ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВ С ПЕРСИСТЕНТНЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/14 C12N1/20 C12Q1/14 C12R1/44 

Изобретение относится к микробиологии и касается бактериологических исследований, может быть использовано для выявления в исследуемом материале стафилококков с персистентными характеристиками.

Феномен персистенции стафилококков используется в клинике для решения вопросов лечения и дифференциальной диагностики заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, а также с целью прогнозирования течения и рациональной терапии заболеваний [1]
Ранее установлено широкое распространение антилизоцимной активности (АЛА) у штаммов стафилококков, выделенных из бактерионосителей [2] Персистирование микробной клетки в организме обеспечивает кроме антилизоцимной активности, антиинтерфероновый признак (АИА), характеризующий способность бактерий инактивировать бактерицидный компонент человеческого лейкоцитарного интерферона [3] а также антикомплементарная активность (АКА) [4]
Известны питательные среды, используемые для выявления и дифференциации стафилококков: мясопептонный агар, содержащий 7,2% хлорида натрия и 5% отмытых эритроцитов барана; мясопептонный агар, содержащий эритроциты и полимиксин М сульфат; ДНК-новокаиновый агар [5] мясопептонный агар, содержащий 6,5% хлорида натрия и 10% стерильного молока [6]
Однако, ни одна из них не дает возможности избирательно выделять стафилококки, обладающие персистентными характеристиками.

Наиболее близкой к предлагаемой среде по совокупности существенных признаков и назначению является питательная среда Чистовича, содержащая мясопептонный агар (pH 7,2-7,4), 10% хлорида натрия и 15% стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 100-200 мл стерильного физиологического раствора) [7]
Однако, известная среда не обеспечивает возможности выявления штаммов стафилококков, обладающих персистентными характеристиками.

Изобретение решает задачу выявления стафилококков, обладающих персистентными характеристиками, в исследуемом материале.

Для решения указанной задачи предлагаемая питательная среда для выделения стафилококков с персистентными характеристиками, содержащая мясопептонный агар, хлорид натрия, желточную взвесь, дополнительно содержит антибиотик фузидин при следующем соотношении компонентов, г/л:
Хлористый натрий 65 100
Желточная взвесь 100 200
Фузидин 0,00015 0,0003
МПА до 1 л
Новым в предлагаемой питательной среде для выделения стафилококков с персистентными характеристиками является то, что она содержит антибиотик фузидин в количестве 0,00015 0,0003 г/л. Это отличает предлагаемое техническое решение от прототипа.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что новая питательная среда позволяет выявлять штаммы стафилококков, обладающих персистентными характеристиками, что дает возможность своевременно диагностировать резидентных бактерионосителей, а также прогнозировать течение и рациональную терапию гнойно-воспалительных заболеваний человека и животных.

Фузидин-натрий-натриевая соль фузидиевой кислоты представляет собой белое вещество, хорошо растворимое в воде. Химически напоминает стероидные гормоны, холестерин, сердечные гликозиды. Выпускается в таблетках по 0,125 г и по 0,25 г Пензенским комбинатом медицинских препаратов "Биосинтез". Препараты фузидиевой кислоты высокоактивны в отношении патогенных штаммов стафилококка, включая и пенициллино-метициллино и множественно-устойчивые. Препараты особенно показаны при тяжелых стафилококковых инфекциях. Известно их применение при сепсисе, пневмонии, остеомиелите, гнойном перитоните и других гнойных процессах, хирургических инфекциях, лактационном мастите, отите, различных формах пиодермии, фурункулезе [8]
Экспериментально установлено, что добавление в состав агара Чистовича антибиотика фузидина в количестве 0,00015 0,0003 г/л способствует избирательному росту стафилококков.

Теоретической предпосылкой для разработки предлагаемой среды послужили обнаруженные различия в действии антибиотиков на стафилококки, обладающие и не обладающие персистентными характеристиками.

Данные представлены в табл. 1
Как видно из табл. 1, фузидин подавляет рост практически всех стафилококков, не обладающих персистентными характеристиками, в то время, как штаммы, обладающие персистентными характеристиками устойчивы к данному антибиотику в 95-100% Экспериментально показано индифферентное действие фузидина на персистентные характеристики стафилококков [9,10]
Что касается других антибиотиков, представленных в табл. 1, то в их присутствии растет достаточно большое число штаммов, имеющих персистентные характеристики, тем не менее, наличие определенного процента культур (от 10 до 50), не активных по исследуемых признакам и устойчивых к этим препаратам, делает неприемлемым их использование с целью селективного выделения персистентных штаммов.

Таким образом, установлена возможность использования фузидина в качестве селективного компонента для выявления штаммов стафилококков с персистентными характеристиками.

Нижний и верхний пределы содержания фузидина в предлагаемой питательной среде установлены экспериментально.

Питательную среду готовят следующим образом.

К 850 мл расплавленного МПА добавляют 85 г NaCl. Затем среду стерилизуют и остужают до 50^o, прибавляют 150 г желточной взвеси (желток асептически извлекают из яйца, взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Перед заливкой чашек Петри, во флакон добавляют 2,0•10^-4г антибиотика фузидина. Все тщательно перемешивают, готовую среду разливают в стерильные чашки и оставляют до полного застывания. Чашки со средой подсушивают в термостате при 37^o в течение 10 минут, после чего она готова для использования.

