СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ СТАФИЛОКОККОВОЙ МИКРОФЛОРЫ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ НОСА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека на нормальную стафилококковую микрофлору и стафилококковую микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, с целью профилактики и проведения эффективных мероприятий по снижению уровня заболеваемости органов дыхания.

Одной из ведущих причин развития патологического процесса в респираторном тракте человека является бактериальный фактор [Пальчун В.Т., Полякова Т.С., Романова О.Н. Лечебно-диагностические подходы к проблеме хронического тонзиллита. // Вестник оториноларингологии. - 2001. - №1. - С.4-5; Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б. и др. Связь биологических свойств стафилококков с течением гнойных синуситов. // Вестник оториноларингологии. - 1998. - №5. - С.35].

Условно-патогенные микроорганизмы - представители нормальной микрофлоры тела человека могут являться этиологическими агентами гнойно-септических заболеваний [Хохолявина P.M., Мефодьев В.В., Козлов Л.Б. Этиология возбудителей гнойно-септических заболеваний и их антибиотикорезистентность. // Научный вестник ТМА. - 2000. - №1. - С.79-80].

По данным ряда авторов [Чернова О.Л., Матюшина С.Б., Иванов Ю.Б., Райцелис И.В. Роль факторов персистенции Staphylococcus epidermidis в инфекционном процессе. // ЖМЭИ. - 1997. - №4. - С-83; Дерябин Д.Г. Стафилококки. Экология и патогенность. - Екатеринбург, 2000. - С.148-149; Пискунов С.З., Пискунов З.Г., Ельков И.В. Проблема общего и местного консервативного лечения острого и хронического гайморита. // Российская ринология. - 1994. - №1. - С.7] очень часто микробным агентом, способствующим развитию гнойно-воспалительного процесса в полости носа и околоносовых пазух, являются именно микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору тела человека.

Одними из основных представителей нормальной микрофлоры слизистой оболочки носа человека являются стафилококки [Усвяцов Б.Я., Паршута Л.И., Бухарин О.В. Характеристика микробного биоценоза слизистой оболочки носа у здоровых людей и бактерионосителей. // ЖМЭИ. - 2000. - №5. - С.65-66], которые считаются наиболее распространенными возбудителями заболеваний околоносовых пазух человека [Карташова О.Л., Боклин А.К., Киргизова С.Б., Пашкова Т.М. Характеристика микрофлоры, выделенной при хронических и острых гнойных синуситах. // Журн. ″Современные наукоемкие технологии″. - №2. - 2005. - С.36-37; Пискунов С.З., Пискунов З.Г., Ельков И.В. Проблема общего и местного консервативного лечения острого и хронического гайморита. // Российская ринология. - 1994. - №1. - С.7; Райцелис И.В. Клиническое значение биологических свойств микроорганизмов для прогнозирования течения и лечения больных гнойным гайморитом. Автор, дис. ... канд. мед. наук. - Оренбург, 2000. - С.10].

Показана этиологическая роль стафилококка, персистирующего на слизистой оболочке носовых ходов, в возникновении и развитии фурункулеза носа [Шульга И.В. Фурункул носа: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. - Самара, 1996]. Выявлена видовая идентичность стафилококков - возбудителей гнойного гайморита и стафилококков, вегетирующих на слизистой оболочке переднего отдела носа больных, что подтверждается анализом фагоантибиотикотипов изученных культур и свидетельствует об их этиологической роли в данной патологии [Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б. и др. Связь биологических свойств стафилококков с течением гнойных синуситов. // Вестник оториноларингологии. - 1998. - №5. - С.35].

Рост инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, диктует необходимость поиска новых способов дифференциации нормальной микрофлоры от этиологических агентов, способных вызывать развитие патологических процессов [Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: ″Медицина″. - 1999. - С.185].

Известен способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека, основанный на определении способности выделенных микроорганизмов к инактивации бактерицидного фактора - антимикробного белка тромбоцитов [Иванов Ю.Б., Черкасов С.В., Кузьмин М.Д., Бухарин О.В. Способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека. Патент РФ №22600054].

