СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АРАБИНОГАЛАКТАНА, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ И ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2008 года по МПК C07H3/02 C08B37/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, медицине, фармакологии и касается получения сульфатированных биополимеров на основе арабиногалактана, обладающих антикоагулянтной и гиполипидемической активностью. Арабиногалактан, основной полисахарид лиственницы сибирской, является нетоксичным продуктом и рекомендуется к использованию в пищевой промышленности (А.Б.Мулин. Разработка технологии получения мучных кондитерских изделий с использованием арабиногалактана. (Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук М., 1998)). Полифункциональность и водорастворимость арабиногалактана позволяет рассматривать его в качестве перспективного синтона для синтеза различных соединений, в том числе фармацевтических и медицинских препаратов.

Описывается способ получения сульфатированных производных арабиногалактана, выделенного из лиственницы сибирской, путем его взаимодействия с сульфатирующей смесью в присутствии свежеперегнанного диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 30 минут при температуре 20°С с дальнейшей его нейтрализацией или упариванием и высаживанием в этиловый спирт. Сульфатирующая смесь представляет собой комплекс SO₃-диметилформамид, полученный путем перегонки газообразного триоксида серы (SO₃) из олеума в свежеперегнанный диметилформамид (ДМФА). Содержание SO₃ в ДМФА составляет не менее 18%.

Описаны сульфатированные производные арабиногалактана формулой AG-SO₃R,

где AG-арабиногалактан,

SO₃R - сульфатная группировка,

R=H - кислотная форма сульфатированного производного AG,

R=Me - солевая форма, где Me - металлы I и II групп.

Степень замещения макромолекулы биополимера в пересчете на количественное содержание серы составляет 8.1-12.65%.

Указанные соединения водорастворимы, проявляют мембранотропные свойства, т.е способны доставлять лекарственные вещества в клетку (Arabinogalactan derivatives and uses thereof. C.Jung, P.Enriques, S.Palmacci, L.J.Josephson, J.M.Lewis. US Patent 5478576) и обладают антикоагулянтной и гиполипидемической активностью.

Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее частой причиной смертности в индустриально-развитых странах и стоят на втором месте после смертности от инфекционных болезней. В основе их патогенеза лежат атеросклеротические изменения сосудов, возникающие в результате нарушения системы гемостаза, ухудшения реологических свойств крови и нарушения липидного обмена в организме. Возможным подходом к решению проблемы профилактики и лечения атеросклероза, а также ишемической болезни сердца является использование средств, обладающих антиатерогенной активностью, т.е. уменьшающих или предупреждающих атеросклеротическое повреждение кровеносных сосудов. Одним из таких препаратов является гепарин, однако широкое применение его в качестве антиатерогенного средства существенно ограничивается коротким временем полужизни в организме, а также глубокой и продолжительной гипокоагуляцией (опасность развития кровотечений). Кроме того, высокая себестоимость производства гепарина (для получения 1 кг гепарина необходимо переработать до 10 тонн легких крупного рогатого скота) привела к поиску его синтетических и природных аналогов. На сегодняшний день известно, что антиатерогенной активностью в большей или меньшей степени обладают различные сульфатированные полисахариды как природного (хондроитинсульфаты и другие сульфатированные гликозаминогликаны), так и синтетического (сульфаты декстрана, сульфаты хитозана и т.д.) происхождения. Так как они содержат в своем составе, подобно гепарину, O-сульфатные группировки, ведущая роль которых в проявлении антиатерогенной активности на сегодняшний день является доказанной (Розкин М.Я., Левина М.Н., Ефимов B.C., Усов А.И. // Фармакол. и токсикол. - 1991. - Т.54. - №5. - С.40-42. и Berngtsson G., Olivercona Т., Hook M. et al. // Biochem. J. - 1980. - Vol.189. - №3. - P. 625-633.).

Известен способ получения сульфатированного производного AG как в кислотной, так и в солевой формах (Chemical Abstracts 1968, vol.69, №11, 44182q). В качестве сульфатирующих смесей используются комплексы SO₃-пиридин (1), SO₃-триэтиламин (2). При этом сульфатирование AG при помощи комплекса (1) происходит в течение 3 часов при 70°С, а при помощи комплекса (2) - в течение 3 часов при 50-55°С, затем 2 часа при 20°С. Этот способ имеет ряд недостатков.

