СПОСОБ РАННЕЙ И ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНОГО РАКА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/574 G01N33/577 

Изобретение относится к области медицинской биохимии, конкретно к способам ранней диагностики цервикального рака и рисков перерождения эпителиальных дисплазий в цервикальный рак. Изобретение может быть использовано также для оценки эффективности лечения рака и эпителиальных дисплазий.

Рак шейки матки является вторым по частоте онкологическим заболеванием, регистрируемым у женщин. В настоящее время на основе эпидемиологических и вирусологических исследований можно считать установленной взаимосвязь инвазийного цервикального рака с вирусами папилломы человека (ВПЧ) /Фиг.1/. Установлена также корреляция между ВПЧ и неоплазиями и инвазийным раком матки, наружных половых органов, ануса /Sexually transmitted disease “Vaccines, prevention and control”, 2000, Edited by D.I.Bernstein, Academic Press.; В.И.Киселев и др. “Взаимосвязь вирусных инфекций, передаваемых половым путем, и онкологических заболеваний урогенитального тракта”. Вестник дерматологии, 2000 г., №6, с.20-23/.

Многие годы для ранней диагностики цервикального рака используются цитологические исследования (являющиеся в отечественной медицине базовым методом лабораторной диагностики и в настоящее время), так называемые Рар-мазки, выявляющие атипичные, многоядерные клетки. Однако эта методика выявляет не более 30% носителей инфекции, не отвечает современным требованиям и не может предсказать риски развития заболевания.

Изучение структуры ДНК ВПЧ, в том числе кодирующей девять иммуногенных белков, закономерностей репликации вируса, иммортализации и трансформации им эпителиальных клеток, дали возможность разрабатывать скрининговые системы, в основе которых лежат выявленные биохимические, иммунологические, генетические параметры, имеющие отклонения при патологиях от их значений в норме.

Такие данные не всегда удается интерпретировать в сторону ранней диагностики или риска развития цервикального рака, оценки эффективности лечения в виду того, что либо используемые методы измерения не обладают необходимой чувствительностью и/или специфичностью, либо сами измеряемые параметры непосредственно не отображают процесса перерождения клеток, либо отображают, но не в пропорциональном виде.

Таким образом, выбор маркера и метода его определения (разработка такого метода) являются на настоящий момент времени актуальной задачей, требующей изобретательского уровня решений.

Прежде всего, описаны методы диагностики цервикального рака по определению титра антител к белкам HPV методами иммуноферментного и радиоиммунного анализов /см., например, ЕР №№386734, 375555, 406542, 523391/ в сыворотке крови пациентов. Однако этот подход не оправдал ожиданий, так как не была обнаружена достоверная корреляция между титром антител и цервикальным раком.

Известны также методы диагностики и прогноза развития цервикального рака на основе типирования и количественного определения уровня ДНК ВПЧ в исследуемом образце, например, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) /В.И.Киселев и др. “Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций”. Пособие для врачей, Москва, 2000, WO №00506645, пат. США №5679509/.

Однако использование этих методов приводит к значительной гипердиагностике, так как примерно в 80% случаев инфицирование ВПЧ имеет кратковременный характер и заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. Таким образом, положительный результат на ДНК ВПЧ не позволяет в большинстве случаев прогнозировать развитие цервикального рака.

Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению является способ ранней диагностики цервикального рака и определения риска его развития путем количественного иммунологического определения онкобелков Е6/Е7 ВПЧ в биопсийной клеточной пробе /WО №0154713, А 61 К 38/18, 2001-08-02, Methods for determining risk of developing cervical cancer/.

В качестве маркеров ВПЧ использовались Е6/Е7 белки, которые определялись иммунофлюоресцентным методом из гистологических депарафинизированных проб с использованием (для количественного определения) цифровых компьютерных технологий для анализа многомерных визуализированных образов. При превышении содержания белков Е6/Е7 в лабораторных пробах по сравнению с нормой свыше 54% делали вывод об увеличенном риске развития цервикального рака.

В способе также предлагается использовать другие биохимические маркеры: рецептор эпидермального фактора роста, инсулин-подобный фактор роста.

Использование этих маркеров показывает достаточно хорошую сходимость результатов между собой и наблюдаемой клинической картиной.

Однако необходимо подчеркнуть тот факт, что применение иммуноферментного метода анализа для используемых маркеров из цитологических проб по запатентованному способу оказалось не состоятельным, так как приводило к ошибочным позитивным результатам.

Известный способ имеет существенные недостатки, так как требует дорогостоящей аппаратуры, высокой квалификации обслуживающего персонала, характеризуется сложной, а потому плохо стандартизируемой процедурой пробоподготовки. Эти недостатки лишают этот метод статуса мониторингового способа (как следует из п.п.2, 4, 6 формулы изобретения способ используется по показаниям - цервикальная интраэпителиальная неоплазия).

