ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ D-ЦИКЛОСЕРИНА, ПРЕПАРАТ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ, СОДЕРЖАЩИЙ НАНОЧАСТИЦЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/42 A61K9/14 A61P31/06 

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных средств регулируемого действия на основе D-циклосерина.

Циклосерин - D-4-амино-3-изоксазолидинон - обладает широким спектром антибактериальной активности и назначается больным хроническими формами туберкулеза, у которых ранее применявшиеся основные препараты перестали оказывать эффект [1]. В этой связи циклосерин применяется как для лечения туберкулеза легких в активной форме и внелегочного туберкулеза (включая туберкулез почек), так и для лечения острых инфекций мочевыводящих путей, вызванных чувствительными штаммами грамположительных и грамотрицательных бактерий, в особенности видами Klebsiella/Enterobacter и Escherichia coli.

Вместе с тем при лечении циклосерином наблюдаются побочные явления, связанные с токсическим влиянием препарата на центральную нервную систему. Так, при приеме циклосерина более 500 мг в сутки у больных фиксировались судороги, сонливость, головная боль, тремор, головокружение, потеря памяти, психозы, возможно, с попытками самоубийства, изменения характера и повышенная раздражительность.

Уменьшение токсического действия циклосерина достигается назначением в период лечения либо глутаминовой кислоты (по 0,5 г 3-4 раза в день), либо внутримышечным введением натриевой соли аденозинтрифосфорной кислоты (по 1 мл 1% раствора ежедневно), либо внутримышечной инъекцией пиридоксина (1-2 мл 5% раствора в сутки). Запатентован оригинальный способ преодоления токсичности циклосерина путем его применения в желатиновых капсулах, содержащих 2-5 мас.% глутаминовой кислоты [2]. Это наиболее близкий аналог, который не дает возможности получить средство в виде наночастиц, которые дают пролонгированное действие.

Циклосерин быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта после приема внутрь, создавая обнаруживаемые уровни в плазме в течение одного часа. Он свободно распределяется по жидкостям и тканям организма. Около 66% дозы обнаруживается в неизменном виде в моче в течение 24 часов, 10% выводятся в течение следующих 48 часов. Около 35% метаболизируется, период полувыведения циклосерина колеблется в пределах 8-12 часов.

По своей молекулярной структуре циклосерин напоминает D-аланин и является мощным ингибитором аланинрацемазы. Он ингибирует также АТФ-зависимую D-аланил-D-аланин-синтетазу, необходимую для биосинтеза пептидоглюкана стенок бактериальной клетки, в частности Micobacterium tuberculosis [3-4].

Следует отметить, что в растворах циклосерин существует в нейтральной и диполярной формах, обладает амфотерными свойствами, рКа 4.4 и 7.3 [5], нестабилен в нейтральных и кислых водных средах [6].

Из анализа приведенных выше информационных материалов закономерно формулируется цель настоящего изобретения, а именно: создание лекарственного средства и препарата на основе циклосерина, уменьшающего токсичность активного вещества, обладающего пролонгацией действия при сохранении антимикробной активности стабильного при хранении и упрощение получения препарата.

Поставленная цель достигается использованием циклосерина в препарате, содержащем наночастицы, и базируется на современных достижениях фармакологии и медицины. Так, после проникновения M.tuberculosis в организм человека в качестве первой защитной реакции развивается фагоцитоз. Процесс взаимодействия легочных макрофагов с этими бактериями очень сложен [7]. При этом оптимизировать биораспределение противомикробного препарата можно лишь путем снижения его накопления в печени. Уменьшение эффективности фагоцитоза в печени достигается за счет применения наночастиц лекарственного препарата с неионогенными поверхностно-активными веществами (ПАВ), к примеру, полисорбата 80, что позволяет снизить накопление частиц в печени и увеличить время их циркуляции в организме («стелс-эффект») [8]. В этом плане значимые результаты были достигнуты при разработке наносомальной лекарственной формы рифампицина на полибутилцианоакрилате [9]. Имеются и другие данные о высокой эффективности наносомальных препаратов при лечении, в частности туберкулеза [10, 11]. За рубежом были разработаны противоонкологические препараты на основе наночастиц сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA) [12], которые под названиями декапептил, золадекс, сандостатин и соматулин разрешены к применению в медицинской практике Российской Федерации. Сополимер PLGA [50/50 Poly(DL-lactide-co-glycolide) (nominal)] нетоксичен и в организме человека подвергается биодеградации с образованием молочной и гликолевой кислот, катаболизм которых завершается образованием двуокиси углерода и воды [13].