1. Получение комплекса SO₃-пиридин производят путем добавления хлорсульфоновой кислоты к избытку пиридина. При этом кроме сульфатирующего комплекса образуется побочный продукт пиридинийхлорид, присутствие которого трудно устранимо.

2. Наличие в реакционной смеси пиридинийхлорида ведет к получению сульфатированных производных полисахарида пониженной физиологической активности.

3. Комплекс SO₃-пиридин получают непосредственно в ходе реакции сульфатирования, что не позволяет осуществлять его стандартизацию.

4. Сама реакция сульфатирования этим комплексом проводится при высокой t=70°С в течение длительного времени (3 часа), что приводит к деградации молекулы полисахарида.

5. При использовании 1 и 2 сульфатирующих смесей встает проблема устранения стойкого неприятного запаха конечных продуктов, к тому же комплекс SO₃-триэтиламин является очень токсичным.

Другой известный в литературе способ получения сульфатированного производного AG (Kamitakahara H., Mikawa Y., Hori M., Tsujihata S., Minato K., Nakatsubo F. Syntheses, characterization, and biological activities of sulfated polysaccharides // 10^th Int. Symp. on Wood Pulp Chem. Yokohama, Japan. 1999. Vol.2. P. 238-241) заключается в сульфатировании AG комплексом SO₃-пиридин в присутствии ДМФА при t=20°С в течение нескольких дней. Затем реакционную смесь нейтрализуют 2N NaOH, очищают полученный продукт ГПХ (гельпроникающей хроматографией) на биогеле Р-6 (элюент - вода) или диализом против дистиллированной воды в течение нескольких дней.

Этот способ также имеет ряд недостатков.

1. В качестве растворителя как сульфатирующей смеси, так и самого AG используется диметилформамид. AG в диметилформамиде не растворяется, следовательно, образуется гетерогенная система синтеза, что снижает эффективность реакции.

2. Сульфатирование при t=20°С, но в течение длительного времени приводит к деградации молекулы AG.

Целью предлагаемого изобретения является синтез сульфатированных производных арабиногалактана в кислотной и солевой формах, обладающих антикоагулянтной и гиполипидемической активностью.

Техническим результатом данного изобретения является то, что для получения сульфатированных производных использовался полисахарид AG, выделенный из лиственницы сибирской, его полифункциональность, водорастворимость и мембранотропность являются явными преимуществами по сравнению с другими синтонами (целлюлоза, хитин, хитозан и т.д.), использующимися для синтеза биологически активных веществ.

Для синтеза использовали арабиногалактан, который был получен в лабораторных условиях из водного экстракта древесины лиственницы сибирской и очищен переосаждением в спирт и сульфатирующую смесь в виде комплекса SO₃-ДМФА с концентрацией SO₃≥18%.

Молекула арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской, имеет разветвленную структуру и молекулярную массу порядка 15-20 кД. Основная цепь макромолекулы биополимера представлена галактановым кором, а звенья D-галактопиранозы связаны β-1,3-связями, большинство звеньев галактозы имеет боковые ответвления при С-6. Боковые цепи содержат 3,6-ди-О- и 6-O-замещенные остатки β-D-галактопиранозы и 3-O-замещенные остатки β-L-арабинофуранозы. Концевыми невосстанавливающимися остатками являются β-D-галактопираноза, β-D-арабинофураноза и β-L-арабинопираноза. Соотношение галактозы и арабинозы составляет 7,5:1, две третьи остатков арабинозы присутствует в фуранозной форме, одна треть - в пиранозной. Уроновые кислоты в арабиногалактане лиственницы сибирской не обнаружены.

Арабиногалактаны присутствуют практически во всех хвойных видах древесины, однако они отличаются друг от друга строением, а именно типом связывания моносахаридных звеньев, их соотношением и, как следствие, физико-химическими свойствами: растворимостью в воде, молекулярной массой, степенью полидисперсности, полифункциональностью.

