Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к тест-системе на основе биологического чипа для количественного и/или качественного анализа биологических образцов. В частности, изобретение относится к тест-системе в виде биологического чипа для анализа разных молекул-мишеней, например антитела-мишени и антигена-мишени, в препарате. Данная система состоит из не менее одного биочипа, содержащего не менее одного реактора, внутри которого иммобилизованы молекулы-зонды, способные взаимодействовать с различными молекулами-мишенями в образце. Молекулы-зонды представляют собой, в частности, зонд-антитело и зонд-антиген и расположены по определенному порядку в виде матрицы зондов и/или схемы расположения зондов. Для наблюдения результатов взаимодействия молекулы-зонда с молекулой-мишенью в состав данной системы могут входить меченые вещества, способные реагировать с молекулами-мишенями, которые захвачены молекулами-зондами. Меченые вещества состоят из разных лигандов в соответствии с разными комбинациями зондов и связывающихся с лигандами меток.
Данное изобретение также относится к способу применения данной тест-системы в виде биочипа для анализа биологических образцов.
Уровень техники
В настоящее время, тест-система биочипа для анализа биологических образцов, основанная на взаимодействии антитела и антигена, состоит из биочипа с зондами-антителами или с зондами-антигенами. Биочип с зондами-антигенами содержит не менее одного реактора, внутри которого в качестве зонда иммобилизованы антигены по определенному порядку (в адресованном виде). Биочип с зондами-антителами содержит не менее одного реактора, внутри которого в качестве зонда иммобилизованы антитела по определенному порядку.
Тест-система в виде биочипа, как правило, содержит меченые вещества, роль которых исполняют лиганды и связывающиеся с ними метки. Меченые вещества представляют собой меченое антитело или меченый антиген. Меченое антитело способно реагировать с антигеном-мишенью, а меченый антиген способен реагировать с антителом-мишенью. Таким образом, в существующей тест-системе в виде биочипа используются антитела или антигены в качестве зондов, способных взаимодействовать с антигенами или антителами в образце, и меченый антиген или меченое антитело в качестве меченых веществ.
В реакторе могут иметь место разные типы взаимодействия между молекулой-зондом, молекулой-мишенью и меченой молекулой, в том числе непрямое взаимодействие, взаимодействие типа захвата, взаимодействие типа конкурентного ингибирования, сандвич-подобное взаимодействие с двойными антителами или с двойными антигенами и т.п. Соответственно, существуют разные методы наблюдения результатов анализа, например непрямой метод, метод захвата, метод конкурентного ингибирования, сандвич-подобный метод с двойными антителами или с двойными антигенами и т.п. Разные методы наблюдения могут быть использованы в тест-системе биочипа. Однако только конкретный метод наблюдения используется в системе с определенным меченым веществом. Например, в случае биочипа с фиксированным специфическим антигеном в качестве зонда, с которым взаимодействует соответствующее антитело в препарате, используется сандвич-подобный метод с двойными антигенами, когда в систему добавляют меченый антиген к тому же антителу-мишени; когда добавляют меченое анти-антитело против антител-мишеней, то используется непрямой метод наблюдения. Подобная ситуация также происходит в случае, когда антитело используется в качестве зонда. При этом используется сандвич-подобный метод с двойными антителами для наблюдения результата, если в качестве меченого вещества использовано меченое антитело против антигена-мишени.
Тест-система биочипа для анализа биологических образцов основана на взаимодействии между антителом и антигеном, имеет широкие перспективы применения, особенно в области клинической иммунологической диагностики. Однако при использовании существующих тест-систем биочипа могут быть подвергнуты анализу в образце только антигены-мишени или антитела-мишени отдельно, в связи с чем ограничивается их эффективность и применение в клинике.
Раскрытие изобретения
Данное изобретение относится к тест-системе в виде биологического чипа, состоящей из не менее одного биочипа, содержащего не менее одного реактора, внутри которого иммобилизованы молекулы-зонды по определенному порядку в виде матрицы зондов и/или схемы расположения зондов. При этом молекулы-зонды представляют собой, в частности, зонд-антитело и зонд-антиген.
В состав данной тест-системы также входят меченые вещества, способные реагировать с молекулами-мишенями, которые захвачены молекулами-зондами. Меченые вещества состоят из разных лигандов в соответствии с разными комбинациями зондов и связывающихся с ними меток. Лиганды обладают специфичностью при взаимодействии с антителом или антигеном или специфическим сродством к антителу и/или антигену.
В качестве меченых молекул в данной тест-системе могут быть следующие комбинации веществ:
1) комбинация меченых специфических антител и антигенов;
2) комбинация меченых анти-антител со структурными специфичностями;
3) комбинация меченых видоспецифичных анти-антител и меченых специфических антител и/или меченых специфических антигенов;
4) комбинация меченых анти-антител со структурными специфичностями и меченых специфических антител и/или меченых специфических антигенов;
5) произвольные комбинации на основании вышеупомянутых комбинаций.
В тест-системе данного изобретения зонды-антитела могут содержать HBsAb (антитело против поверхностного антигена вируса гепатита В), и зонды-антигены могут содержать антигены ВИЧ, HCV (вируса гепатита С) и сифилиса. Зонды-антитела могут содержать HBeAb (антитело против антигена е вируса гепатита В), и зонды-антигены могут содержать HBcAg (антиген с вируса гепатита В или кодовый антиген вируса гепатита В), HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) и HBeAg (антиген е вируса гепатита В). Зонды-антигены могут содержать HCV-Ag (антиген вируса гепатита С) и HGV-Ag (антиген вируса гепатита G).