Еще один аспект рассматриваемой проблемы связан с противопоказаниями применения циклосерина при наличии у больных тяжелой почечной недостаточности (клиренс креатинина менее 250 мл/мин) [1], которая преодолевается с помощью осмотических диуретиков, к примеру D-маннита [14].

Таким образом, из приведенных выше данных следует, что новое лекарственное средство и препарат на основе циклосерина потенциально должны содержать биодеградируемый полимер (PLGA), ПАВ (полисорбат 80) и D-маннит. В патентной литературе описано множество способов получения наночастиц, содержащих лекарственные или диагностические средства на биодеградируемых полимерах. К настоящему моменту эти методы суммированы в двух основополагающих патентах: эмульгирование с последующим лиофильным высушиванием [15] и механическое дробление в присутствии измельчающей среды [16]. При этом особое внимание обращает на себя тот факт, что для достижения эффективного всасывания препаратов в желудочно-кишечном тракте нужно, чтобы диаметр частиц был менее 500 нм [17].

Апробация известных методов нанотехнологии применительно к циклосерину не привела к успеху в силу его нестабильности в нейтральных и кислых водных средах [6]. В этой связи нами был разработан новый способ получения лекарственного препарата регулируемого действия на основе циклосерина, содержащего наночастицы. Предлагаемый способ базируется на упорядоченной структуре диметилсульфоксида (ДМСО), которая разрушается в интервале температур 40-60°С и возобновляется при 20-25°С [18]. При этом ДМСО способен к координационной сольватации с рядом органических и неорганических соединений, стабилизируя лабильные вещества [19]. Это в полной мере относится и к D-циклосерину, существующему в диполярной форме [5], и к PLGA, и к D-манниту. Дефицит электронной плотности на атоме углерода и нуклеофильность атома кислорода карбонильных групп PLGA способствуют образованию в жидком ДМСО агрегатов цепочечного строения. Получение упорядоченной матрицы становится определяющим событием при комплексном использовании ДМСО, циклосерина, PLGA и D-маннита в силу возникновения водородных связей за счет последнего ингредиента. Система стабилизированна и может быть использована по назначению. Необходимость применения неионогенных ПАВ (полисорбата 80) была рассмотрена ранее. При разведении полученного средства водой образуется устойчивая аполесцирующая суспензия, содержащая наночастицы размеров 3.0±0.5 нм (˜20% от общего количества частиц) и ˜200 нм (˜80% от общего количества частиц), которые могут эффективно всасываться в желудочно-кишечном тракте согласно вышеприведенным данным относительно размеров частиц [17].

Следует подчеркнуть, что экспериментальным путем были найдены такие соотношения циклосерина, PLGA, D-маннита, полисорбата 80 и ДМСО, при которых образуется средство жидкое, однородное, прозрачное и стабильное свыше года при комнатных условиях. При оценке стабильности качества образцов полученного затем препарата были использованы классические методы визуального контроля и рефрактометрического анализа. Рефрактометрия является интегральным методом оценки подлинности и чистоты веществ, позволяет определять концентрацию веществ в растворах и применяется в фармакопеи не одно десятилетие [20].

Обсуждая состав рассматриваемых средства и препарата, нельзя обойти вниманием вопрос о перспективах применения ДМСО в медицине. Так, внутримышечное введение больным алкогольной зависимостью дисульфирама в ДМСО приводит к длительному сенсибилизирующему эффекту [21]; при наружном применении ДМСО используется в комплексной терапии ревматоидного артрита, болезни Бехтерева, дискоидной красной волчанке, тромбофлебите, фурункулезе и экземе [22]; для лечения амилоидоза ДМСО применяют перорально до 100-200 мл 3-5% раствора в воде в сутки [23].