Изобретательской задачей является упрощение, удешевление способа, который может быть использован для скрининга большого количества проб и легко поддается стандартизации, благодаря высокой стандартности пробозабора и анализа, то есть создание скринингого способа.

Задача решается тем, что заявителю удалось разработать высокочувствительный (коррелирующий со способом-прототипом) иммуноферментный способ ранней диагностики цервикального рака из цитологических проб с использованием в качестве маркера онкобелка Е7 ВПЧ.

Таким образом, предлагается способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака путем количественного иммунологического определения онкобелка вируса папилломы человека (ВПЧ) в биопсийной клеточной пробе пациента, отличающейся тем, что биопсийную клеточную пробу лизируют, анализу подвергают надосадок клеточного лизата биопсийной пробы в забуференном физиологическом растворе на содержание в нем белка Е7 ВПЧ с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам и распознающих различные антигенные детерминанты белка Е7, выбранные из группы: 716-321, 716-325, 716-332, 716-343 (IgG2a) и 716-281, 716-288 (IgG2b), одно из которых предназначено для первичного связывания белка, другое, представляющее собой конъюгат антитела с ферментной меткой, - для выявления образующихся комплексов при использовании многократного избытка последнего, и при концентрации Е7 белка в пробе большей, чем 0,05 нг/мл определяют раннюю стадию цервикального рака или риска его развития.

Способ характеризуется также тем, что для получения моноклональных антител используют рекомбинантные белки Е7 ВПЧ.

Наиболее предпочтителен вариант, когда для первичного связывания белка используют антитела 716-281, а для проявления образующихся комплексов - фермент-меченные антитела 716-332.

Используемые моноклональные антитела специфичны к Е7 HPV16, но перекрестно реагируют с Е7 HPV18 (двух наиболее распространенных типов ВПЧ "высокого риска").

При положительной пробе на белок Е7 желательно осуществить типирование ВПЧ, например, методом полимеразной цепной реакции, что позволит более точно интерпретировать результаты способа.

Решение поставленной задачи стало возможным, во-первых, благодаря выбору в качестве маркера белка Е7 ВПЧ (например, по сравнению с Е6 ВПЧ), как наиболее четко реагирующего на процесс перерождения эпителиальных клеток, которому предшествует процесс интеграции копии ДНК вируса в ДНК клетки, при этом наблюдается, как установил заявитель, пороговое увеличение синтеза этого белка.

С целью получения воспроизводимых результатов по измерению онкобелка Е7 ген Е7 был клонирован и экспрессирован в клетках E.coli. Выделенный из бактериальных клеток белок Е7 подвергался процедуре рефолдинга с целью восстановления его природной конформации. Этим белком иммунизировали мышей. В большинстве случаев антитела, полученные иммунизацией рекомбинантными белками, не взаимодействуют с природным белком, т.к. распознают другие детерминанты.

Заявителю же удалось получить два типа высокочувствительных моноклональных антител к белку Е7 природного происхождения, перекрестно реагирующих на два типа ВПЧ “высокого риска” (HPV16, HPV18), гарантированно обеспечив полноту охвата больных до 80-85%. Использование попарно двух типов моноклональных антител, реагирующих с различными антигенными детерминантами белка Е7, позволило повысить специфичность и обеспечить отсутствие фона при определении.

Условия проведения количественного анализа были оптимизированы путем варьирования концентрации антител для сорбции, разведения конъюгата, состава буферных растворов, времени и температуры для всех стадий сэндвич-ИФА.

Аналогичной тест-системы для белка Е6 реализовать не удалось.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами:

На фиг.1 представлена схема развития папилломавирусной инфекции,

На фиг.2 представлена структура плазмид,

На фиг.3 - хроматограмма белков Е7 HPV16 и HPV18, полученных синтезом этих белков в клетках Е.соli

На фиг.4 - калибровочный график для количественного определения белка Е7 HPV16 в сэндвич-ИФА. МоАт 716-281 сорбировали из 0,1 М карбонатного буферного раствора, рН 9.6 с концентрацией 5 мкг/мл. Рабочее разведение конъюгата МоАт 716-332 с пероксидазой - 1/50000 в PBS, содержащем 0,2% БСА и 0,05% Tween 20. Субстрат - ТМВ. По оси абсцисс - концентрация белка, нг/мл. По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм. На графике показана ошибка эксперимента для трех независимых измерений.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример I.

Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих синтез онкобелков Е7 ВПЧ 16 и 18 типов.

