ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНЫХ ФОРМ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ОСНОВЕ РИФАМПИЦИНА Российский патент 2011 года по МПК A61K31/395 B82B1/00 A61K31/765 A61K47/48 A61P31/06 

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных и противотуберкулезных средств регулируемого действия на основе 3-[[(4-метил-1-пиперазинил)имино]-метил]рифамицина или 5,6,9,17,19,21-гексагидрокси-23-метокси-2,4,12,16,18,20,22-гептаметил-8-[N-(4-метил-1-пиперазинил)-формимидоил]-2,7-эпоксипентадека[1,11,13]триенимино)нафто-[2,1-b]фуран-1,11(2H)-дион-21-ацетата (рифампицина).

По данным ВОЗ в 2006 г. имели место 9,2 миллиона новых случаев заболевания туберкулезом (139 случаев на 100000 человек). Это на 100 тыс. больше, чем в 2005 г. В 2006 г. от туберкулеза умерли 1,7 миллиона человек. В России в 2007 г. число больных туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью среди впервые выявленных составило 4149 человек (9,8% от общего числа вновь выявленных). Всего состоит на учете на конец 2007 г. - 24445 человек на каждые 100 тыс. населения.

Аналогичная картина наблюдается и с заболеваемостью желудочно-кишечного тракта, верхних и нижних дыхательных путей и др., вызванных различными микроорганизмами, устойчивыми к большинству современных антибиотиков.

Одним из современных антибиотиков с широким антибактериальным и бактерицидным спектром действия является полусинтетический препарат - рифампицин. Рифампицин активен и в отношении микобактерий туберкулеза и поэтому широко используется для лечения туберкулеза в сочетании с другими препаратами. Антибиотик также применяют при инфекциях кожи, мягких тканей, лечении пневмонии, абсцессов легких, холецистита и т.д.

Устойчивость микобактерий к рифампицину развивается быстро, что является большим недостатком антибиотиков этого ряда.

Другим отрицательным свойством рифампицина является его плохая всасываемость при приеме внутрь, вследствие чего его приходится применять парентерально.

Рифампицин, как и другие антибактериальные и бактерицидные препараты, обладает низкой селективностью действия и при введении антибиотика больным лишь небольшая его доза попадает в клетку-мишень. Большая его часть подвергается биотрансформации и выводится из организма, не оказав терапевтического эффекта. В связи с этим при лечении рифампицином, особенно длительном его применении, регистрируются многочисленные нежелательные эффекты: аллергические реакции (кожные высыпания, эозинофилия), тошнота, рвота, увеличение печеночных трансаминаз в крови, головная боль, артралгии, канальцевый некроз, нарушение зрения, возможно развитие тромбофлебитов и др. Рифампицин противопоказан больным с нарушениями функции печени и почек, беременным женщинам и при лактации [1].

Для решения проблем, связанных с токсичностью препаратов, наличием противопоказаний, резистентности и т.д., необходимо решить задачи по повышению эффективности лекарственных веществ и, следовательно, снижению терапевтической дозы и токсического воздействия. Наиболее значимым из возможных путей достижения этой цели является разработка препаратов или лекарственных форм направленного действия, обеспечивающих доставку и локализацию лекарства в клетках-мишенях в эффективных для терапии дозах. При этом желательно, чтобы это свойство сочеталось с длительным постепенным высвобождением вещества (пролонгированностью действия), что позволяет создать более комфортные условия для пациентов, вынужденных регулярно и длительно применять лекарства.

Новый технический результат достигается по совокупности всех существующих признаков созданного лекарственного средства на основе рифампицина, позволяющего достигать положительного фармакодинамического действия препарата при меньших дозах и тем самым снижать риск и степень возникновения токсических эффектов, с одновременным достижением эффекта пролонгации действия, снижения кратности приема при лечении.

Технический результат изобретения достигается путем включения в новое лекарственное средство на основе рифампицина, коммерчески доступных биодеградируемых полимеров, разрешенных к медицинскому применению, для получения наночастиц. В качестве таковых используются: полимер молочной кислоты (ПЛА), сополимер гликолевой и молочной кислот (ПЛГА) и сополимер гликолевой и молочной кислот со свободной концевой карбоксильной группой (ПЛГА-СООН).