В тест-системе данного изобретения зонды-антитела могут содержать антитело против антигена р24 ВИЧ, и зонды-антигены могут содержать антигены gp160, gp41 и gp36 ВИЧ.
В тест-системе данного изобретения зонды-антигены могут содержать EBV-Ag (антиген вируса Эпштейна-Барр).
В тест-системе данного изобретения зонды-антитела могут содержать антитело против хорионического гонадотропина HCG, антитело против карциномы-специфичного антигена СА50, антитело против полисахарида СА242, антитело против специфичного антигена грудной карциномы СА153, антитело против антигена эмбриона карциномы СЕА и антитело против специфичного антигена карциномы яичника СА125.
Данное изобретение далее также относится к способу применения тест-системы на основе биочипа в данном изобретении для анализа биологических образцов. Анализ проводится следующим образом:
a) нанесение образцов в реактор биологического чипа в тест-системе по изобретению и проведение реакции;
b) добавление меченых веществ в реактор отдельно, после частичного или после полного смешивания;
с) измерение результатов реакций в реакторе.
Осуществление изобретения
Давно известно, что между антигеном и соответствующим антителом существует специфическое взаимодействие. Также было известно, что антитело взаимодействует с анти-антителами, полученными от разных видов животных, с разными активностями. Такое явление было названо как видоспецифичность. Подобная ситуация имеет место при исследовании взаимодействия анти-антитела с иммуноглобулинами. В этом случае, анти-антитело взаимодействует с иммуноглобулинами разных классов или подклассов с разными активностями. Однако эти знания до сих пор не были использованы в решении вопроса об анализе комбинаций разных молекул-мишеней, например антитела и антигена, в препарате в одном реакторе. Трудность состоит в возможности помех между молекулами-зондами, молекулами-мишенями и мечеными веществами. Однако при исследовании взаимодействия между антителами, антигенами и анти-антителами с помощью биологических чипов авторы не наблюдали заметных помех в системе. В таблице 1 показаны результаты, полученные при исследовании взаимодействия между антителом, антигеном и анти-антителом.
Сущность изобретения состоит в том, что для анализа биологических образцов используется биологический чип, содержащий не менее одного реактора, внутри которого фиксируются зонды, представляющие собой антитела и антигены, в частности, по определенному порядку в виде матрицы зондов и/или схемы зондов.
В данном изобретении, тест-система биочипа представляет собой набор реактивов, необходимых для количественного или качественного анализа при применении биочипа. Тест-система биочипа в данном изобретении состоит из не менее одного биочипа, содержащего не менее одного реактора. Биочип или планшет с зондами составляет основной компонент тест-системы, содержащей не менее одного реактора. Реактором в данном изобретении обозначает емкость или поверхность с границами, на которых зафиксированы зонды прямым или непрямым способом. После добавления образцов в реакторе происходят взаимодействия зондов с определенными компонентами препарата, и результаты таких взаимодействий наблюдаются непосредственно или регистрируются с помощью устройств. Примерами реакторов служат подложка с зондами в случае биочипа с монореактором и реакционная ячейка в случае биочипа с многочисленными реакторами. Тест-система биочипа в данном изобретении отличается от существующих тест-систем и тест-системы быстрого анализа. В существующих тест-системах, примерами которых являются ELISA система, система биотин-авидин, иммунорадиоактивная система, иммунофлуоресцентная система, хемилюминесцентная система, электролюминесцентная система и т.д., молекулы-зонды иммобилизованы случайным образом. В тест-системах быстрого анализа антиген или антитело в качестве зонда иммобилизован отдельно на тест-полоске, и тест проводят на основании иммуноаффинной хроматографии. Реактор биочипа в данном изобретении также отличается от набора параллельно расположенных реакторов, примером которого является китайский патент, заявка номер 00226807.8, где отдельный антиген или антитело был иммобилизован на отдельной тест-полоске в качестве зонда.
В данном изобретении, к зондам относятся вещества, иммобилизованые в реакторе и способные связываться с молекулами-мишенями в образце. Зонды, в частности, состоят из антигенов и антител. Другие вещества могут быть использованы в качестве зондов, если они не приводят к помехам в системе.
Антигены (Ag) в данном изобретении представляют собой вещества, способные активировать иммунную систему организма, приводить к синтезу антител и активации лимфоцитов. Антигены также способны взаимодействовать с продуктами иммунного ответа (антителами и активированными лимфоцитами) специфично, при этом происходит иммунная реакция. К антигенам в данном изобретении относятся полные антигены, полуантигены и любые вещества, способные вызывать иммунный ответ. Такие вещества как компоненты растений, животных и микроорганизмов (белки, полипептиды, липиды, сахариды и т.п.), продукты метаболизма, искусственные антигены, рекомбинантные антигены, лекарства, компоненты лекарств, а также антитела, используемые для получения вторичных и третичных антител, являются антигенами.
К антителам (Аb) в данном изобретении относятся природные антитела, специфические антитела, моноклональные антитела, поликлональные антитела, генно-инженерные антитела и фрагменты антител. Иммуноглобулины (Ig) состоят из иммуноглобулинов разных классов (IgA, IgQ IgM, IgE, IgD) и подклассов (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).