Однако указанный способ предназначен лишь для дифференциации микрофлоры только из урогенитального тракта и не может быть использован для дифференциации микроорганизмов из других экологических ниш.

Известен способ дифференциации микрофлоры слизистой оболочки миндалин в норме и при хроническом тонзиллите, основанный на определении у штаммов, выделенных со слизистой оболочки миндалин, двух и более факторов патогеннности одновременно [Хуснутдинова Л.М. Межбактериальные взаимодействия на слизистой оболочке миндалин человека. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Оренбург, 2004. - С.8-11]. Однако данный способ позволяет диагностировать только микроорганизмы, выделенные со слизистой оболочки миндалин. Кроме того, известно, что представители нормальной микрофлоры также могут обладать факторами патогенности, что может затруднить дифференциацию микрофлоры [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство. - Екатеринбург, 1996. - С.54-56; 79-81].

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанный на способности микроорганизмов к инактивации лизоцима [Чернова О.Л. Антилизоцимная активность стафилококков, выделенных при бактерионосительстве. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Челябинск, 1998. - С.8]. При изучении антилизоцимной активности у выделенных со слизистой оболочки носа стафилококков было установлено, что этот признак чаще встречался у штаммов, изолированных от резидентных бактерионосителей S.epidermidis и S.aureus.

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков:

1. Позволяет дифференцировать нормальную стафилококковую микрофлору слизистой оболочки носа только на резидентную (постоянную) и транзиторную (временную) и не решает вопрос: могут ли представители нормальной стафилококковой микрофлоры вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, что очень важно для проведения эффективной профилактики, направленной на снижение уровня заболеваемости органов дыхания.

2. Дифференциация стафилококковой микрофлоры по наличию и уровню антилизоцимной активности проводится только для S.epidermidis и S.aureus, что сужает область применения способа, так как за чертой диагностической неопределенности остаются другие виды стафилококков, которые могут вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний.

Заявляемый способ направлен на достижение технического результата, заключающегося в повышении эффективности дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, что способствует улучшению диагностических и лечебных мероприятий.

Для достижения указанного технического результата в предлагаемом способе дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, включающем забор исследуемого материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур стафилококков, определение способности выделенных микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов, в качестве бактерицидного фактора используют карнозин и к нормальной микрофлоре слизистой оболочки носа человека относят S.aureus, не обладающий способностью к инактивации карнозина (антикарнозиновой активностью - АКрА), и все другие виды стафилококков, обладающие АКрА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,7 мкг/мл, а к микрофлоре, способной вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, относят S.aureus с уровнем выраженности АКрА больше нуля и все другие виды стафилококков с уровнем выраженности данного признака больше 0,7 мкг/мл.

Новым в заявляемом способе является то, что у выделенных со слизистой оболочки носа человека чистых культур стафилококков определяют антикарнозиновую активность (АКрА) и к нормальной микрофлоре слизистой оболочки носа человека относят S.aureus, не обладающий способностью к инактивации карнозина (антикарнозиновой активностью - АКрА), и все другие виды стафилококков, обладающие АКрА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,7 мкг/мл, а к микрофлоре, способной вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, относят S.aureus с уровнем выраженности АКрА больше нуля и все другие виды стафилококков с уровнем выраженности данного признака больше 0,7 мкг/мл.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что заявляемый способ позволяет дифференцировать стафилококковую микрофлору слизистой оболочки носа человека на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, что способствует проведению своевременных и эффективных мероприятий по снижению заболеваемости органов дыхания.

Известно, что природный дипептид карнозин (карнозин) обладает антимикробным [Antibacterial actions of carnosine and homocarnosine. French Patent №71.07856 of march 1, 1971] и противоаллергическим действием [Шарпань Ю.В. Влияние карнозина на иммуносупресивный эффект гистамина. /Бюлл. экспер. биологии и медицины. - 1984. - №11. - С.603].