Отличительными особенностями арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской, являются полифункциональность, водорастворимость и мембранотропность макромолекулы биополимера, что служит явными преимуществами по сравнению с другими синтонами, использующимися для синтеза биологически активных веществ. Кроме того, в древесине лиственницы сибирской арабиногалактан присутствует в максимальном для хвойной древесины количестве 10-25%, в связи с чем лиственница сибирская служит надежным источником его получения.

Поставленная цель достигается тем, что к раствору AG в ДМСО в соотношении (1:3) добавляли при перемешивании комплекс SO₃-ДМФА с концентрацией SO₃≥18%. Сульфатирование проводили в течение 30 минут при t=20°С при непрерывном перемешивании. После этого реакционную смесь нейтрализовали 10% водным раствором щелочи (KOH, NaOH, CaOH, ВаОН и т.д.) по универсальному индикатору и высаживали в этиловый спирт.

Полученную соль сульфатированного производного арабиногалактана очищали диализом против дистиллированной воды. Затем диализируемый раствор упаривали до минимального объема и высаживали в этиловый спирт.

Сульфатированное производное AG в кислотной форме получали без нейтрализации реакционной смеси. Для этого ее упаривали до минимального объема и высаживали в этиловый спирт, осадок промывали этиловым спиртом на стеклянном пористом фильтре №40 от остатков сульфатирующей смеси и ДМСО.

Полученные препараты водорастворимы и проявляют мембранотропные свойства, как и природный AG. MM полученных производных определяли методом ГПХ на сефадексе G 100, элюентом служил 0,3% водный раствор NaCl.

Содержание сульфатных группировок в полученных препаратах определяли в пересчете на количественное содержание серы титриметрическим методом (барийметрией) с использованием специфических реагентов. Количественный анализ полученных заявляемым способом препаратов показал, что в зависимости от формы (кислотной или солевой) сульфатированного производного арабиногалактана степень замещения макромолекулы биополимера в пересчете на количественное содержание серы составляет 8.1-12.65%. Наличие сульфатной группировки и проведенная химическая обработка не вызывают деградацию полимерной матрицы. (ММ_{кислотной формы}=22,8 кД, ММ_{солевой формы}=15,7-22,1 кД)

Предлагаемый способ характеризуется следующими преимуществами:

- синтез проводят в гомогенной среде (AG растворяется в ДМСО),

- при низкой температуре реакции (20°С) и малой продолжительности воздействия сульфатирующего комплекса на AG (30 минут),

- в качестве сульфатирующей смеси используется комплекс SO₃-ДМФА, его преимуществами являются:

- стабильность при хранении (от 0 до +4°С), за 6 месяцев хранения концентрация SO₃ в комплексе снижается на 1%;

- возможность стандартизации и постоянного контроля за содержанием SO₃ в комплексе как в ходе получения, так и при его хранении;

- высокая реакционная способность вследствие того, что ДМФА является очень слабым основанием (слабее, чем пиридин);

- удобство в использовании (комплекс SO₃-ДМФА - это жидкость от желтого до оранжевого цвета в зависимости от содержания SO₃, которую можно отбирать обыкновенной пипеткой).

Разработанный метод синтеза позволяет получить сульфатированные производные AG как в кислотной, так и в солевой формах с различным набором катионов. При этом молекулярная масса полученных производных существенно не отличается от природной матрицы (MM_AG=15-20 кД, ММ_{кислотной формы}=22,8 кД, ММ_{солевой формы}=15,7-22,1 кД).

Полученные сульфатированные производные AG сохраняют структурную организацию, водорастворимость и мембранотропность природного полисахарида, обладают антикоагулянтной и гиполипидемической активностью.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1.

1 г AG растворяли при перемешивании в 3 мл ДМСО, затем добавляли 10 мл комплекса SO₃-ДМФА с концентрацией SO₃≥18%. Сульфатирование проводили при интенсивном перемешивании при t=20°С в течение 30 минут. После этого реакционную смесь нейтрализовали 26 мл 10% водного раствора KOH и высаживали в 500 мл этилового спирта. Полученный осадок отфильтровывали на стеклянном пористом фильтре №40, растворяли в 50 мл дистиллированной воды и подвергали диализу против дистиллированной воды в течение 6 суток. Диализируемый раствор упаривали до 30 мл и высаживали в 150 мл этилового спирта. Выход полученного продукта составил 95%, степень замещения макромолекулы биополимера в пересчете на количественное содержание серы составила 10.3%. MM=15,7 кД.

