальных клеток (гамма-катенин) вместе с определенным количеством эндоцервикальных клеток (Ер-Cam) дает в высокой степени достоверную информацию о том, что данный материал был взят в нужном анатомическом участке (зона трансформации шейки матки).
С использованием пороговых величин, определяемых в этих экспериментах, цитологические образцы, взятые от 300 пациентов, были протестированы в анализе формата ELISA. В этих экспериментах образцы, идентифицированные как диспластические в цитологическом анализе, могут быть также идентифицированы как диспластические в анализе формата ELISA.
Пример 6: Детекция цервикальной внутриэпителиальной неоплазии в формате ELISA-тесте
34 цервикальных мазка, уже использованных в эксперименте, описанном в примере 5, и помещенных в буфер для лизиса, подвергали ELISA-анализу на сверхэкспрессию белка Е7 HPV и одного маркера адекватности в растворах, полученных из клеток, содержащихся в указанных мазках. ELISA-тест проводили как описано ниже.
(А) Лизис клеток
Щетки с цервикальными мазками помещали в 15 мл сосуды, содержащие 2 мл буфера для лизиса mtm. Цервикальные клетки, присутствующие на щетке, подвергали лизису, по меньшей мере, в течение 20 ч. Затем лизаты образцов цервикальных мазков переносили в 2 мл-пробирки и центрифугировали при 4°С (15 минут при 28000 х g (16600 об/мин, в высокоскоростной центрифуге JEC Multi RF)). Супернатант переносили в чистую пробирку. В данном случае супернатант может быть помещен на хранение при -20°С.
(В) Осуществление ELISA
Сенсибилизация ELISA-планшетов.
Маточные растворы клона Е7-специфического антитела NМ2 и клона антитела 15 против гамма-катенина разводили в PBS с получением готового раствора для сенсибилизации.
50 мкл каждого готового раствора, используемого для сенсибилизации иммобилизованным антителом, добавляли в ELISA-планшеты.
Для сенсибилизации планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С.
Растворы для сенсибилизации удаляли из ELISA-планшетов, и эти планшеты ополаскивали в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием 7 х 250 мкл промывочного буфера (0,1% твина 20 (об/об) в PBS).
После удаления остатков промывочного буфера в каждую лунку добавляли 300 мкл блокирующего буфера (2% BSA в PBS). Планшеты инкубировали в течение 1 часа на качалке при температуре окружающей среды.
Инкубирование с образцами
После удаления блокирующего буфера в каждую лунку добавляли 100 мкл образца клеток, подвергнутых лизису. Лизаты клеток HeLa использовали в качестве позитивного контроля для антител, специфически распознающих гамма-катенин. Для калибровки теста в данном тесте использовали различные концентрации рекомбинантного белка HPV 16 Е7, рекомбинантного гамма-катенина (0 пг/мл, 50 пг/мл, 100 пг/мл, 200 пг/мл, 400 пг/мл, 800 пг/мл).
Образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
Затем проводили промывку в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием 7 х 250 мкл промывочного буфера. Остаточный буфер удаляли.
Инкубирование с антителом для детекции
Рабочие растворы биотинилированных "вторых" антител (клона NМ13, специфичного к белку Е7 HPV16, и клона МАВ 2083, специфичного к гамма-катенину) получали путем разведения маточных растворов.
100 мкл рабочих растворов биотинилированных "вторых" антител добавляли в лунки, инкубируемые с соответствующим антигеном и иммобилизованным антителом. После инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре растворы антител удаляли и ELISA-планшеты промывали в автоматическом устройстве для мойки ELISA-планшетов с использованием 7 х 250 мкл промывочного буфера.
Детекция
Полимеры "стрептавидин-ПХ" (1 мг/мл) предварительно разводили 1:10 (4 мкл + 36 мкл буфера для инкубирования). Конечный раствор для инкубирования получали путем разведения 1:300 в буфере для инкубирования (0,1% BSA в PBS) до конечной концентрации 0,33 мкг/мл.
В каждую лунку добавляли 100 мкл полученного раствора и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
Затем буфер удаляли и планшеты 5 раз вручную промывали 200 мкл промывочного буфера на лунку.