Наибольшее количество карнозина содержится в обонятельном эпителии слизистой оболочки передних отделов носовых ходов [Margolis F.L. Carnosine in the primary of olfactory pathway. // Science. - 1974. - V.184. - P.909-911]. Известно, что микроорганизмы, длительно удерживающиеся в эпителиальных клетках слизистой оболочки носа, могут инактивировать карнозин [Бухарин О.В., Стадников А.А., Чернова О.Л. и др. Биологическое значение антикарнозиновой активности бактерий. // ЖМЭИ. - 2000. - №4. - С.57-58]. Известен способ количественного определения способности микроорганизмов инактивировать карнозин [Патент РФ №2132879].

Известно определение способности микроорганизмов к инактивации карнозина (антикарнозиновой активности) в клинике при лечении отграниченных гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры стафилококковой этиологии [Патент РФ №2192880].

Авторами экспериментально установлена информативность определения наличия и уровня выраженности антикарнозиновой активности у разных видов стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа человека, для дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний.

Исследование было проведено на 157 чистых культурах разных видов стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа здоровых лиц; на 141 чистой культуре разных видов стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа больных гнойно-воспалительными заболеваниями носовых пазух и полости носа; на 283 чистых культурах различных видов стафилококков, выделенных из очага воспаления больных гнойно-воспалительными заболеваниями носовых пазух и полости носа.

Исследуемый материал (отделяемое слизистой оболочки носа здоровых и больных гнойно-воспалительными заболеваниями носовых пазух и полости носа, также гнойное отделяемое из очага воспаления больных гнойно-воспалительными заболеваниями носовых пазух и полости носа) засевали на чашки с желточно-солевым агаром. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов. Выросшие колонии пересевали на скошенный агар и изучали морфологию при окраске мазков по Граму. Чистую культуру идентифицировали до вида с использованием биохимических тестов фирмы ″Lachema″ (Чехия). У всех выделенных стафилококков определяли антикарнозиновую активность известным способом [Патент РФ №2132879].

Результаты исследований представлены на таблице.

Как видно из таблицы, у стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа здоровых лиц, антикарнозиновая активность отсутствует у S.aureus и присутствует у других видов стафилококков в 13%-69,2% случаев с уровнем выраженности от 0,02 до 0,7 мкг/мл. В то же время все виды стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа у лиц, имеющих гнойно-воспалительные заболевания (гайморит, ринит, карбункулез), характеризовались наличием признака в 73,3%-100% случаев с уровнем выраженности от 0,72 до 3,0 мкг/мл. Одновременно, из гнойного отделяемого были изолированы возбудители гнойно-воспалительного процесса, которые были представлены стафилококками того же вида, что и выделенные со слизистой оболочки носа больных. Возбудители гнойно-воспалительного процесса обладали в 100% случаев антикарнозиновой активностью с уровнем выраженности от 0,71 до 3,0 мкг/мл.

Таким образом, проведенные исследования показали, что все представители S.aureus, выделенные со слизистой оболочки носа здоровых лиц, не обладали способностью к инактивации карнозина, тогда как S.aureus, изолированные со слизистой оболочки носа от больных, в 100% случаев имели данный признак так же, как и возбудители гнойно-воспалительных заболеваний, выделенные из очага воспаления. При изучении других видов стафилококков была обнаружена следующая закономерность в способности к инактивации карнозина: от больных лиц были выделены одни и те же виды стафилококков как со слизистой оболочки носовой полости, так и из отделяемого гнойного очага, при этом они обладали уровнем выраженности данного признака более 0,71 мкг/мл.

Проведенные авторами исследования показали информативность определения наличия и уровня выраженности АКрА у стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа человека, для дифференциации их на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний.

Предложенный способ дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека был испытан в лоротделении 1-ой городской клинической больницы г.Оренбурга. Эффективность дифференциации, проведенной в соответствии с заявляемым способом, составила 95,0%.