Анти-антитела в данном изобретении представляют собой антитела, полученные при использовании антитела или анти-антитела в качестве антигенов. К анти-антителам относятся вторичные, третичные и т.п. антитела. Анти-антитела против иммуноглобулинов со структурными специфичностями представляют собой антитела, полученные с использованием иммуноглобулинов с разными структурами в качестве антигенов.
Здесь показан возможный вариант сочетания зондов, состоящий из антитела против HBsAg, антигена HCV, антигенов ВИЧ1+2, антигена HTLV и антигена сифилиса. Реактор с такими фиксированными зондами используется для анализа на антиген HBsAg и 4 антител (антитела против HCV, ВИЧ1+2, HTLV и сифилиса) в образце.
Другие примеры комбинаций зондов обсуждаются в конкретных примерах осуществления данного изобретения.
В данном изобретении, использованные зонды-антитела и зонды-антигены могут быть парными или непарными. К парным зондам относятся антигены и антитела, способные взаимодействовать друг с другом, как в случае HBsAg и HBsAb в примере 6. К непарным зондам относятся антигены и антитела, не способные взаимодействовать друг с другом, как в примерах 1-5, 7 и 8 соответственно.
В данном изобретении, зонды иммобилизованы в реакторе по определенному порядку таким образом, что молекулы-зонды после иммобилизации остаются опознаваемыми по их расположениям. Зонды могут быть иммобилизованы в виде матрицы, где каждый зонд отличается от остальных по своему адресу в матрице. Зонды также могут быть иммобилизованы в виде схемы, где зонды расположены по определенной опознаваемой схеме. Например, М типов антигенов, где М равно или больше единицы, и N типов антител, где N равно или больше единицы, зафиксированы в реакторе в виде матрицы, с образованием M×N матрицы зондов. Другие варианты расположения зондов в реакторе описываются в соответствии с примерами. В примерах осуществления данного изобретения явление помехи не было обнаружено, чем исключается возможность помех между молекулами в реакторе биочипа.
В данном изобретении, зонды фиксируются в реакторе прямым или непрямым способом. Непрямое фиксирование имеет место, когда зонды фиксируются в реакторе через интермедиаторы. Например, зонды связываются с активированными носителями, последние непосредственно иммобилизуются на поверхности реактора. Способы иммобилизации зондов не влияют на результаты анализа на разные молекулы-мишени при использовании биочипа в данном изобретении.
Реакторы в системе анализа в данном изобретении изготавливаются с фиксированием зондов на твердых носителях. Носители изготавливаются из разных материалов, которые могут быть органическими или неорганическими, прозрачными или непрозрачными, гидрофильными или гидрофобными, твердыми или мягкими, например стеклом, пластмассой, металлами, целлюлозой, резиной и т.п., которые могут быть использованы для изготовления носителя. Разные молекулы-зонды могут быть иммобилизованы в реакторе одновременно или отдельно.
Система метки составляет важную часть тест-системы биочипа в данном изобретении. Система метки содержит меченые вещества, состоящие из лигандов, обладающих специфичностью при взаимодействии с молекулами-мишенями и/или специфическим сродством к молекулам-мишеням и связывающихся с лигандами молекул-меток.
В данном изобретении, лиганды меченого вещества представляют собой молекулы, способные реагировать с антигеном-мишенью, антителом-мишенью или интермедиатором, связывающимся с молекулой-мишенью. С помощью меченых веществ результаты взаимодействия между зондом и мишенью проявляются и измеряются количественно или качественно. В некоторых случаях в систему метки также входят интермедиаторы, система увеличения сигнала и т.п. В качестве системы увеличения сигнала может быть использована система коллоидного золота с добавлением солей серебра для увеличения сигнала, система биотина и/или авидина для увеличения сигнала и т.п. В данном изобретении могут быть использованы следующие методы с мечеными веществами или их комбинации для проявления результатов анализа: метод коллоидного золота с серебром, флуоресцентный метод, хемилюминесцентный метод, электролюминесцентный метод, радиоактивный метод, магнитный метод. В системе метки могут быть использованы разные молекулы-метки, относящиеся к одному методу. Например, флуоресцентные метки с различными длинами волны возбуждения и излучения могут связываться с разными лигандами, с образованием отличающихся между собой меченых веществ.
В данном изобретении, лиганды являются молекулами, обладающими высоким сродством к молекуле-мишени. В примерах данного изобретения в качестве лигандов используются антитело, антиген или анти-антитело.
В данном изобретении, выбор лигандов определяется составом зондов и реакционной способностью лигандов к мишеням. Лиганды обладают специфичностью при взаимодействии с антителом или антигеном и/или специфическим сродством к антителу или антигену. В данном изобретении к специфичному взаимодействию относится взаимодействие антитела с антигеном, а взаимодействие на основании специфического сродства между молекулами основано на механизме аффинного взаимодействия, которое отличается от взаимодействия антитела с антигеном. Например, биотин, авидин, белок А, белок G, псорален и дигоксин обладают специфическим сродством к антителу и/или антигену.