Для получения наночастиц использовали полимеры с молекулярной массой от 10 до 300 кДа и молярным соотношением остатков молочной и гликолевой кислот от 25:75% до 50:50%. Для получения стабильной лекарственной формы, представляющей наночастицы размером 200-500 нм и обладающей пролонгированным высвобождением антибиотика, применяются также поверхностно-активные вещества: полисорбат 80, поливиниловый спирт (ПВС), полоксамер 188, сывороточный альбумин и криопротекторы: маннит, лактоза, глюкоза и другие сахара. Предлагаемое средство получают известным методом простого (однократного) эмульгирования (вода/масло) [2]. Сорбция рифампицина внутри наночастиц полимера происходит при удалении органического растворителя из полученной эмульсии и в процессе образования суспензии.

Следует отметить, что ранее сходные исследования проводились индийскими, японскими и иранскими исследователями [3-7]. В работах индийских ученых [3, 4] описано получение нанопрепаратов на основе ПЛГА с включенными в полимерную матрицу рифампицином, изониазидом, протионамидом и этамбутолом методом ультразвукового эмульгирования. Препараты проявляли in vivo высокую противотуберкулезную активность в течение 10 дней, в то время как в нашем случае высокая активность сохранялась и через 21 день после начала эксперимента. В работах [3, 4] отсутствуют данные по токсическим свойствам препаратов и поэтому трудно судить о перспективности их дальнейшего использования.

В статье иранских авторов [5] приводятся данные по получению наносомальных препаратов (209÷260 нм) на основе ПЛГА с рифампицином и изучение их физико-химических свойств. Приведены также краткие данные по изучению in vitro антибактериальной активности на культурах клеток. Эксперименты in vivo не приведены.

В работе [6] описаны эксперименты по получению микрочастиц (менее 3 мкм) на основе ПЛГА и противотуберкулезных препаратов (изониазида, рифампицина и пиразинамида) методом двойного эмульгирования. Изучено распределение ЛВ в различных органах экспериментальных животных после введения этих препаратов во времени. Показано, что концентрация рифампицина и его активность снижались через 9 суток после введения. Сведений о более отдаленных действиях препаратов не приводится. Похожие сведения представлены в работе Barrow E.L.W. и др. [7], где описана методика получения микросфер (7,5÷15 мкм) из полимеров ПЛГА разного состава с сорбированным рифампицином. Приводятся данные о наличии активности на Mycobacterium tuberculosis в течение 6 дней [7].

Таким образом, по совокупности всех существующих признаков созданного лекарственного средства: наличие пролонгирующего эффекта, наличие высокой специфической активности in vivo в опытах на животных, инфицированных резистентными формами туберкулеза, даже по истечении 3 недель, пониженная токсичность, достигается новый технический результат.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Получение полимерных наночастиц с включенным в них рифампицином методом простых эмульсий

Смесь, состоящую из раствора 5÷60% полимера (ПЛА, ПЛГА или ПЛГА-СООН) и 1÷10% рифампицина в органическом растворителе (хлороформ, хлористый метилен), а также 0,5÷2% водного раствора полимерного стабилизатора эмульсии в объемном соотношении к органическому растворителю 5:1 гомогенизируют при 24 тыс. об./мин на гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 (IKA^®, ФРГ) 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин. Эмульсию перемешивают 1 ч при 40°С (если использовался хлороформ) или 1,5 ч при комнатной температуре (при использовании хлористого метилена) до полного удаления органического растворителя. Данную операцию необходимо проводить при работающей вытяжной вентиляции. Полученную суспензию фильтруют через грубый стеклянный фильтр (пор. 40÷110 мкм), добавляют в фильтрат 1÷3% (объемн.) криопротектора (D-маннит), замораживают и лиофилизируют. Средний размер частиц, определенный методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD (USA), составляет от 250 до 500 нм, что способствует эффективному всасыванию в желудочно-кишечном тракте [8]. Размер получаемых частиц зависит от вида полимера, стабилизатора эмульсии, их концентрации, а также от условий гомогенизации. Степень включения рифампицина в полимерные частицы составляет от 15 до 75%.

Состав 1 (по примеру 1) мас.% ПЛА 59,2 Рифампицин 8,5 Поливиниловый спирт 15,2 D-Маннит 17.1 Размер частиц 378±84 нм Состав 2 (по примеру 1) мас.% ПЛГА 50: 50 58,3 Рифампицин 8,3 Поливиниловый спирт 16,6 Лактоза 16,8 Размер частиц 281±73 нм Состав 3 (по примеру 1) мас.% ПЛГА 50:50 58,5 Рифампицин 8,4 Альбумин 15,8 D-Маннит 17,3 Размер частиц 324±57 нм

Оптимальное разбавление средства в воде соответствует соотношению от 1:20 до 1:10, что может быть использовано для регулировки дозирования препарата в зависимости от индивидуальных особенностей больного.

