СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2008 года по МПК A61K47/48 A61K31/438 A61K47/30 A61P31/04 A61P31/06 

Изобретение относится к области медицины и фармакологии, конкретно к лекарственным средствам для лечения бактериальных инфекций, в первую очередь туберкулеза и заболеваний желудочно-кишечного тракта.

В последние годы наблюдается значительный рост заболеваемости туберкулезом легких во всех странах мира, что связано с появлением резистентных штаммов и распространением заболеваний иммунной системы, в том числе СПИДа. По оценкам ВОЗ, в период до 2020 года количество вновь инфицированных туберкулезом достигнет 1 миллиарда, 200 миллионов человек заболеют и 35 миллионов умрут от туберкулеза, если не будут найдены новые, более эффективные, средства лечения.

Низкая эффективность используемых к настоящему времени противотуберкулезных препаратов объясняется тем, что постоянно растет количество больных с множественной лекарственной устойчивостью, вызванной появлением лекарственно-резистентных штаммов микроорганизмов, что требует использования новых препаратов широкого антимикробного спектра действия.

В условиях резкого ухудшения эпидемической ситуации по туберкулезу одним из приоритетных направлений фтизиатрии является повышение эффективности химиотерапии туберкулеза легких. Основные цели и задачи химиотерапии заключаются, во-первых, в излечении больного с наименьшими изменениями его привычного образа жизни с предотвращением летального исхода и распространения туберкулеза на других членов общества, а во-вторых, в предотвращении развития лекарственно-резистентных штаммов микобактерий туберкулеза, которое существенно затрудняет последующее лечение.

Трудности терапии тяжелых форм туберкулеза, а также особенности возбудителя заболевания обусловливают необходимость длительного применения нескольких противотуберкулезных препаратов в различных дозировках и с различной частотой. Сложность соблюдения такого режима лечения очевидна, в то же время нерегулярный прием препаратов связан с высоким риском развития резистентности.

Аналогичная ситуация складывается с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта, вызванными бактериями вида Helicobacter, особенно Helicobacter pylori (язвенная болезнь, гастрит, колит, проктит и пр.). По оценкам ВОЗ, приблизительно 50% населения Земли инфицировано этими бактериями. Трудности терапии этой инфекции также обусловлены развитием резистентности.

Наиболее значимым из возможных путей повышения эффективности антибактериальных лекарственных средств представляется разработка препаратов, обеспечивающее длительное постепенное выделение антибиотика, что позволит снизить применяемые дозы и/или упростить схему лечения.

Известны препараты направленного действия, в которых лекарственное вещество химически связано с макромолекулярным носителем. Примером такого подхода является ковалентный конъюгат изониазида и декстрана (Патент РФ №2143900 «Способ получения изониазида пролонгированного действия», кл. А61К 31/455, опубл. 10.01.2000). Недостатком таких препаратов является низкая емкость (соотношение: лекарственное вещество - носитель), а также сложность технологии их создания.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является антибактериальное средство для лечения легочных инфекций по патенту РФ №2185818, кл. А61К 9/08, опубл. 27.07.2002, представляющее собой композицию на основе лекарственного вещества, адсорбированного на частицах полиалкилцианоакрилатов (С₂-С₁₀) или их смесей размером 200-700 нм, содержащую также декстран с молекулярной массой 20-70 кДа и наполнители при следующем соотношении компонентов, вес.%:

Полиалкилцианоакрилат (или их смесь)20-40Лекарственное вещество1-10Декстран15-20НаполнителиОстальное

Композиция может дополнительно содержать растворитель в количестве не более 98 вес.% от общего веса коллоидной системы, а также дополнительно может содержать поверхностно-активные вещества (ПАВ) (полоксамеры, полоксамины, полисорбаты и др.) в количестве не более 20 вес.% от общего веса водной коллоидной системы.