В данном изобретении, к специфическим реакциям между антителом и антигеном относятся не только реакция антитела со своим антигеном, но и реакция с видоспецифичностью или реакция со структурной специфичностью. Реакция с видоспецифичностью представляет собой реакцию антитела с анти-антителами, полученными от разных видов животных, с разными активностями. Реакция со структурной специфичностью представляет собой реакцию антитела с анти-антителами против иммуноглобулинов разных классов или подклассов с разными активностями. Примером специфической реакции между антителом и антигеном является взаимодействие человеческого антигена HCV с антителом против HCV человека. Примером реакции с видоспецифичностью является взаимодействие антитела человека против HBsAg с анти-антителом кролика против антител человека, которое не реагирует с моноклональным антителом мыши против HBsAg. Примером реакции со структурной специфичностью является реакция между анти-антителом против IgG и антителом IgG человека против HBV, которое не реагирует с анти-антителом против IgM человека.
Тест-система биочипа в данном изобретении также характерна комбинациями меченых веществ. Один из следующих вариантов комбинаций меченых веществ используется в данном изобретении:
1) меченые антитела и меченые антигены;
2) меченые анти-антитела со структурными специфичностями;
3) меченые анти-антитела с видоспецифичностями, меченые антитела и/или меченые антигены;
4) меченые анти-антитела со структурными специфичностями, меченые антитела и/или меченые антигены;
5) произвольные сочетания вышеупомянутых комбинаций.
В тест-системе биочипа данного изобретения меченые вещества представляют собой не простой меченый антиген, меченое антитело или меченое анти-антитело, а их комбинации, например комбинация меченых антител и меченых антигенов, комбинация меченых анти-антител с видоспецифичностями, меченых антител и/или меченых антигенов. Выбор конкретных меченых веществ определяется следующими факторами: использованными зондами, методами наблюдения результатов и способностями лигандов к специфической реакции. Примером меченых веществ варианта 1 служит комбинация специфических антигенов HCV, ВИЧ, HTLV и сифилиса, меченных родамином, и специфического антитела против вирусов гепатита, меченного родамином. Примером меченых веществ варианта 2 служит использование анти-антител против IgM и против IgG, меченных родамином. Использование анти-антитела козы против антитела человека и моноклонального антитела мыши против вирусов гепатита, меченных родамином, является примером варианта 3. Использование меченного родамином анти-антитела против IgM с меченным родамином антигеном HBsAg является примером варианта 4.
В данном изобретении, меченые вещества в одной комбинации добавляются отдельно или после частичного или полного смешивания.
Тест-система биочипа в данном изобретении также характерна зондами-антителами и/или зондами-антигенами, иммобилизованными в реакторе.
Зонды-антитела в данной системе могут содержать, в частности, антитело (HBsAb) против HBsAg, как показано в примерах 1, 2, 6, 7 и 8. Зонды-антигены в данной системе могут содержать, в частности, антигены ВИЧ, HCV (вируса гепатита С) и сифилиса, как показано в примерах 1 и 2. Зонды-антигены могут содержать, в частности, HBcAg, HBsAg и HBeAg, и зонды-антитела могут содержать, в частности, HBeAb, как показано в примере 6. Зонды-антигены в данной системе могут содержать, в частности, антигены вируса гепатита С (HCV-Ag) и вируса гепатита G (HGV-Ag), как показано в примере 8. Зонды-антитела в данной системе могут содержать, в частности, антитело против р24 ВИЧ, и зонды-антигены могут содержать, в частности, эпитопы gp160, gp41 и gp36 ВИЧ, как показано в примерах 3 и 4. Зонды-антигены в данной системе могут содержать, в частности, антиген вируса Эпштейна-Барр (EBV-Ag), как показано в примере 5. Зонды-антитела могут содержать, в частности, антитело против хорионического гонадотропина HCG, антитело против карциномы-специфичного антигена СА50, антитело против полисахарида СА242, антитело против специфичного антигена грудной карциномы СА153, антитело против антигена эмбриона карциномы СЕА и антитело против специфичного антигена карциномы яичника СА125.
При использовании данной системы в виде биочипа в данном изобретении, можно проводить анализ на любой вариант из следующих шести комбинаций молекул-мишеней в одном реакторе:
1) комбинация антигенов и антител;
2) комбинация иммуноглобулинов разных классов;
3) комбинация иммуноглобулинов разных подклассов;
4) комбинация антигенов и иммуноглобулинов разных классов и/или смеси иммуноглобулинов разных классов;
5) комбинация антигенов и иммуноглобулинов разных подклассов и/или смеси иммуноглобулинов разных подклассов;
6) произвольные сочетания на основании вышеупомянутых комбинаций.
Данное изобретение также относится к способу анализа биологических образцов при применении данной тест-системы в виде биочипа. Процесс анализа состоит из следующих стадий:
a) нанесение образцов в реактор биологического чипа в тест-системе данного изобретения и проведение реакции;
b) добавление меченых веществ в реактор отдельно, после частичного или после полного смешивания;
c) измерение результатов реакций в реакторе.
Достоинство тест-системы и способа ее применения по данному изобретению заключается в том, что анализ образцов можно проводить одновременно в одном реакторе для разных сочетаний молекул-мишеней, в том числе антител и антигенов, иммуноглобулинов разных классов, иммуноглобулинов разных подклассов и т.п. Таким образом, снижается количество необходимых реакторов и уменьшается время анализа. Поскольку анализ проводится в одном реакторе, результаты от разных мишеней могут сравниваться между собой.