Пример 1. К 850 мл расплавленного МПА добавляют 85 г NaCl. Затем среду стерилизуют и остужают до 50^o, прибавляют 150 г желточной взвеси (желток асептически извлекают из яйца, взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Перед заливкой чашек Петри, во флакон добавляют 2,0•10^-4г антибиотика фузидина. Все тщательно перемешивают, готовую среду разливают в стерильные чашки и оставляют до полного застывания. Чашки со средой подсушивают в термостате при температуре 37^o в течение 10 мин. На поверхность среды засевают исследуемый материал (клетки эпителия слизистой носа). Результаты учитывают через 24 часа инкубации в термостате при 37^o. На питательной среде выросло 950 колоний, у которых (100%) при дальнейшем исследовании были обнаружены персистентные характеристики (АЛА, АИА, АКА). Персистентные характеристики определяли известными способами [3,4,11]
Пример 2. Готовили среду аналогично примеру 1, со следующими соотношениями компонентов, г/л (см. среда 1 табл.2):
NaCl 100
Желточная взвесь 100
Фузидин 0,5•10^-4г
МПА 900
На поверхность среды засевали исследуемый материал молоко коровы с субклинической формой мастита. Учет результатов проводили аналогично примеру 1. Из 500 выросших культур 54% обладали персистентными характеристиками и 46% их не имели.

Готовили еще 6 питательных сред аналогично примеру 1, отличающихся количественным содержанием компонентов (среды 2, 3, 5, 6, 7, 8 табл.2). Результаты экспериментов учитывали аналогично примеру 1 по росту колоний культур, обладающих персистентными характеристиками.

Готовили питательную среду согласно прототипу (среда 3 табл.2). Для этого в расплавленный и остуженный до 60^o мясопептонный агар с pH 7,2 с 10% хлорида натрия добавляли 15% желточной взвеси, все перемешивали и разливали в чашки Петри, подсушивали и засевали исследуемый материал (клетки эпителия слизистой носа). У всех выросших колоний определяли персистентные характеристики известными способами.

Результаты исследований приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что задача изобретения наиболее полно решается в предлагемых пределах (среды 3 6).

Нижний предел содержания фузидина 1,5•10^-4г/л, т.к. меньшее содержание не препятствует росту дифференцируемых штаммов (среды 1, 2).

Верхний предел содержания фузидина 3,0•10^-4г/л, т.к. при больших концентрациях начинается подавление роста всех изучаемых штаммов стафилококков (среды 7, 8).

Таким образом, применение предложенной питательной среды дает возможность избирательно выделять стафилококки, обладающие персистентными характеристиками, что позволяет повысить эффективность диагностики стафилококкового бактерионосительства за счет однократного обследования, а также прогнозировать течение и рациональную терапию гнойно-воспалительных заболеваний человека и животных. При этом сокращаются сроки проведения микробиологических исследований, что обосновывает практическую ценность и экономическую эффективность ее использования при массовых обследованиях на стафилококковое бактерионосительство при проведении микробиологического мониторинга.

Источники информации.

1. Бухарин О.В. Персистенция бактерий. Актовая речь. Оренбург, 1992, с. 32.

2. Авт.св. N 1449587, кл. C 12 Q 1/04. 1989.

3. Авт.св. N 1564191, кл. C 12 Q 1/04. 1990.

4. Патент N 2010860 МПК5 C 12 Q 1/02, 1/04, 1994.

5. Ивашура А. И. Система мероприятий по борьбе с маститами коров. М. 1991, с.153-166.

6. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. (Под редак. М.О.Биргера) М. 1982, с.75.

7. Методические рекомендации по микробиологической диагностике профилактике стафилококковых инфекций. Киев. 1979. с.26.

8. Черномордик А.Б. Применение антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов (Справочник). Киев, 1988, с.125 128.

9. Бухарин О.В. Усвяцов Б.Я. Первушина Л.А. и др. Экспериментально-клиническое изучение лекарственной антилизоцимной активности возбудителей оппортунистических инфекций. Ж.Антибиотики и Химиотерапия. 1991, N 2, c.14-17.

10. Челпаченко О.Е. Экспериментальное обоснование рациональной терапии пиелонефрита у детей под контролем маркеров персистенции возбудителя. Автореф.канд.дисс. Челябинск, 1993.

11. Бухарин О.В. Усвяцов Б.Я. и др. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Ж.микробиология, 1984, N 2, c.27 -28.

Использование: биотехнология, микробиология, питательная среда, выявление в исследуемом материале стафилококков с персистентными характеристиками. Сущность изобретения: новая питательная среда позволяет избирательно выявить стафилококки, обладающие персистентными характеристиками. Среда содержит мясопептонный агар, хлористый натрий, желточную взвесь и в качестве селективного агента антибиотик фузидин при следующем соотношении компонентов, г/л: хлористый натрий 65 - 100, желточная взвесь 100 - 200), фузидин 0,00015 - 0,0003 и МПА до 1 л. Новая питательная среда позволяет выявлять штаммы стафилококков, обладающие персистентными характеристиками, что дает возможность своевременно диагностировать резидентных бактерионосителей, а также прогнозировать течение и рациональную терапию гнойно-воспалительных заболеваний человека и животных. Питательная среда может быть использована в клинике при решении вопросов дифференциальной диагностики и лечения, а также в санитарно-гигиенической практике при проведении микробиологического мониторинга. 2 табл.

Питательная среда для выявления стафилококков с персистентными характеристиками, содержащая мясопептонный агар, хлористый натрий, желточную взвесь, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антибиотик фузидин при следующем соотношении компонентов, г/л:
Хлористый натрий 65 100
Желточная взвесь 100 200
Фузидин 0,00015 0,0003
Мясопептонный агар До 1 лр