Лекарственное средство, полученное по п.1, может быть выполнено в виде таблетки, капсулы, гранулы, порошка или другой пероральной формы на основе известных технологий [9, 10].

Пример 2. Сравнительная фармакологическая эффективность оригинального лекарственного средства пролонгированного действия на основе рифампицина

Изучение влияния разработанного лекарственного средства на основе рифампицина на выживаемость и высеваемость М.tuberculosis в легких проведено на модели острого туберкулеза путем введения летальной дозы (М.tuberculosis штаммом H37Rv в дозе 5·10⁶/мышь). Введение лекарственного средства пролонгированного действия на основе рифампицина (РН), полученного по примеру 1, начинали через сутки после воспроизведения туберкулеза. Лекарственное средство вводили в течение 3 суток. В качестве сравнения проводили эксперименты в аналогичных условиях, где вместо нового препарата рифампицина использовали либо физиологический раствор (К), либо субстанцию рифампицина (Р). После завершения эксперимента животных подвергали эвтаназии действием гексенала, извлекали и гомогенизировали легкие, проводили посев для определения числа жизнеспособных М.Tuberculosis. Полученные данные представлены в таблице 1 и на чертеже.

Таблица 1 Сравнительная фармакологическая эффективность действия лекарственного средства пролонгированного действия на основе рифампицина Препарат Обозна-чение Доза Высеваемость М.tuberculosis в легких, число микобактерий, КОЕ*/мышь 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки Контроль (физ. раствор) К 1,0 мл (3,7±1,22)×10⁵ (1,6±0,06)×10⁷ (2,6±0,68)×10⁹ Рифампицин субстанция Р 20 мг/мышь (7,3±0,06)×10³ (1,7±0,17)×10⁵ (4,6±0,56)×10⁷ 20 Лекарственное средство на основе рифампицина РН 20 мг/мышь (1,2±0,2)×10³ (7,9±0,9)×10³ (2,03±0,08)×10⁵ 20 Рифампицин субстанция Р 10 мг/мышь (2,3±0,08)×10⁴ (1,3±0,16)×10⁶ (1,8±0,65)×10⁹ 10 Лекарственное средство на основе рифампицина РН 10 мг/мышь (6,3±0,07)×10³ (5,3±0,16)×10⁴ (1,06±0,06)×10⁶ 10 Примечание. В контроле вводили физиологический раствор в объеме, равном объему вводимого препарата; *КОЕ - колониеобразующая единица.

Из приведенных в таблице 1 и на чертеже данных видно, что полученный по примеру 1 препарат на основе рифампицина, обладая пролонгирующим действием, также значительно превосходит по активности исходную субстанцию - рифампицин. Особенно это наглядно проявляется через 14-й и 21-й день после начала эксперимента, а также при концентрации препаратов 10 мг/мышь, когда рифампицин (субстанция) практически перестает действовать на 21-й день. Это может позволить уменьшить терапевтическую дозу рифампицина и тем самым снизить уровень побочных токсических эффектов. Лечение острого экспериментального туберкулеза у мышей данным препаратом по разработанной схеме позволяет уменьшать содержание микобактерий в ткани легких более чем в 100 раз, по сравнению со свободным рифампицином, сократить кратность приема до 3 введений за счет пролонгированности действия разработанного препарата.

Пример 3. Токсикологическая характеристика оригинального лекарственного средства пролонгированного действия на основе рифампицина

Сравнительное исследование острого токсического действия субстанции рифампицина и разработанного полимерного препарата на его основе (состав по примеру 1) проводили на мышах-самцах линии Balb массой 19÷21 г к моменту испытаний. Мыши содержались в стандартных клетках №4, в условиях неограниченного доступа к воде и пище, при естественной смене освещенности. К испытанию токсического действия препаратов приступали после двухнедельного карантинирования животных. Препараты вводили в физиологическом растворе для теплокровных животных орально в желудок с помощью атравматического зонда. Наблюдения за действием препаратов производили на протяжении 14 дней от момента введения. В качестве контроля вводилась соответствующая масса полимерной композиции, полученной без действующего вещества, в эквиобъемном количестве физиологического раствора.

Определение значения средней летальной дозы ЛД₅₀ (при n=7 на каждую из испытанных доз, расчеты производили по методу Литчфилда и Уилкоксона [11]) показало, что значение ЛД₅₀ для разработанного препарата на основе рифампицина пролонгированного действия по примеру 1 составило 700 мг/кг, а для субстанции рифампицина 500 мг/кг. Следовательно, значение средней токсической дозы для новой лекарственной формы рифампицина оказалось достоверно выше (на 40%), а токсичность соответственно ниже, чем у исходного рифампицина.