В целом, суммируя вышесказанное, впервые предложен лекарственный препарат регулируемого действия на основе циклосерина, содержащий наночастицы. Вначале получают раствор циклосерина, PLGA, D-маннита и полисорбата 80 в ДМСО. Затем аликвоту этой смеси разбавляют водой и получают устойчивую коллоидную систему, состоящую из наночастиц, и готовую к применению.

Оптимальный состав нового средства следующий, мас.%:

D-циклосерин0,75-2,50PLGA 50/501,25-7,50D-маннит1,25-7,50Полисорбат 800,5-1,0ДМСОостальное

При других соотношениях ингредиентов, как было установлено экспериментально, происходит либо потеря антимикробной активности, либо увеличение токсичности, либо нежелательные изменения в размерах полимерных частиц. Оптимальное разбавление средства в воде соответствует соотношению от 1:20 до 1:10, что может быть использовано для регулировки дозирования препарата в зависимости от индивидуальных особенностей больного.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Способ получения средства на основе D-циклосерина

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником и термометром, при температуре 20-25°С последовательно загружают D-циклосерин, PLGA 50/50, D-маннит, полисорбат 80 и ДМСО. Смесь перемешивают и нагревают до 50-60°С в течение 15-20 мин до полного растворения твердой фазы, после чего охлаждают до комнатной температуры за 20-30 мин.

Состав граничных препаратов представлен в таблицах 1 и 2.

Таблица 1Состав препаратов №1№ ппНаименование компонентамас.%1.D-Циклосерин0.75±0.052.PLGA 50/507.50±0.103.D-Маннит7.50±0.054.Полисорбат 800.75±0.055.Диметилсульфоксид83.50±0.20

Таблица 2Состав препаратов №2№ ппНаименование компонентамас.%1.D-Циклосерин2.50±0.102.PLGA 50/501.25±0.103.D-Маннит1.25±0.104.Полисорбат 800.80±0.055.Диметилсульфоксид94.20±0.20

Указанные выше примеры средства представляют собой прозрачные однородные жидкости светло-желтого цвета, устойчивые при хранении свыше года. При добавлении к ним воды в соотношении 1:20-1:10 образуются устойчивые опалесцирующие суспензии, определение размеров частиц которых приведены в примере 2.

Пример 2. Анализ размеров частиц препаратов.

Определение размеров частиц и распределение частиц по фракциям осуществляли методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD фирмы Coulter Electronics (Франция-США). Алгоритм измерений основан на программе CONTIN.

Образцы препаратов при разбавлении средства водой №1 и №2 циклосерина в количествах 3.5 мг вносили в кювету с дистиллированной водой (3 мл) и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 1 мин с помощью ультразвуковой ванны (Westwood Ultrasonics Ltd, Model 90S). Затем производили измерения. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3Результаты анализа размеров частиц образцов препаратов №1 и №2№№ композицииУнимодальный анализРаспределение частицРаспределение размеров частиц по фракциямЗначение размера нмСтандартное отклонение нмСреднее значение нмСтандартное отклонение нмКоэффициент вариации %Размер нмСтандартное отклонение нмКол-во %11454712681643.00.521     15833792        1483113394713.00.523     1729577

Пример 3. Элиминирование ингредиентов из препаратов.

Сравнительное исследование элимирования ингредиентов из препаратов осуществляли в условиях сменного диализа в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7.5) при комнатной температуре.

Для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (рН 7.5) применяли таблетки PBS Tablets phosphate buffered saline (AMRESCO). Одна таблетка на 100 мл дистиллированной воды.

В качестве диализных мешков использовали ленту Dialysis tubing, high retention. Size: 23 mm × 15 mm (Sigma-Aldrich). Предел исключения 12 кДа. Предварительно отрезки диализной ленты (10 см) кипятили в ˜0.001 М растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты в течение 1 ч.

Сосудами для проведения диализа служили мерные цилиндры емкостью 250 мл с крышками. Перемешивание диализной жидкости в ламинарном режиме осуществляли при помощи магнитных мешальников в тефлоновой оболочке и магнитной мешалки RH-KT/S (IKA^®, Германия).