Известное антибактериальное средство при внутривенном введении обеспечивает внутриклеточную локализацию лекарства в альвеолярных макрофагах в эффективных для терапии количествах, однако у него имеется ряд существенных недостатков. Во-первых, основное преимущество известного средства - доставка лекарственных веществ в макрофаги с помощью наночастиц - реализуется только при внутривенном введении наносомальной лекарственной формы. В то же время при лечении как туберкулеза, так и заболеваний ЖКТ, вызванных Helicobacter pylori, именно пероральный способ введения лекарственных препаратов является приоритетным. Однако полиалкилцианоакрилаты, являющиеся основой полимерной матрицы известного лекарственного средства, отличаются весьма высокими скоростями разложения в живом организме, что не позволяет достичь длительного выделения лекарства из полимерной матрицы, особенно при пероральном введении. Во-вторых, некоторые бактериальные инфекции, в том числе Mycobacterium tuberculosis и Helicobacter pylori, характеризуются значительными экстраклеточными популяциями патогенов. В особенности это относится к бактериям Helicobacter pylori, которые обладают способностью ингибировать фагоцитоз. Понятно, что известное средство, основное преимущество которого обусловлено способностью наночастиц доставлять лекарственные вещества в макрофаги, в этом случае может оказаться малоэффективным и не обеспечит максимального проявления присущих лекарственному веществу положительных характеристик. В-третьих, полиалкилцианоакрилаты необходимо синтезировать из соответствующих мономеров, и получение частиц определенных размеров (менее одного микрона) в ходе синтеза представляет сложную технологическую проблему, следствием чего является недостаточная стабильность характеристик получаемых наночастиц, что отрицательно сказывается на сорбционных свойствах полимерного носителя.

Задачей заявляемого изобретения является создание средства пролонгированного действия для лечения бактериальных инфекций на основе биодеградируемых и биосовместимых полимеров, которое обеспечит максимальное проявление присущих лекарственному веществу положительных характеристик и позволит повысить эффективность лечения.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым средством на основе рифабутина, сорбированного внутри наночастиц полимерного носителя, в качестве которого используются наночастицы размером 100-800 нм полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в указанных сополимерах до 50 мольных %; при этом молекулярная масса указанных полимеров и сополимеров составляет от 5 до 300 кДа. Средство может дополнительно содержать холестерилфосфат калия, или гликохолат натрия, или гексадецила дигидрофосфат, или α-токоферилсукцинат в качестве гидрофобного противоиона для аминогруппы рифабутина, водорастворимый природный или синтетический полимерный стабилизатор с молекулярной массой не более 70 кДа, выбранный из группы, включающей поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисорбат или сывороточный альбумин, и наполнители, при следующем соотношении компонентов, вес.%:

Указанный полимерный носитель10-50Рифабутин1-50

Холестерилфосфат калия,

или гликохолат натрия, или гексадецила

дигидрофосфат, или α-токоферилсукцинат0,01-10Указанный полимерный стабилизатор 5-40НаполнителиОстальное

В качестве наполнителей в предлагаемом средстве могут быть использованы сахара, обладающие криопротекторными свойствами (например, глюкоза, лактоза, маннит, трегалоза) и соли (например, хлорид натрия, цитрат натрия).

При выборе лекарственного начала для предлагаемого средства необходимо учитывать, что большинство больных туберкулезом имеют множественную лекарственную устойчивость, поэтому наиболее распространенные в практике лечения туберкулеза антибиотики не смогут обеспечить высокой эффективности терапии.

Рифабутин является полусинтетическим антибиотиком широкого спектра действия, эффективным в отношении внутриклеточно и внеклеточно расположенных микроорганизмов. Показаниями к применению рифабутина являются хронический полирезистентный туберкулез легких, вызванный рифампицин-резистентными штаммами Mycobacterium tuberculosis (в составе комбинированной терапии), а также инфекции, вызванные Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium xenopi и др. атипичными микобактериями (в т.ч. у пациентов с иммунодефицитом). Рифабутин также эффективен против штаммов Helicobacter pylori, резистентных к основным препаратам, назначаемым для лечения этой инфекции: амоксициллину, кларитромицину, метронидазолу и тетрациклину.

Выбор полимерного носителя определялся химическими свойствами рифабутина и поставленной задачей. Наилучшие сорбционные свойства проявили гомополимеры молочной кислоты и сополимеры молочной и гликолевой кислот, в том числе с дополнительным содержанием концевых карбоксильных групп, которые способствует увеличению эффективности включения рифабутина в полимерную матрицу наночастиц.

Кроме того, относительное содержание рифабутина в готовой лекарственной форме существенно повышается за счет уменьшения содержания полимера-носителя и вспомогательных веществ; при этом полезные свойства наночастиц (высокая степень сорбции рифабутина, размер, агрегационная устойчивость) сохраняются.

Благодаря сорбции антибиотика внутри наночастиц из биодеградируемого полимера повышается его биодоступность.

Предлагаемое средство получают следующим образом.