Пример 2.

1 г AG растворяли при перемешивании в 3 мл ДМСО, затем добавили 10 мл комплекса SO₃-ДМФА с концентрацией SO₃≥18%. Сульфатирование проводили при интенсивном перемешивании при t=20°С в течение 30 минут. После этого реакционную смесь упаривали до минимального объема и высаживали в 500 мл этилового спирта. Полученный осадок отфильтровывали и промывали на стеклянном пористом фильтре №40 этиловым спиртом. Выход полученного продукта составил 90%, а степень замещения макромолекулы биополимера в пересчете на количественное содержание серы - 8.1%. MM=22,8 кД.

Пример 3.

1 г AG растворяли при перемешивании в 3 мл ДМСО, затем добавляли 10 мл комплекса SO₃-ДМФА с концентрацией SO₃≥18%. Сульфатирование проводили при интенсивном перемешивании при t=20°С в течение 30 минут. После этого реакционную смесь нейтрализовали 17 мл 10% водного раствора Са(ОН)₂ и высаживали в 500 мл этилового спирта. Полученный осадок отфильтровывали на стеклянном пористом фильтре №40, растворяли в 50 мл дистиллированной воды и подвергали диализу против дистиллированной воды в течение 6 суток. Диализируемый раствор упаривали до 30 мл и высаживали в 150 мл этилового спирта. Выход полученного продукта составил 98%, степень замещения макромолекулы - гипохолестеринемическое действие (фиг.2), атерогенные липопротеиды (β-липопротеиды) - антиатерогенная активность (фиг.3).

На фиг.1 представлена антикоагулянтная активность сульфатированного арабиногалактана.

Как видно из данных, представленных на фиг.2, калиевая соль сульфатированного арабиногалактана снижает уровень общего холестерина сыворотки крови (ХС общ.) на 4,9%, сульфатированный арабиногалактан в кислотной форме - на 4,2%, в то время как гепарин снижает этот показатель всего на 0,8%. Гиполипидемическое действие сульфатированного арабиногалактана проявляется и в снижении уровня атерогенных липопротеидов (β-ЛП) (фиг.3), так кислотная форма уменьшает этот показатель на 4,2%, в то время как калиевая соль - на 8,3%, гепарин снижает атерогенные липопротеиды на 2,1%.

Таким образом, солевая форма сульфатированного арабиногалактана (калиевая соль) обладает ярковыраженной антикоагулянтной и гиполипидемической активностью, сопоставимой с таковой гепарина, кислотная форма сульфатированного арабиногалактана проявляет гиполипидемическую активность при отсутствии существенного влияния на свертывание крови.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу получения сульфатированных биополимеров на основе арабиногалактана (АГ) - основного полисахарида лиственницы сибирской. Описывается способ получения сульфатированных производных арабиногалактана взаимодействием арабиногалактана в диметилсульфоксиде при соотношении 1:3 с сульфатирующим агентом- комплексом SO₃-диметилформамид с концентрацией SO₃≥18%. Способ ведут при непрерывном перемешивании и постоянной температуре 20°С в течение 30 минут с дальнейшим выделением целевого продукта как в кислотной, так и в солевой формах. Степень замещения макромолекулы биополимера в пересчете на количественное содержание серы составляет 8.1-12.65%. Полученные сульфатированные производные АГ сохраняют структурную организацию, водорастворимость и мембранотропность природного полисахарида, а также проявляют высокую физиологическую - антикоагулянтную и гиполипидемическую активность. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения сульфатированных производных арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской, путем взаимодействия арабиногалактана в растворителе с сульфатирующим агентом при непрерывном перемешивании и постоянной температуре 20°С в течение 30 мин с дальнейшим выделением продукта, отличающийся тем, что взаимодействию подвергают раствор арабиногалактана в диметилсульфоксиде при их соотношении 1:3, а в качестве сульфатирующей смеси используют комплекс SO₃ - диметилформамид с концентрацией SO₃≥18%.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение продукта производят нейтрализацией гидроксидами металлов I и II групп или упариванием реакционной смеси, а затем высаживанием в этиловый спирт.