Способ осуществляется следующим способом:

1. Исследуемый материал (мазок со слизистой оболочки носовой полости) засевают на чашки с желточно-солевым агаром.

2. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов.

3. Выросшие колонии пересевают на скошенный агар и изучают морфологию при окраске мазков по Граму.

4. Чистую культуру стафилококков идентифицируют до вида с использование биохимических тестов фирмы ″Lachema″ (Чехия).

5. У всех выделенных стафилококков определяют антикарнозиновую активность известным способом [Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б. Способ определения антикарнозиновой активности микроорганизмов. Патент РФ №2132879].

6. К нормальной микрофлоре слизистой оболочки носа человека относят S.aureus, не обладающие способностью к инактивации карнозина (антикарнозиновой активностью - АКрА), и все другие виды стафилококков, обладающие АКрА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,7 мкг/мл, а к микрофлоре, способной вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, относят S.aureus с уровнем выраженности АКрА больше нуля и все другие виды стафилококков с уровнем выраженности данного признака больше 0,7 мкг/мл.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. У обследуемого ребенка А., часто и длительно болеющего респираторными заболеваниями, был взят ватным тампоном мазок со слизистой оболочки носа и засеян на желточно-солевой агар. Посев инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов. Выросшие колонии пересевали на скошенный агар и изучали их морфологию при окраске мазков по Граму. По совокупности морфологических (кокки, расположенные гроздьями) и тинкториальных (положительные при окраске по Граму) свойств отнесли данный штамм к представителям рода Staphylococcus. Затем чистую культуру идентифицировали до вида с использованием биохимических тестов фирмы ″Lachema″ (Чехия) и определили как Staphylococcus aureus. На следующем этапе работы у выделенного стафилококка определяли антикарнозиновую активность.

На основании полученных результатов о наличии у S.aureus антикарнозиновой активности с уровнем выраженности 2,0 мкг/мл был сделан вывод, что выделенный со слизистой оболочки носа стафилококк может стать возбудителем и вызвать развитие местного гнойно-воспалительного процесса в полости носа у обследуемого ребенка. В отношении ребенка А. были проведены профилактические мероприятия - санирование полости носа. После курса санации было проведено повторное обследование на наличие S.aureus - результат отрицательный.

Дальнейшее наблюдение за пациентом показало правильность проведенной дифференциации с помощью заявляемого способа и позволило констатировать эффективность профилактических мероприятий по снижению заболеваемости органов дыхания у часто и длительно болеющего ребенка.

Пример 2. На медицинском осмотре с целью профилактики заболеваний органов дыхания у группы обследуемых лиц (10 человек) были взяты мазки со слизистой оболочки носа. Бактериологическое исследование проведено согласно примеру 1. При анализе полученных результатов с помощью заявляемого способа оказалось, что у 4 человек со слизистой оболочки носа были выделены штаммы S.epidermidis, не имеющие антикарнозиновой активности. Согласно заявляемому способу был сделан вывод о том, что данную микрофлору можно отнести к нормальной, не вызывающей развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний в носовой полости.

От 2 обследуемых лиц были высеяны штаммы S.aureus с антикарнозиновой активностью, а у 4 человек обнаружили представителей вида S.epidermidis, обладающих уровнем антикарнозиновой активности выше 2,3 мкг/мл. Согласно предлагаемому способу был сделан вывод о том, что данная микрофлора способна вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний в носовой полости. Таким образом, 6 обследуемым пациентам была назначена санация слизистой оболочки носа с целью профилактики заболеваемости органов дыхания. Дальнейшее наблюдение за пациентами подтвердило правильность проведенных профилактических мероприятий.

Пример 3. После проведенного лечения хронической формы гайморита у пациента С. провели бактериологическое исследование слизистой оболочки носа согласно примеру 1. У обследуемого был выделен S.capitis с антикарнозиновой активностью 3,0 мкг/мл. Согласно предлагаемому способу был сделан вывод о том, что выделенный стафилококк способен вызвать развитие местного гнойно-воспалительного заболевания в носовой полости.