Известным методом изготовления простой эмульсии вода/масло путем однократной или многократной гомогенизации органической и водной фаз, содержащих компоненты заявленного средства, с последующим испарением органического растворителя получают наночастицы из гомополимеров молочной кислоты или сополимеров молочной и гликолевой кислот размером 100-800 нм. Сорбцию рифабутина внутри наночастиц полимера осуществляют в процессе образования суспензии наночастиц при удалении органического растворителя из эмульсии. Для повышения содержания активного ингредиента (рифабутина) в готовой лекарственной форме вводится дополнительная стадия, заключающаяся в концентрировании наносуспензии методом центрифугирования или ультрафильтрации и позволяющая понизить содержание вспомогательных веществ (стабилизатора).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (контрольный). Получение наночастиц методом простых эмульсий

Систему, состоящую из 2-20% раствора полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот и 0,5-6% раствора рифабутина в органическом растворителе (обычно в метиленхлориде, хлороформе или этилацетате) и 0,5-5% водного раствора полимерного стабилизатора эмульсии (объемное соотношение органической и водной фаз 1:5), гомогенизируют до получения эмульсии. Органический растворитель из полученной эмульсии удаляют путем испарения при нормальном давлении и комнатной температуре (перемешивание в течение 3 часов) либо при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Полученную наносуспензию фильтруют, добавляют 0-10% наполнителя-криопротектора (например, глюкоза, лактоза, маннит, трегалоза) и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет 100-800 нм в зависимости от условий гомогенизации и использованных стабилизатора эмульсии и ПАВ. Степень включения рифабутина составляет 60-80%. Средний размер частиц составляет 100-800 нм (в зависимости от условий гомогенизации и использованного стабилизатора эмульсии).

Пример 2. Получение наночастиц методом простых эмульсий (со стадией концентрирования)

Систему, состоящую из 2-20% раствора полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот и 0,5-5% раствора рифабутина в органическом растворителе (обычно в метиленхлориде, хлороформе или этилацетате) и 0,5-5% водного раствора полимерного стабилизатора эмульсии (объемное соотношение органической и водной фаз 1:5), гомогенизируют до получения эмульсии. Органический растворитель из полученной эмульсии удаляют путем испарения при нормальном давлении и комнатной температуре (перемешивание в течение 3 часов) либо при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Затем полученную наносуспензию фильтруют и центрифугируют в течение 30-90 мин при 4000 об/мин. Супернатант удаляют, осадок редиспергируют в воде, добавляют 0-10% наполнителя-криопротектора (например, глюкоза, лактоза, маннит, трегалоза) и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет 100-800 нм в зависимости от условий гомогенизации и использованных стабилизатора эмульсии (ПАВ). Степень включения рифабутина составляет 60-80%. Средний размер частиц составляет 100-800 нм (в зависимости от условий гомогенизации и использованного стабилизатора эмульсии).

Пример 3. Получение наночастиц методом простых эмульсий (с гидрофобным противоионом)

Систему, состоящую из 2-20% раствора полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот, 0,5-5% раствора рифабутина и 0,005-1% холестерилфосфата калия, или гликохолата натрия, или гексадециладигидрофосфата, или α-токоферилсукцината в органическом растворителе (обычно в метиленхлориде или хлороформе) и 0,5-5% водного раствора полимерного стабилизатора эмульсии (объемное соотношение органической и водной фаз 1:5), гомогенизируют до получения эмульсии. Органический растворитель из полученной эмульсии удаляют путем испарения при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Затем полученную наносуспензию фильтруют и центрифугируют в течение 30-90 мин при 4000 об/мин. Супернатант удаляют, осадок редиспергируют в воде, добавляют 0-10% наполнителя-криопротектора (например, глюкоза, лактоза, маннит, трегалоза) и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет 100-800 нм в зависимости от условий гомогенизации и использованных стабилизатора эмульсии (ПАВ). Степень включения рифабутина составляет 70-98%. Средний размер частиц составляет 100-800 нм (в зависимости от условий гомогенизации и использованного стабилизатора эмульсии).

Полученный в соответствии с примерами 1, 2, 3 порошок дополнительно смешивается с вспомогательными веществами, обеспечивающими технологичность процесса наполнения капсул, и засыпается в твердые желатиновые капсулы, в том числе желудочно-резистентные твердые желатиновые капсулы.

В качестве дополнительных вспомогательных веществ применяются следующие вещества (на 100 вес. частей лекарственного вещества, сорбированного внутри наночастиц полимерного носителя, включающим целевые добавки):

Микрокристаллическая целлюлоза0-30Кремния диоксид коллоидный0-20Натрия лаурил сульфат0-15Магния стеарат0-15

Перед наполнением твердых желатиновых капсул композиция может быть сформирована в пеллеты, покрытые полимерной оболочкой, способствующей пролонгированному выделению лекарственного вещества и состоящей, например, из полимеров Eudragit Е-100 (метакриловой кислоты сополимер) и Kollicoat SR 30 D (30% водная дисперсия на основе поливинилацетата) с соответствующими добавками (например, триэтилцитрат, тальк, симетикона эмульсия).