В качестве источника гена Е7 использовали биопсийный материал из шейки матки пациенток с диагнозом цервикальная дисплазия. Полученные клинические образцы исследовали на наличие ВПЧ методом полимеразной цепной реакции. Отбирались пробы, содержащие ДНК ВПЧ 16 и 18 типов, затем с помощью геноспецифических праймеров методом ПЦР амплифицировали гены Е7 16 и 18 типов (фрагмент ДНК 303 bp - HPV-16 и фрагмент 324 bp-HPV-18) и клонировали по сайтам EcoRI - ВаmHI в плазмиде pBluescipt SK (+) (Stratagene). Определение олигонуклеотидной последовательности клонированных генов показало полное соответствие данным GenBank (например, AF125673).

На следующем этапе в область 3' конца структурной части генов были встроены последовательности терминации трансляции. Структура полученной генетической конструкции представлена на фиг.2.

Синтез белков Е7 16 и 18 типов в клетках E.coli.

рНЕ716 кодирует белок е716: Met(His)6-GluPheIle-E716-GlySer (111 a.o., 12,5 кДа, ИЭТ 4,6). Необходимо отметить, что при электрофорезе в SDS-ПААГ по Лэммли этот белок обладает аномальной подвижностью (около 21 кДа), что соответствует литературным данным.

РНЕ718 кодирует белок е718: Met(His)6-GluPheSer-E718-GlySer (117 a.o., 13,5 кДа, ИЭТ 5,4).

Для экспрессии полученных генов использовали штамм BL21(DE3). Индукцию и разрушение клеток проводили по стандартной схеме. После озвучивания е716 и е718 обнаруживаются во фракции растворимых клеточных белков, поэтому хроматографию на Ni-ША-агарозе проводили в нативных условиях без добавления мочевины (фиг.3).

Пример 2

Получение мышиных моноклональных антител к рекомбинантным белкам Е7 HPV16 и HPV18.

Мыши линии Balb/c (самки, 16-18 г) были дважды иммунизированы с двухнедельным интервалом в подушечки лап высокоочищенными препаратами Е7 HPV16 и Е7 HPV18, полученными методом одностадийной металлохелатной хроматографии из лизатов рекомбинантных Е.соli. Количество белка на одну иммунизацию составляло 20 мкг в виде суспензии с равным объемом полного (1-я иммунизация) или неполного (2-я иммунизация) адъюванта Фрейнда. На четвертый день после второй иммунизации лимфоциты из подколенных узлов сливали с миеломными клетками Sp 2/0 - Ag14 при помощи PEG 4000, гибридомы отбирали на селективной среде HAT, а затем скринировали в непрямом ИФА и дважды клонировали позитивные культуры методом предельных разведений. Для проведения ИФА рекомбинантные белки Е7 HPV16 и HPV18 сорбировали на полистирольные планшеты из раствора с концентрацией 2 мкг/мл и затем вносили культуральные супернатанты на 1 час при 37°С без разведения. Связавшиеся с иммобилизованным антигеном моноклональные антитела выявляли при помощи козьих антител против IgG (H+L) мыши, конъюгированных с пероксидазой, в течение 1 часа при 37°С. В качестве субстрата использовали раствор тетраметилбензидина (ТМВ) с перекисью водорода. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм. В результате на белок Е7 HPV16 были получены две группы гибридов, продуцирующих антитела 716-281, 716-288 (IgG2b) и 716-321, 716-325, 716-332, 716-343 (IgG2a), которые одинаково хорошо взаимодействовали с Е7 HPV16 и HPV18 в непрямом ИФА (см. Таблицу 1).

Пример 3

Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа для количественного определения белков Е7 HPV16 и HPV18 на основе моноклональных антител.

МоАт к Е7 HPV16 выделяли из асцитных жидкостей аффинной хроматографией на белок G-сефарозе (чистота более 95%) и метили пероксидазой хрена периодатным методом. Все комбинации МоАт попарно были проверены на предмет количественного определения Е7 HPV16 в сэндвич-ИФА. Для этого каждое МоАт иммобилизовали на полистирольных планшетах, затем вносили 7 двукратных разведений Е7 HPV16 в диапазоне концентраций 0.039-5.0 нг/мл и проявляли образовавшиеся иммунные комплексы при помощи всех пероксидазных конъюгатов МоАт, используя в качестве субстрата тетраметилбензидин (ТМВ). Оказалось, что все проверенные пары МоАт обладают способностью образовывать тройной комплекс (сэндвич): иммобилизованное антитело-Е7-конъюгат, что свидетельствует об олигомерном состоянии белка Е7 HPV16 в растворе даже в диапазоне концентраций 10^-12-10^-9 М. Несмотря на то, что все комбинации МоАт работали в сэндвич-ИФА, пары из одних и тех же антител или из антител, принадлежащих одной группе, демонстрировали меньшую чувствительность (величина оптической плотности при фиксированной концентрации Е7 HPV16 и наклон калибровочного графика), чем пары МоАт из разных групп. Наилучшие результаты в терминах чувствительности и отсутствия фона были получены, когда МоАт 716-281 использовали для сенсибилизации планшетов, а МоАт 716-332 - в качестве пероксидазного конъюгата. Условия проведения количественного анализа Е7 HPV16 с использованием этой пары МоАт были оптимизированы путем варьирования концентрации антител для сорбции, разведения конъюгата, состава буферных растворов, времени и температуры для всех стадий сэндвич-ИФА. Калибровочный график для количественного определения Е7 HPV16 при оптимальных условиях ИФА представлен на фиг.4. Как видно из рисунка, калибровочный график практически линеен в диапазоне концентраций антигена 0.039-5.0 нг/мл, характеризуются полным отсутствием фона и обеспечивает предел детекции для Е7 HPV16 - 40 пг/мл, что является достаточным для определения уровня экспрессии Е7 HPV16 в трансфицированных клетках и клинических образцах (см. фиг.4).