Более подробное описание о данном изобретении следует в сочетании с примерами осуществления. Подложки биологических чипов в примерах были коммерческими продуктами или экспериментальными подложками от французской компании SEDAC.
Пример 1.
Тест-система в виде биологического чипа для скрининга при переливании (1).
В данном примере, тест-система состоит из биочипа для скрининга при переливании, меченых веществ, отрицательного контроля, положительного контроля и промывающих растворов. Тест-система в данном примере используется для анализа на HBsAg, антитела против HCV, ВИЧ1+2 и сифилиса в сыворотке человека.
Комбинации зондов, использованных в данной тест-системе, была выбрана на основании требований закона об анализе крови при переливании. Зонды в данном примере представляли собой сочетание антигенов и антител, которое содержало антитело кролика против HBsAg, антиген-конъюгат HCV, смешанные антигены ВИЧ1+2 и смешанные антигены сифилиса. Каждый зонд с оптимальной концентрацией наносили на подложку в трех точках, при этом образовалась матрица 4×3. После иммобилизации зондов подложку блокировали БСА и высушивали для дальнейшего использования.
В данном примере с целью наблюдения результатов были использованы сандвич-подобный метод с двойными антителами и непрямой метод с помощью меченого специфического антитела и меченого анти-антитела с видоспецифичностью. В качестве специфического лиганда антитела было использовано моноклональное антитело мыши против HBsAg, которое способно образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антителами вместе с антителом кролика против HBsAg (зондом) и HBsAg (мишенью). В качестве лиганда анти-антитела с видоспецифичностью было использовано анти-антитело козы против антител человека, способное взаимодействовать с антителами человека против антигенов HCV, ВИЧ1+2 и сифилиса (мишенями), но не способное реагировать с антителом кролика против HBsAg (зондом) и меченым моноклональным антителом мыши против HBsAg (другим лигандом). После того, как они помечены родамином, меченое антитело и меченое анти-антитело можно использовать отдельно или после их смешивания.
В качестве отрицательного контроля в данном примере была использована сыворотка человека, не содержащая HBsAg, антитела против HCV, ВИЧ1+2 и сифилиса, что было подтверждено методом ELISA. В качестве положительного контроля в данном примере была использована смесь сывороток человека, содержащая HBsAg, антитела против HCV, ВИЧ1+2 и сифилиса, что также было подтверждено методом ELISA.
С помощью данной тест-системы можно проводить анализ HBsAg, антитела против HCV, ВИЧ1+2 и сифилиса в сыворотке человека. Следующие образцы сыворотки были использованы: (1) сыворотка человека, содержащая HBsAg; (2) сыворотка человека, содержащая антитело против HCV; (3) сыворотка человека, содержащая антитела против ВИЧ1+2; (4) сыворотка человека, содержащая антитело против сифилиса; 5) сыворотка человека, содержащая HBsAg и антигены сифилиса; 6) отрицательный контроль; 7) положительный контроль. Каждый образец наносили в соответствующий реактор на заранее изготовленном биочипе после разведения. Реакцию проводили при 37°С в течение 1 часа. После удаления несвязывающихся образцов буфером биочип инкубировали с мечеными веществами при 37°С в течение 1 часа. После удаления несвязывающихся меченых веществ и обработки этанолом высушенный биочип анализировали с помощью сканера (GMS 418 ARRAY SCANNER) и компьютера. Результаты показаны в таблице 2.
Результаты анализа при использовании тест-системы биологического чипа для скрининга при переливании.
«-» обозначают отрицательный результат
Пример 2.
Тест-система в виде биологического чипа для скрининга при переливании (2).
В данном примере тест-система биочипа для скрининга при переливании состоит из биочипа, меченых веществ, отрицательного контроля, положительного контроля и промывающих растворов. Способ изготовления биочипа показан в примере 1.
В данном примере с целью проявления результата были использованы сандвич-подобные методы с двойными антителами и с двойными антигенами с помощью меченого антитела и меченого антигена. В качестве лиганда антитела использовалось моноклональное антитело мыши против HBsAg, способное образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антителами вместе с антителом кролика против HBsAg (зондом) и HBsAg (мишенью). В качестве лиганда антигена были использованы следующие антигены: (1) антиген HCV, который способен образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антигенами вместе с антителом человека против HCV (мишенью) и антигеном HCV (зондом); (2) антигены ВИЧ1+2, которые способны образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антигенами вместе с антителом человека против ВИЧ1+2 (мишенью) и антигеном ВИЧ1+2 (зондом); (3) антиген сифилиса, который способен образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антигенами вместе с антителом человека против сифилиса (мишенью) и антигеном сифилиса (зондом). Меченные родамином вещества можно использовать отдельно или после смешивания.
Контрольные пробы примера 1 были использованы и в данном примере.
Тест-система в данном примере используется для анализа на HBsAg, антитела против HCV, ВИЧ1+2 и сифилиса в сыворотке человека. При использовании тех же образов сывороток человека и того же способа анализа, как в примере 1, получили сходные результаты, как показано в таблице 2.
Пример 3.
Тест-система биологического чипа для анализа антигенов и антител ВИЧ (1).
В данном примере тест-система состоит из биочипа для анализа антигенов и антител ВИЧ, меченых веществ, отрицательного контроли, положительного контроля и промывающих растворов и используется для анализа на антигены и антитела ВИЧ в сыворотке человека.