Было проведено санирование носовой полости больного. В период наблюдения (12 месяцев) не было отмечено обострения хронического процесса, что позволило сделать заключение об эффективности проведенных профилактических мер.

Предлагаемый способ позволяет дифференцировать стафилококковую микрофлору слизистой оболочки носа человека на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, с целью профилактики и проведения эффективных мероприятий по снижению уровня заболеваемости органов дыхания.

ТаблицаНаличие и уровень выраженности антикарнозиновой активности у стафилококков - возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний и стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа здоровых и больных гнойно-воспалительными заболеваниями людей.Вид стафилококкаИсточник выделения стафилококка (n-количество штаммов)Наличие и выраженность АКрА (мкг/мл)Наличие активностиНаименьшее значениеНаибольшее значениеS.aureus1. Слизистая оболочка носа здоровых лиц (n=15)0--2. Слизистая оболочка носа больных гайморитом (n=35)1002,313,03. Очаг воспаления у больных гайморитом (n=35)1001,293,04. Слизистая оболочка носа больных ринитом (n=26)88,41,112,585. Очаг воспаления у больных ринитом (n=26)1000,722,276. Слизистая оболочка носа больных карбункулезом (n=45)85,71,913,07. Карбункул (n=45)1000,863.0S.epidermidis1. Слизистая оболочка носа здоровых лиц (n=65)69,20,110,532. Слизистая оболочка носа больных гайморитом (n=55)1000,913,03. Очаг воспаления у больного гайморитом (n=55)1000,711,53S.capitis1. Слизистая оболочка носа здоровых лиц (n=20)50,00,110,432. Слизистая оболочка носа больных гайморитом (n=15)73,30,722,433. Очаг воспаления у больных гайморитом (n=15)1000,622,67S.hominis1. Слизистая оболочка носа здоровых лиц (n=23)13,00,100,152. Слизистая оболочка носа больных гайморитом (n=11)90,91,973,03. Очаг воспаления у больных гайморитом (n=11)1000,622,11S.haemolyticus1. Слизистая оболочка носа здоровых лиц (n=15)66,70,050,72. Слизистая оболочка носа больных гайморитом (n=16)93,80,981,943. Очаг воспаления у больных гайморитом (n=16)1000,422,11S.warneri1. Слизистая оболочка носа здоровых лиц (n=19)47.30,020,352. Слизистая оболочка носа больных гайморитом (n=9)1000,892,623. Очаг воспаления у больных гайморитом (n=9)1000,652,89

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека на нормальную стафилококковую микрофлору и стафилококковую микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний. Из микрофлоры слизистой оболочки носа выделяют чистые культуры стафилококков, их идентифицируют и у чистой культуры определяют способность к инактивации природного дипептида карнозина. К нормальной микрофлоре слизистой оболочки носа человека относят S.aureus, не обладающий способностью к инактивации карнозина (антикарнозиновой активностью - АКрА), и все другие виды стафилококков, обладающих АКрА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,7 мкг/мл. К микрофлоре, способной вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, относят S.aureus с уровнем выраженности АКрА больше нуля и все другие виды стафилококков с уровнем выраженности данного признака больше 0,7 мкг/мл. Изобретение обеспечивает информативность определения наличия и уровня выраженности АКрА у стафилококков. 1 табл.

Способ дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, включающий забор исследуемого материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур стафилококков, определение способности выделенных микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов, отличающийся тем, что в качестве бактерицидного фактора используют природный дипептид карнозин и к нормальной микрофлоре слизистой оболочки носа человека относят S.aureus, не обладающий способностью к инактивации карнозина (антикарнозиновой активностью - АКрА) и все другие виды стафилококков, обладающие АКрА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,7 мкг/мл, а к микрофлоре, способной вызвать развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, относят S.aureus с уровнем выраженности АКрА больше нуля и все другие виды стафилококков с уровнем выраженности данного признака больше 0,7 мкг/мл.