Инкубирование субстрата
ТМВ-субстрат уравновешивали до 25°С в течение 1 часа в темноте.
В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата.
ELISA-планшеты инкубировали при 25°С в темноте в течение ровно 15 минут. Затем реакцию прекращали добавлением 80 мкл 2,5М Н2SO4.
Через 5 минут после прекращения реакции определяли OD 450 нм. После оценки результатов определяли значение OD для каждого образца.
Оценка результатов
Для установления адекватности образцов OD-величины всех образцов для гамма-катенина должны превышать определенное пороговое значение, что будет подтверждать присутствие минимального количества эпителиальных клеток (см. пример 5).
Для детекции диспластических клеток OD-величины для HPV16 Е7 должны превышать определенное пороговое значение, что будет подтверждать присутствие минимального количества трансформированных клеток. Это пороговое значение зависит от условий, используемых в анализе ELISA, и в формате описанного авторами теста оно составляло OD=0,7.
При сравнении OD-величин для HPV 16 Е7 детекция гамма-катенина в 34 образцах с соответствующими пороговыми значениями выявила, что 33 образца содержали эпителиальные клетки.
Хотя настоящее изобретение описано выше на предпочтительных вариантах своего осуществления, однако каждому специалисту очевидно, что в него могут быть внесены различные модификации, не выходящие за рамки объема изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ИСХОДЯ ИЗ СОЛЮБИЛИЗИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА | 2004 |
|
RU2405158C2 |
| СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ МУЛЬТИ-АНАЛИЗОВ РЕДКИХ КЛЕТОК, ЭКСТРАГИРОВАННЫХ ИЛИ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ФИЛЬТРАЦИЕЙ | 2013 |
|
RU2641595C2 |
| СПОСОБЫ КЛАССИФИКАЦИИ ПАЦИЕНТОВ С СОЛИДНЫМ РАКОМ | 2017 |
|
RU2745730C2 |
| СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ МУЛЬТИ-АНАЛИЗОВ РЕДКИХ КЛЕТОК, ЭКСТРАГИРОВАННЫХ ИЛИ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ФИЛЬТРАЦИЕЙ | 2013 |
|
RU2765808C2 |
| МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ШЕЙКИ МАТКИ | 2015 |
|
RU2702334C2 |
| ПЕПТИДЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ р16, ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВПЧ-АССОЦИИРОВАННЫХ ОПУХОЛЕЙ И ДРУГИХ ОПУХОЛЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ р16 | 2012 |
|
RU2626542C2 |
| ФОСФОДИЭСТЕРАЗА 9А В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ | 2010 |
|
RU2592668C2 |
| СПОСОБ РАННЕЙ И ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНОГО РАКА | 2003 |
|
RU2251699C1 |
| СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ КАРЦИНОМ | 1999 |
|
RU2217761C2 |
| РЕПРЕЗЕНТАТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА | 2016 |
|
RU2743169C2 |
Настоящее изобретение относится к способам диагностики медицински релевантных состояний путем детекции уровней соответствующих маркеров, являющихся признаком медицински релевантного состояния, и уровней маркеров нормализации. Способ включает стадии определения уровней одного или нескольких маркеров, ассоциированных с диагностируемым состоянием; определения уровня одного или нескольких маркеров нормализации, которые могут быть использованы вместо информации, относящейся к морфологическим аспектам данного образца; сравнения и/или объединения данных об уровнях маркеров, являющихся признаком заболевания, и маркеров нормализации; и установления диагноза клинически релевантного состояния. Изобретение позволяет вместо информации о морфологии клеток, получаемой на основании данных цитологических и/или гистологических анализов тест-образцов, использовать молекулярную информацию, полученную путем анализа раствора, в котором растворяют исходный тест-образец, и с помощью этих растворенных тест-образцов осуществлять точный и воспроизводимый анализ для диагностики клинически релевантного состояния 5 н. и 46 з.п. ф-лы, 7 табл., 3 ил.