Пример 4

Измерение онкобелка Е7 в цервикальных пробах

Материал соскоба шейки матки помещали в 1 мл физиологического р-ра, трехкратно замораживали - оттаивали и центрифугировали в микроцентрифуге (Эппендорф) 10 мин при 10 000 об/мин. Надосадок разводили в два раза PBS-AT (PBS, 0,2% BSA, 0,1% Tween 20), 200 мкл вносили в лунку планшета, предварительно засорбированного моноклональными антителами против Е7-16, и титровали шагом ¹/₂ на 4 лунки. В этом же планшете в качестве стандарта титровали очищенный рекомбинантный белок Е7-16 типа от 4 нг/мл до 0,062 нг/мл. После часовой инкубации и отмывки вносили конъюгат моноклональных антител к Е7-16, меченый пероксидазой, инкубировали 1 час и проявляли реакцию ТМВ. Оптическую плотность измеряли на Мультискане ЕХ при длине волны 450 нм. По величине оптической плотности разведений стандарта строили калибровочный график, по которому определяли концентрации Е7 в пробе.

Были проведены скрининговые исследования (n=100). В качестве контроля исследовались образцы от здоровых пациентов, у которых ВПЧ не был обнаружен либо было выявлено инфицирование ВПЧ “низкого риска”(n=10).

Для всех здоровых пациенток проба по Е7 была отрицательной либо, в некоторых случаях, слабоположительной. Но во всех случаях содержание Е7 было меньше 0,05 нг/мл.

Для всех патологий пробы были положительными и превышали концентрационный порог 0,05 нг/мл. Полученные данные представлены в таблице 2.

Как следует из приведенной таблицы, данные ИФА полностью соответствуют медицинскому диагнозу. Данные по типированию вируса ВПЧ также коррелируют с ними и помогают прогнозировать риск развития цервикального рака.

Изобретение относится к области медицинской биохимии и касается способа ранней и доклинической диагностики цервикального рака. Сущность изобретения заключается в определении в биопсийной пробе онкобелка Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам, выбранных из групп: 716-321, 716-325, 716-332, 716-343, 716-281, 716-288, одно из которых предназначено для первичного связывания белка, другое, представляющее конъюгат антитела с ферментной меткой, - для выявления образующихся комплексов. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.

1. Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака путем количественного иммунологического определения онкобелка вируса папилломы человека (ВПЧ) в биопсийной клеточной пробе пациента, отличающийся тем, что биопсийную клеточную пробу лидируют, анализу подвергают надосадок клеточного лизата биопсийной пробы в забуференном физиологическом растворе на содержание в нем белка Е7 ВПЧ с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам и распознающих различные антигенные детерминанты белка Е7, выбранные из группы: 716-321, 716-325, 716-332, 716-343 (IgG2a) и 716-381, 716-288 (IgG2b), одно из которых предназначено для первичного связывания белка, другое, представляющее собой конъюгат антитела с ферментной меткой, - для выявление образующихся комплексов при использовании многократного избытка последнего, и при концентрации Е7 белка в пробе, большей, чем 0,05 нг/мл, которую считают положительной, определяют раннюю стадию цервикального рака или риска его развития.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения моноклональных антител используют рекомбинантные белки Е7 ВПЧ.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют антитела 716-281 и фермент-конъюгированные антитела 716-332 соответственно.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют моноклональные антитела, специфичные к Е7 HPV16, но перекрестно реагирующие с Е7 HPV18.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при положительной пробе на белок Е7 осуществляют типирование ВПЧ.6. Способ по п.5, отличающийся тем, что типирование проводят методом полимеразной цепной реакции.