Измерение оптических плотностей растворов проводили на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония).

Для взвешивания использовали аналитические весы VIBRA (max/d 220/0.0001 г) (Япония).

Для отбора проб применяли пипетку (1-5 мл) и пластиковые наконечники (BIOHIT) (Финляндия).

Диализу были подвергнуты следующие препараты:

(1) ДМСО(1.33 г).

(2) Раствор в воде циклосерина (2.5 мг циклосерина +0.34 мл воды).

(3) Композиция №1 (0.3361 г).

В подготовленные диализные мешки (емкость около 5-6 мл) с помощью пипетки помещали перечисленные жидкие образцы. Мешки, загерметизированные с помощью зажимов, помещали в сосуды для диализа с 250 мл буферного раствора, закрепляли нитью, закрывали крышкой и включали перемешивание.

Периодически проводили отбор проб диализатов (по 3 мл) в стеклянные пробирки емкостью 10 мл. В пробах измеряли оптическую плотность при λ 207 и 226 нм против чистого раствора PBS. Затем пробы возвращали обратно в сосуды для диализа. Было проведено 2 смены диализатов. Продолжительность экспериментов составила 1-2 суток.

Установлено:

1. Элиминирование ДМСО из препарата (1) завершилось через 3 ч, а диализ циклосерина из препарата (2) прекратился через 2 ч.

2. Элиминирование циклосерина и ДМСО из препарата №1 не завершилось даже через сутки.

Таким образом, правомерно считать, что пролонгация действия циклосерина увеличится до 10 раз в случае применения препарата №1 в сравнении с индивидуальным циклосерином.

Однотипные данные получены и для препарата №2.

Пример 4. Оценка противомикробной активности препаратов

Определение противомикробной активности образцов препаратов в отношении тест-культур грамположительных, грамотрицательных и атипичных бактерий осуществляли методом серийных микроразведений в жидкой среде в соответствии с рекомендациями NCCLS/24/ при визуальной регистрации видимого роста. Динамическое измерение оптической плотности проводили с помощью многоканального спектрофотометра Bioscren (Labsystems) при длине волны 610 нм с интервалом 20 мин. Планшеты с бактериальными суспензиями инкубировали при 37°С в термостатируемом модуле прибора. Исходная концентрация микроорганизмов составляла 5×10⁴ КОЕ/мл. Полученные результаты суммированы в таблице 4.

Таблица 4Антибактериальная активность образцов препаратовПрепаратКонцентрации препарата, %Зоны задержки роста микроорганизмов, ммStaphylococus aureus АТСС 906Escherichia coli АТСС 25022Salmonella spp. (атипичная форма)ДМСО1006.58810-775-7-Циклосерин 2.5% р-р в ДМСО10019202010-7115-7-Препарат №1100---10---5---Препарат №210024181910-11115-107

Пример 5. Оценка токсичности препаратов.

Определение токсичности образцов препаратов осуществлялось согласно общепринятым методикам [25].

В исследованиях на 2-х видах животных обоего пола - мышах линии Balb-C и крысах Wistar установлено, что готовый к употреблению препарат (10% раствор средства №1 и №2) при однократном введении внутрь в дозе эквивалентной эффективной разовой терапевтической дозе циклосерина для человека (250 мг), а также в дозах, в 5 и 10 раз ее превосходящих, не производило токсического действия.

Источники информации

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. 4.2. / 12-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1993. - С.381-382.

2. Нестерук В.В., Сыров К.К. Лекарственное средство в виде желатиновой капсулы. / Патент РФ №2248205 С1. - 2003 г.

3. Gaie E.F., Cundliffe E., Reynolds P.E. et al. The Molecular Basis of Antibiotic Action. / Wiley. - New York. - 1972. - P.61-71.

4. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. М.: Мир, 1980. - С.223-225.

5. Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.5. Триптофан-Ятро-химия/Редкол.: Зефиров Н.С.(гд. ред.) и др. М.: Большая Российская энциклопедия, 1998. - С.740.

6. The Merck Jndex, 12 ed. (1996), N 2820, P.464.

7. Хоменко А.Г. Современные представления о патогенезе туберкулеза. // Русск. мед. журн. - 1998. - Т.6. - №17. - С.810-814.