Комбинация зондов на биочипе состоит из специфического моноклонального антитела мыши против р24 ВИЧ и смешанных антигенов gp160, gp41 и gp36 ВИЧ. Каждый зонд наносили на подложку в трех точках, и при этом образовалась матрица 2×3. Подложку блокировали БСА и высушивали для дальнейшего использования.
В данном примере с целью наблюдения результатов были использованы сандвич-подобные методы с двойными антителами и с двойными антигенами с помощью меченого антитела и меченого антигена. В качестве лиганда антитела было использовано специфическое антитело против р24, которое способно образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антителами вместе с антигеном ВИЧ (мишенью) и антителом против р24 (зондом). В качестве лиганда антигена был использован антиген ВИЧ, который способен образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антигенами вместе с антителом против ВИЧ (мишенью) и смешанными антигенами (зондом). Меченные родамином вещества можно использовать отдельно или после смешивания.
Отрицательный контроль в данном примере был сывороткой, не содержащей антител и антигенов ВИЧ, что было заранее подтверждено методом ELISA. Положительный контроль был сывороткой, содержащей антитела и антигены ВИЧ, что было заранее подтверждено методом ELISA.
С помощью тест-системы биочипа в данном примере можно проводить анализ на антитела и антигены ВИЧ в сыворотке человека. При этом были использованы следующие образцы сыворотки: (1) сыворотка человека, содержащая антиген р24 ВИЧ; (2) сыворотка человека, содержащая антитела против gp160, gp41 и gp36 ВИЧ; (3) сыворотка человека, содержащая антитела и антигены ВИЧ; (4) отрицательный контроль; и 5) положительный контроль. Все образцы были заранее проанализированы методом ELISA. Каждый образец наносили в соответствующий реактор на заранее изготовленном биочипе после разведения. Реакцию проводили при 37°С в течение 1 часа. После удаления несвязывающихся образцов буфером биочип инкубировали с мечеными веществами при 37°С в течение 1 часа. После удаления несвязывающихся меченых веществ и обработки этанолом высушенный биочип анализировали с помощью сканера (GMS 418 ARRAY SCANNER) и компьютера. Результаты показаны в таблице 3.
Результаты анализа при использовании тест-системы биологического чипа для анализа антител и антигенов ВИЧ.
«-» обозначают отрицательный результат.
Пример 4.
Тест-система биологического чипа для анализа антигенов/антител ВИЧ (2).
В данном примере, тест-система состоит из биочипа для анализа антигенов и антител ВИЧ, меченых веществ, отрицательного контроля, положительного контроля и промывающих растворов и используется для анализа на антигены и антитела ВИЧ в сыворотке человека.
Биочип в данном примере был изготовлен таким же образом, как в примере 3.
В данном примере с целью наблюдения результатов были использованы сандвич-подобный метод с двойными антителами и непрямой метод. В качестве лиганда антитела было использовано моноклональное антитело мыши против р24, которое способно образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антителами вместе с моноклональным антителом мыши против р24 (зондом) и антигеном ВИЧ (мишенью). В качестве лиганда анти-антитела было использовано анти-антитело козы против антител человека, которое способно реагировать с антителами человека (мишенями) против ВИЧ, захваченых антигенами ВИЧ (зондами), но не способных взаимодействовать с моноклональными антителами мыши против р24 (зондом и меченым веществом). В качестве метки был использован родамин. Меченые вещества можно использовать отдельно или после смешивания.
Отрицательный контроль, положительный контроль и образцы сыворотки примера 3 были использованы и в данном примере. Анализ проводили по описанию, приведенному в примере 3, и были получены сходные результаты.
Пример 5.
Тест-система биологического чипа для анализа антител и антигенов, связанных с образованием опухоли.
В данном примере тест-система состоит из биочипа для анализа антител и антигенов, связанных с образованием опухоли, меченых веществ, отрицательного контроля, положительного контроля, контроля качества и промывающих растворов. Данная тест-система используется для анализа на антитела и антигены, связанные с образованием опухоли, в сыворотке человека.
Комбинации зондов в данной тест-системе определяются требованиями клинической диагностики опухоли. В данном примере комбинация зондов состоит из синтезированного полипептида-антигена EBV (вируса Эпштейна-Барр) и шести антител, включающих антитело против специфичного антигена карциномы СА50, антитело против полисахарида СА242, антитело против специфичного антигена грудной карциномы СА153, антитело против специфичного антигена карциномы яичника СА125, антитело против антигена эмбриона карциномы СЕА и антитело против трофического гормона HCG. Каждый зонд наносили на подложку с оптимальной концентрацией в трех точках, с образованием матрицы 7×3. Подложку блокировали БСА и высушивали для дальнейшего использования.
В данном примере с целью наблюдения результатов были использованы сандвич-подобный метод с двойными антителами и непрямой метод с помощью меченых специфических антител и меченого анти-антитела с видоспецифичностью. В качестве лигандов антител были использованы шесть типов моноклональных антител мыши против HCG, СА50, СА242, СА153, СЕА и СА125, которые способны образовывать сандвич-подобные структуры с двойными антителами вместе с соответствующими антигенами (мишенями) и антителами (зондами). В качестве лиганда анти-антитела с видоспецифичностью было использовано анти-антитело козы против IgA человека, которое способно реагировать с антителом (мишенью) против EBV, связывающимся с антигеном EBV (зондом). В качестве метки был использован родамин. Меченые вещества можно использовать отдельно или после смешивания.