Таким образом, полученное в виде наночастиц средство на основе рифампицина, обладающее пролонгированным действием, проявляет высокую специфическую активность против Mycobacterium Tuberculosis при пониженной токсичности, по сравнению с исходной лекарственной субстанцией. Такой результат позволяет заключить о росте терапевтической широты и увеличении терапевтического индекса при сокращении кратности приема препарата за счет пролонгированности его действия.

Разработанное лекарственное средство предлагается к выпуску в виде кишечно-растворимых таблеток или в капсулах.

Источники информации

1. РЛС - Энциклопедия лекарств / Гл. ред. Ю.Ф.Крылов, 8-е изд. М.: «РЛС-2001», 2000. С.766-767.

2. Фанг Д., Сингх М., О'Хейган Д., Хора М. Композиции микрочастиц и способы их получения // Патент РФ №2257198 С2. - Опубл. 27.07.2004 г.

3 Pandey R., Khuller G.К. Oral nanoparticle-based antituberculosis drug delivery to the brain in an experimental model // Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2006, V.57 (6). P.1146-1152.

4. Pandey R., Sharma A., Zahoor A. et al. Poly (DL-lactide-co-glycolide) nanoparticle-based inhalable sustained drug delivery system for experimental tuberculosis // Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003. V.52 (6). P.981-986.

5. Esmarili F., Hosseini-Nasr М., Rad-Malekshahi М. et al. Preparation and antibacterial activity evaluation of rifampicin-loaded poly lactide-co-glycolide nanoparticles // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 2007, V.3 (2).P. 161-167.

6. Ul-Ain Q., Sharma S., Khuller G.K. Chemotherapeutic Potential of Orally Administered Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microparticles Containing Isoniazid, Rifampin and Pyrazinamide against Experimental Tuberculosis // Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2003. V.47 (9). P.3005-3007.

7. Barrow E.L.W., Winchester G.A., Staas J.K. et al. Use of Microsphere Technology for Targeted Delivery of Rifampin to Mycobacterium tuberculosis-Infected Macrophages // Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998. V.42 (10). P.2682-2689.

8. Вранккс А., Демутье М., Делеер М. Фармацевтический состав, содержащий нанокапсулы, и способ его получения // Патент РФ № 2145498 C1. - Опубл. 20.02.2000 г.

9. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм: Учебник для вузов / Под ред. И.И.Краснюка и Г.В.Михайловой. Изд. 3-е. перераб. и доп. М.: Изд-во "Академия", 592 С.

10. Microencapsulation: Methods and Industrial Applications / Ed. S. Benita. 2nd ed. Taylor & Francis Group. 2006. 747 p.

11. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / 2-е изд. перераб. и доп. Л.: Медгиз, 1963. С.81-106.

Изобретение относится к области фармакологии и медицины и представляет собой лекарственное средство пролонгированного действия для лечения резистентных форм туберкулеза на основе рифампицина, отличающееся тем, что представляет собой стабильные наночастицы и содержит рифампицин, биодеградируемый полимер молочной кислоты или сополимер молочной и гликолевой кислот, а также поверхностно-активное вещество, криопротектор, при этом компоненты в средстве находятся в определенном соотношении в мас.%. Изобретение обеспечивает снижение риска возникновения токсических эффектов, пролонгированное действие, снижение кратности приема при лечении. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Лекарственное средство пролонгированного действия для лечения резистентных форм туберкулеза на основе рифампицина, отличающееся тем, что представляет собой стабильные наночастицы и содержит рифампицин, биодеградируемый полимер молочной кислоты или сополимер молочной и гликолевой кислот, а также поверхностно-активное вещество, криопротектор при следующем соотношении компонентов в мас.%:
рифампицин 1-10 биодеградируемый полимер молочной кислоты   или сополимер молочной и гликолевой кислот 20-60 поверхностно-активное вещество и криопротектор остальное

2. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве биодеградируемого полимера содержит полимер молочной кислоты или сополимер молочной и гликолевой кислот или сополимер молочной и гликолевой кислот со свободной карбоксильной группой.

3. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве криопротектора содержит D-маннит или лактозу, или глюкозу.

4. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества содержит поливиниловый спирт или полисорбат 80, или полоксамер 188, или сывороточный альбумин.

5. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что представляет собой наночастицы размером от 250 до 500 нм.

6. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что выполнено в виде таблетки или капсулы, или гранулы, или порошка, или другой пероральной формы.