8. Moghimi S.M., Hunter AC, Murrey J.C. Long-circulating and targetspecific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol. Rev. - 2001. - V.53. - P.283-318.

9. Оганесян Е.А., Будько А.П., Стукалов Ю.В. и др. Разработка и изучение наносомальной лекарственной формы рифампицина. // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - T.5 -. - Вып.8-9. - C. 15-19.

10. Khuller G.K., Pandey R. Sustained release drug delivery systems in management of tuberculosis. // J. Chest. Dis. Allied Sci. - 2003. - V.45. - P.229-230.

11. Pandey R., Zahoor A., Sharma S., Khuller G.K. Nanoparticle encapsulated antitubercular drugs as a potential oral drug delivery system against marine tuberculosis. // Tuberculosis. - 2003. - V.83. - N6. - P.373-378.

12. Ruth Duncan. Polymer conjugates as anticancer nanomedicines // Nature Reviews CancerYAOP, published online 10 August 2006; doi: 10.1038/nrc 1958

(www.nature.com/revuews/cancer).

13. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: Академкнига. - 2006. - 400 С.

14. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. Ч.1. / 12-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1993. - С.586-597.

15. Фанг Джна-Хва, Сингх Манмохан, О′Хейган Дерек, Хора Маниндер. Композиции микрочастиц и способы их получения. / Патент РФ №227198 С.2. - 2005 г.

16. Сиджфрид К.Джун. Частицы, включающие плохо растворимое кристаллическое терапевтическое или диагностическое средство и способ их получения. / Патент РФ №2124886 С1. - 1999 г.

17. Вранккс Анри, Демустье Мартин, Делеер Мишель. Фармацевтический состав, содержащий нанокапсулы, и способ его получения. / Патент РФ №2145498 С1. - 1994 г.

18. Кукушкин Ю.Н. Диметилсульфоксид - важнейший апротонный растворитель. // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - №9. - С.54-59.

19. Оаэ С. Химия органических соединений серы. / Пер. с японск. М.: Мир, 1975 - С.223-278.

20. Государственная фармакопея СССР. Выпуск 1. Общие методы анализа. М.: Медицина, 1987. - С.24-30.

21. Собетов Б.Г., Собетова В.Б., Алексеевич Я.И., Озеров Б.Г., Меркулов СП. Способ получения инъекционной формы дисульфирама. / Патент РФ №2013090 С1. - 1994 г.

22. Димексид. Регистрационный номер РФ: PN 003411/01 от 22.04.2005.

23. Лечение амилоидоза. Московская многопрофильная клиника. htth://clinic.inventech.ru/urologv/urologv.0273shtml.

24. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Method for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved Standard M-7-A4./4^th ed. Villanova.

25. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. 4.1. Совместное издание программы ООН по окружающей среде и Всемирной организации здравоохранения, ВОЗ, Женева - 1981 г.

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных препаратов регулируемого действия на основе циклосерина, содержащих наночастицы. Для получения этого препарата средство, содержащее смесь из D-циклосерина, PLGA 50/50, D-маннита, полисорбата 80 и диметилсульфоксида в определенном соотношении нагревают при 50-60°С до образования однородной прозрачной жидкости, которую далее охлаждают до комнатной температуры и после разбавления водой образующуюся суспензию, содержащую наночастицы размеров 3.0±0.5 нм (˜20% от общего количества частиц) и ˜200 нм (˜80% от общего количества частиц), используют по назначению. Изобретение обеспечивает получение препарата, обладающего высокой антимикробной активностью, пролонгированным действием, относительной безвредностью и низкой токсичностью. 3 н.п. ф-лы., 4 табл.

1. Лекарственное средство, обладающее антимикробным действием, характеризующееся тем, что оно содержит D-циклосерин, сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50/50), D-маннит, полисорбат 80, диметилсульфоксид (ДМСО) при следующем соотношении компонентов, мас.%:

D-Циклосерин 0,75-2,50PLGA 50/50 1,25-7,50D-Маннит 1,25-7,50Полисорбат 80 0,5-1,0Диметилсульфоксид Остальное