Отрицательный контроль в данной системе был сывороткой человека, не содержащей мишени к зондам, что подтверждено методом ELISA. При этом в отдельных лунках был зафиксирован один из следующих зондов: антиген синтезированного полипептида EBV, антитело против специфичного антигена карциномы СА50, антитело против полисахарида СА242, антитело против специфичного антигена грудной карциномы СА153, антитело против специфичного антигена карциномы яичника СА125, антитело против антигена эмбриона карциномы СЕА и антитело против HCGB. В качестве контроля качества были использованы мишени к зондам в определенных количествах.
С помощью данной тест-системы можно проводить количественный анализ разных молекул, связанных с образованием опухоли, в одном реакторе и одновременно.
Пример 6.
Тест-система биологического чипа для анализа вируса гепатита В.
В данном примере, тест-система состоит из биочипа для анализа антител и антигенов вируса гепатита В (HBV), меченых веществ, отрицательного контроля, положительного контроля и промывающих растворов. Тест-система используется для анализа антител и антигенов, связанных с HBV, в сыворотке человека.
Комбинация зондов, использованная в данном примере, была выбрана по требованию клинической диагностики и доступности антигенов и антител, связанных с HBV. Зонды в данном примере представляли собой сочетание антигенов и антител, которое содержало 2 типа антител и 3 типа антигенов. Зонды-антитела содержали очищенное моноклональное антитело мыши против HBsAg и очищенное моноклональное антитело мыши против человеческого антитела к антигену е вируса гепатита В (HBeAb). Зонды-антигены содержали очищенные HBsAg, HBcAg и HBeAg. Каждый зонд с оптимальной концентрацией наносили на подложку в трех точках, при этом образовалась матрица 5×3. Подложку блокировали БСА и высушивали для дальнейшего использования.
Тест-система в данном примере может использоваться для анализа на антиген HBsAg, антиген HBeAg, иммуноглобулины IgG и IgM антитела HBsAb, иммуноглобулины IgG и IgM антитела HBeAb и иммуноглобулины IgG и IgM антитела HBcAb в сыворотке человека.
В данном примере с целью наблюдения результатов были использованы сандвич-подобный метод с двойными антителами и непрямой метод. В качестве меченых веществ было использовано сочетание следующих молекул: (1) очищенного моноклонального антитела мыши против антигена HBsAg и очищенного моноклонального антитела мыши против HBeAb, которые способны образовывать сандвич-подобные структуры с двойными антителами вместе с соответствующими зондами-антителами и мишенями-антигенами; (2) анти-антитела козы против IgG человека и анти-антитела козы против IgM человека, которые способны реагировать с иммуноглобулинами IgG и IgM человека, связывающимися с зондом-антигеном, но не способны реагировать с зондом-антителом и остальными мечеными веществами. Разные метки были использованы в данной системе, анти-антитело козы против IgM человека было помечено Су5 (длина волны возбуждения составляет 649 нм, длина волны излучения составляет 670 нм), а остальные лиганды были помечены родамином (длина волны возбуждения составляет 546 нм, длина волны излучения составляет 575 нм). Меченые вещества можно использовать отдельно или после смешивания.
В качестве отрицательного контроля в данном примере использовалась сыворотка человека, которая не способна реагировать с зондами на биочипе, что подтверждено методом ELISA. В качестве положительного контроля в данном примере была использована смесь сывороток человека, которая способна реагировать с зондами, что также было подтверждено методом ELISA.
Следующие образцы были использованы в данном примере:
1) сыворотка с антигеном HBsAg;
2) сыворотка с антигеном HBeAg;
3) сыворотка с иммуноглобулином IgG HBsAb;
4) сыворотка с иммуноглобулином IgM HBsAb;
5) сыворотка с иммуноглобулином IgG HBeAb;
6) сыворотка с иммуноглобулином IgM HBeAb;
7) сыворотка с иммуноглобулином IgG HBcAb;
8) сыворотка с иммуноглобулином IgM HBcAb.
Все образцы были подтверждены с помощью метода ELISA. Каждый образец добавляли в соответствующий реактор на заранее изготовленном биочипе и реакцию проводили в течение 1 часа при 37°С. После удаления избытка меченых веществ буфером и обработки этанолом результаты регистрировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе (GMS 418 ARRAY SCANNER). При этом для анализа на антигены HBsAg и HBeAg, иммуноглобулины IgG HBsAb, HBeAb и HBcAb сканирование выполнили при длине волны возбуждения 540 нм. В то же время, для анализа на иммуноглобулины IgM HBsAb, HBeAb и HBcAb сканирование осуществляли при длине волны возбуждения 650 нм. Результаты показаны в таблице 4.
Результаты анализа сывороток человека при использовании тест-системы биологического чипа для анализа на вирус гепатита В.
Пример 7.
Тест-система биологического чипа для анализа антител и антигенов вируса гепатита В и вируса гепатита С.
В данном примере, тест-система состоит из биочипа для анализа антител и антигенов вирусов гепатита В и гепатита С, меченых веществ и буферных растворов. Выбор зондов на биочипе определяется требованиями конкретного анализа и доступностью антител и антигенов. В данном примере использовали антитело кролика против HBsAg и антиген-конъюгат вируса гепатита С (HCV) в качестве зондов для анализа на HBsAg и антитела вируса гепатита С в сыворотке человека. Каждый зонд с оптимальной концентрацией наносили на подложку в трех точках, при этом образовалась матрица 2×3. После иммобилизации зондов подложку блокировали БСА и высушивали для дальнейшего использования.