(a) получения исходного образца, содержащего клетки, взятые у пациента, или их дебрис;
(b) получения раствора указанного исходного образца;
(c) детекции уровней одного или нескольких релевантных маркеров, являющихся признаком указанного медицински релевантного состояния в указанном растворе образца;
(d) детекции уровней одного или нескольких маркеров нормализации, коррелирующих по меньшей мере с одним из нижеследующих параметров нормализации:
присутствием или отсутствием клеток конкретного типа среди клеток, представленных в растворе образца;
наличием или отсутствием конкретного характера дифференцировки клеток, представленных в растворе образца;
наличием или отсутствием конкретных пролиферативных свойств клеток, представленных в растворе образца;
(e) нормализации детектируемых уровней указанных одного или нескольких релевантных маркеров по меньшей мере по одному из указанных параметров нормализации; и
(f) диагностики медицински релевантного состояния, исходя из уровней релевантных маркеров, нормализованных по параметрам нормализации.
(a) по меньшей мере один реагент для детекции по меньшей мере одной маркерной молекулы, являющейся признаком медицински релевантного состояния; и
(b) по меньшей мере один реагент для детекции по меньшей мере одного маркера нормализации, коррелирующего по меньшей мере с одним из следующих параметров:
присутствием или отсутствием особого типа клеток или характера дифференцировки в клетках, представленных в растворе образца;
наличием или отсутствием конкретных пролиферативных свойств клеток, представленных в растворе образца; и
(c) буфер для солюбилизации образцов.
(a) по меньшей мере одну маркерную молекулу, используемую для осуществления реакций позитивного контроля и выбранную из группы, состоящей из
(i) релевантных маркерных молекул, являющихся признаком медицински релевантных состояний;
(ii) маркерных молекул нормализации, коррелирующих по меньшей мере с одним из следующих параметров:
наличием или отсутствием [признаков] конкретного характера дифференцировки в клетках, представленных в растворе образца;
наличием или отсутствием конкретных пролиферативных свойств клеток, представленных в растворе образца; и
(b) реагенты и буферы, обычно используемые для осуществления реакции детекции.
(a) получение раствора из образца шейки матки человека;
(b) детекцию уровня по меньшей мере одного релевантного маркера, являющегося признаком дисплазии шейки матки;
(c) детекцию уровня по меньшей мере одного маркера нормализации, указывающего на присутствие эпителиальных клеток;
(d) нормализацию уровней релевантных маркеров по уровням маркеров нормализации, детектируемых в растворе образца;
(e) установление диагноза дисплазии шейки матки, исходя из уровней релевантных маркеров, нормализованных по маркерам нормализации.
(a) по меньшей мере один реагент для детекции по меньшей мере одной маркерной молекулы, являющейся признаком дисплазии шейки матки, выбранный из группы, состоящей из p16INK4a, p14ARF, циклина Е, циклина А, циклина В, MN, her2/neu, mdm-2, bcl-2, EGF-рецептора, mcm-2, mcm-5, клаудина-1, маркеров-индикаторов инфекции, вызванной папиломавирусом человека, pRb и р53; и
(b) по меньшей мере один реагент для детекции по меньшей мере одного маркера нормализации, указывающего на присутствие или отсутствие эпителиальных клеток, выбранный из группы, состоящей из CK8, Ep-Cam, CK13, CK8, CK18, Е-кадгерина, альфа-катенина, бета-катенина, гамма-катенина или инволюкрина.
(a) по меньшей мере одну маркерную молекулу, используемую для осуществления реакций позитивного контроля и выбранную из группы, состоящей из
(i) релевантных маркерных молекул, являющихся признаком дисплазии шейки матки;
(ii) маркерных молекул нормализации, коррелирующих по меньшей мере с одним из следующих параметров:
присутствием или отсутствием цилиндрических эпителиальных клеток;
присутствием или отсутствием сквамозных эпителиальных клеток; и
(b) реагенты и буферы, обычно используемые для осуществления реакции детекции.
(a) реагент для детекции p16INK4a; и
(b) реагент для детекции гамма-катенина.
| Способ отогрева наконечника криохирургического инструмента | 1984 |
|
SU1217377A1 |
| Сборная железобетонная обделка тоннеля | 1978 |
|
SU723156A1 |
| WO 9904238 A1, 28.01 1999 | |||
| УСИЛИТЕЛЬ МОЩНОСТИ | 0 |
|
SU208764A1 |
| US 6331393, 18.12.2001 | |||
| RU 217440902, 10.10 2001. | |||