Составы заявляемого антибактериального средства, полученного по примерам 2 или 3, в мас.%:

Состав 1 (по примеру 2)

ПЛА, ММ 300 кДа, средний размер частиц 600 нм 10Рифабутин 1Полисорбат 80 35,1Глюкоза 53,9

Состав 2 (по примеру 2)

ПЛГА-СООН, ММ 18 кДа, средний размер частиц 200 нм 28,5Рифабутин 28,5Поливиниловый спирт, ММ 30-70 кДа 14,3Маннит 28,7

Состав 3 (по примеру 3)

ПЛГА (50:50), ММ 2500 кДа, среднй размер частиц 300 нм 25Рифабутин 25Гликохолат натрия 5Сывороточный альбумин, ММ 6-10 кДа 25,4Трегалоза 19,6

Состав 4 (по примеру 3)

ПЛГА, ММ 20 кДа, средний размер частиц 220 нм 40,0Рифабутин 50,0Поливиниловый спирт, М.М. 30-70 кДа 4,5Маннит 5,5

Пример 4. Исследование кинетики выделения рифабутина из наночастиц

Эксперимент проводили в среде, моделирующей желудочный сок (водная среда, рН 1,2, 37°С), использовали полученный состав 2. Наносомальный рифабутин, полученный из 1 мл реакционной смеси, ресуспендировали в 1 мл буферного раствора PBS (рН 7,4) и количественно переносили в пластиковые пробирки, содержащие 24 мл водного раствора соляной кислоты (рН 1,2), содержащего 0,1% аскорбиновой кислоты. Пробирки инкубировали в термостатируемом шейкере (37°С, 230 об/мин). Пробы объемом 500 мкл отбирали через установленные промежутки времени (сразу после разбавления, через 30 мин, 1, 2, 4 и 6 ч), наночастицы отделяли методом ультрафильтрации, используя мембранные микрофильтры (Microcon 30 kDa (Millipore, США)). Концентрацию свободного (не связанного с наночастицами) рифабутина определяли спектрофотометрически.

Как показали результаты эксперимента (фиг.1), наночастицы предлагаемого состава обеспечивают замедленное высвобождение рифабутина в среде, моделирующей желудочный сок.

Пример 5. Биораспределение предлагаемого антибактериального средства при пероральном введении кроликам.

Кроликам вводили перорально наносомальную форму рифабутина (состав 3). В качестве контроля использовали стандартную субстанцию рифабутина. Препараты вводили в виде желатиновых капсул. У животных брали образцы крови через 5 мин, 1, 3, 5, 15 и 24 ч и определяли концентрации рифабутина методом ВЭЖХ.

Как видно из фиг.2, применение наночастиц позволяет значительно повысить концентрации рифабутина в плазме и интегральный показатель (площадь под кривой концентрация в плазме - время), который составил 276 мкг/мл×ч для субстанции рифабутина и 507 мкг/мл×ч для его наносомальной формы. Таким образом, наносомальная форма при пероральном введении обеспечивает повышение биодоступности рифабутина почти в 2 раза.

Пример 6. Повышенная эффективность предлагаемой лекарственной формы рифабутина при лечении экспериментального туберкулеза у мышей

Исследование химиотерапевтической активности рифабутина, ассоциированного с полимерными наночастицами, проводили на мышах с экспериментальным туберкулезом. Самок мышей линии BALB/c (возраст 7-8 недель) заражали внутривенным введением Mycobacterium tuberculosis H37Rv в дозе 5×10⁶-10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мышь. Инфицированных мышей разделили на три группы (n=10) и вводили им перорально стандартный препарат рифабутина (РБ) и наносомальный рифабутин (РБ/PLGA) (состав 3) на четвертые, пятые и шестые сутки после заражения. Препараты вводили в одинаковой дозе 20 мг/кг. В качестве контроля использовали животных, не получавших лечения (Контроль).

Через сутки после окончания курса 3-дневной терапии зараженных животных подвергали эвтаназии, в асептических условиях выделяли и гомогенизировали легкое (правое), далее проводили высев на чашки со средой 7Н11. Подсчет живых микобактерий в единицах КОЕ проводили через 3-4 недели. Результаты приведены на фиг.3.