В данном примере с целью наблюдения результатов были использованы непрямой метод и сандвич-подобный метод с двойными антителами. Меченые вещества в данном примере были моноклональным антителом мыши против HBsAg, которое способно образовывать сандвич-подобную структуру вместе с HBsAg (мишенью), связывающимся с моноклональными антителом (зондом) мыши против HBsAg, и анти-антителом козы против антитела человека, которое способно реагировать с антителом против вируса гепатита С, связывающимся с зондом-антигеном. Эти вещества были помечены родамином. В состав данной тест-системы также входили отрицательный и положительный контроли и буферные растворы.
Пример 8.
Тест-система биологического чипа для анализа антигенов и антител вируса гепатита.
Тест-система в данном примере состоит из биочипа, меченых веществ, отрицательного контроля, положительного контроля и промывающих растворов и используется для анализа антител и антигенов, связанных с разными вирусами гепатита. Выбор зондов на биочипе определяется требованиями диагностики и доступностью антител и антигенов, связанных с гепатитами. В данном примере были использованы очищенное моноклональное антитело кролика против HBsAg в качестве зонда-антитела, и антиген вируса гепатита А, и антигены-конъюгаты вируса гепатита С, вируса гепатита D, вируса гепатита Е и вируса гепатита G в качестве зондов-антигенов. Каждый зонд с оптимальной концентрацией был зафиксирован на подложке в трех точках, с образованием матрицы 6×3. После иммобилизации зондов подложку блокировали БСА и высушивали для дальнейшего использования.
В данном примере с целью проявления результатов были использованы непрямой метод и сандвич-подобный метод с двойными антителами. В качестве меченых веществ использовали моноклональное антитело мыши против HBsAg, которое способно образовывать сандвич-подобную структуру с двойными антителами вместе с антителом-зондом и антигеном (мишенью), и анти-антитело козы против антитела человека, которое способно реагировать с антителами (мишенями), связывающимися с зондами-антигенами (HAV-Ag, HCV-Ag, HDV-Ag, HGV-Ag и HEV-Ag), но не способно реагировать с зондом-антителом кролика и меченым антителом мыши. Метка в данной системе была родамином с длиной волны возбуждения 546 нм и с длиной волны излучения 575 нм. Меченые вещества можно использовать отдельно или после частичного или полного смешивания. В состав данной системы также входили отрицательный и положительный контроли и буферные растворы.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| НАНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТОВ | 2004 |
|
RU2315999C2 |
| ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В | 2006 |
|
RU2325655C9 |
| СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЕ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | 2006 |
|
RU2338199C2 |
| Способ оценки уровня антител, специфичных к различным вариантам HBsAg вируса гепатита В | 2016 |
|
RU2616236C1 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ И ОПУХОЛЕЙ | 2007 |
|
RU2540490C2 |
| СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЯДЕРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА С | 1997 |
|
RU2133622C1 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ И ОПУХОЛЕЙ | 2007 |
|
RU2478400C2 |
| ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЯДЕРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА С КЛАССА IGM | 1997 |
|
RU2142134C1 |
| ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К HBs-АНТИГЕНУ И БЛОКАТОР В ТЕСТ-СИСТЕМЕ | 2001 |
|
RU2206095C1 |
| СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО МИКРООРГАНИЗМА | 2003 |
|
RU2300769C2 |
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к вирусологии, биотехнологии, иммунологии, и может быть использовано для определения наличия конкретных компонентов в различных биологических образцах. Сущность изобретения состоит в том, что для анализа биологических образцов используется тест-система в виде биологического чипа, состоящая из не менее одного биочипа, содержащего не менее одного реактора, внутри которого иммобилизованы молекулы-зонды, обладающие структуроспецифичностью или видоспецифичностью к лигандам, по определенному порядку в виде матрицы зондов и/или схемы расположения зондов. При этом указанные лиганды обладают специфичной активностью в реакции антиген/антитело или специфическим сродством к антигену и/или антителу и не вступают в реакцию с антителом-зондом/антигеном-зондом, при этом снижается вероятность перекрестных реакций. Изобретение также относится к способу анализа биологических образцов с использованием вышеупомянутой тест-системы. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 табл.
(a) комбинация меченых специфических антител и меченых специфических антигенов;
(b) комбинация меченых различных структуроспецифичных анти-антител;
(c) комбинация меченых видоспецифичных анти-антител и меченых специфичных антител и/или меченых специфичных антигенов;
(d) комбинация меченых структуроспецифичных анти-антител и меченых специфичных антител и/или меченых специфичных антигенов;
(е) произвольные сочетания вышеупомянутых вариантов;
и где указанные лиганды обладают специфичной активностью в реакции антиген/антитело или специфическом сродством к антигену и/или антителу и не вступают в реакцию с антителом-зондом/антигеном-зондом, при этом снижается вероятность перекрестных реакций.
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| US 5763158 А, 06.09.1998 | |||
| ИММУНОДИАГНОСТИКУМ И СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОАНАЛИЗА НА ЕГО ОСНОВЕ | 1992 |
|
RU2092853C1 |