Как видно из фиг.3, при экспериментальном туберкулезе у мышей наносомальный препарат (РБ/PLGA) проявляет более высокий антибактериальный эффект по сравнению со стандартной субстанцией (РБ), то есть позволяет повысить эффективность лечения.

Пример 7. Повышенная эффективность предлагаемой лекарственной формы рифабутина при лечении экспериментальной инфекции Helicobacter pylori у мышей

Исследование химиотерапевтической активности рифабутина, ассоциированного с полимерными наночастицами проводили на мышах с экспериментальной инфекцией Helicobacter pylori.

Для заражения самкам мышей линии BALB/c (возраст 7-8 недель) вводили через зонд в желудок по 100 мкл суспензии бактерий Н. pylori (штамм SS1) в дозе 5×10⁶-10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мышь. Через неделю после заражения инфицированных мышей разделили на три группы (n=10) и вводили им перорально стандартный препарат рифабутина (РБ) и наносомальный рифабутин (РБ/PLGA) в дозе 20 мг/кг в день в течение 7 дней. В качестве контроля использовали животных, не получавших лечения (Контроль).

Через сутки после окончания курса 7-дневной терапии животных подвергали эвтаназии, в асептических условиях выделяли и гомогенизировали желудок, далее проводили высев на чашки с агаром. Подсчет живых микобактерий в единицах КОЕ проводили через 10 дней. Результаты приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, при экспериментальном туберкулезе у мышей наносомальный препарат (РБ/PLG) проявляет более высокий антибактериальный эффект по сравнению со стандартной субстанцией (РБ), то есть позволяет повысить эффективность лечения.

Таким образом, приведенные результаты показывают, что благодаря наносомальной природе, а также сродству полимерной матрицы наночастиц к слизистой оболочке желудка предлагаемое антибактериальное средство обеспечивает повышение биодоступности рифабутина, в результате чего повышается эффективность лечения инфекций, в частности Mycobacterium tuberculosis и Helicobacter pylori. Повышение биодоступности уменьшает дозы антибиотика и, следовательно, снижает побочные токсические эффекты.

Кроме того, предлагаемое изобретение представляет собой лекарственную форму для перорального введения, а также позволяет избежать технологически сложного и трудоемкого процесса синтеза полимерной матрицы из мономеров.

Таблица 1Терапевтическая эффективность лекарственных форм рифабутина при лечении экспериментальной инфекции Н. pylori у мышейГруппаLog10 КОЕ Н. pylori/I 00 мг ткани/мышь ±SDНегативный контроль (интактные животные)0Позитивный контроль (инфицированные животные без лечения)4,09±0,26Рифабутин3,85±0,22Рифабутин/PLGA1,41±1,23

Средство содержит рифабутин, сорбированный в матрице полимерных наночастиц, холестерилфосфат калия, или гликохолат натрия, или гексадецила дигидрофосфат, или α-токоферилсукцинат, водорастворимый полимерный стабилизатор и наполнители. Полимерные наночастицы размером 100-800 нм включают полимер/полимеры молочной кислоты и/или сополимер/сополимеры молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в указанных сополимерах до 50 мольных %, при этом молекулярная масса указанных полимеров и сополимеров составляет от 5 до 300 кДа. Водорастворимый полимерный стабилизатор имеет молекулярную массу не более 70 кДа и является выбранным из группы, включающей поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисорбат и сывороточный альбумин. Новое средство обеспечивает пролонгированное действие рифабутина, повышение биодоступности рифабутина и эффективности лечения бактериальных инфекций. 3 ил., 1 табл.

Средство для лечения бактериальных инфекций на основе рифабутина, сорбированного в матрице полимерных наночастиц, включающее наполнители, отличающееся тем, что в качестве полимерного носителя содержит наночастицы размером 100-800 нм полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в указанных сополимерах до 50 мол.%, при этом молекулярная масса указанных полимеров и сополимеров составляет от 5 до 300 кДа, причем средство дополнительно содержит холестерилфосфат калия, или гликохолат натрия, или гексадецила дигидрофосфат, или α-токоферилсукцинат, а также водорастворимый природный или синтетический полимерный стабилизатор с молекулярной массой не более 70 кДа, выбранный из группы, включающей поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисорбат и сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов, вес.%:

Указанный полимерный носитель10-50Рифабутин1-50Холестерилфосфат калия, или гликохолат натрия, или гексадецила дигидрофосфат, или а-токоферилсукцинат0,01-10Указанный полимерный стабилизатор5-40Наполнителиостальное