ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СПОСОБНОСТЬЮ АКТИВИЗИРОВАТЬ РЕГЕНЕРАТОРНО-РЕПАРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА Российский патент 2004 года по МПК A61K31/715 A61P1/04 

Изобретение относится к биологии и биотехнологии, в частности к новым соединениям, выделенным из растительных клеток, и может быть использовано в медицине и ветеринарии как лекарственное средство, усиливающее регенераторно-репаративные процессы в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, а также в биологии и медицине для научно-исследовательских целей.

Известен препарат ликвиритон (Врачебн. дело, 1978, №3, с.84-86), содержащий сумму флавоноидов из корней и корневищ солодки уральской или солодки голой. Однако препарат эффективен главным образом при не осложненной язвенной болезни, проявляющейся в секреторно-моторных расстройствах, и имеет длительный курс лечения.

Известен также бефунгин - экстракт из грибных наростов (березовый гриб - чага), образуемых фитопатогенным паразитом березы, с добавлением 1% кобальта хлорида или 1,5% кобальта сульфата. При длительном применении возможны побочные эффекты в виде диспептических явлений (Радбил О.С., "Фармакотерапия в гастроэнтерологии". М.: Медицина, 1991, с.183-184).

Из бутонов Hibiscus sabdariffa L. выделен нейтральный полисахарид - арабиногалактан (Planta Med., 1992, Feb. 58:1:60-7). Основная цепь соединения состоит из α-1,4 галактозы и α-1,2 рамнозы. Боковые цепи построены из галактозы и арабинозы, которые соединяются с основной цепочкой через С-4 атом каждой третьей рамнозы. Полисахарид имеет молекулярную массу 10⁵ Да и проявляет некоторую иммуномодулирующую активность.

Известный полисахарид из Hibiscus sabdariffa L. не влияет на репаративные процессы, что ограничивает область его применения.

Целью изобретения является создание нового вещества, активизирующего регенераторно-репаративные процессы в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта.

Сущность изобретения заключается в том, что из водного экстракта проростков картофеля выделяется новое вещество - полисахарид, арабиногалактановой природы - "ульцэп", представляющий собой порошок, имеющий беловато-сероватую окраску.

Ульцэп имеет мол.м. 70±10 кДа, содержит полисахаридную цепь, состоящую из (в маc.%): остатков сахаров 30,3-71, арабинозы 9,7-23,5, галактозы - 23,3-37,5, уроновых кислот 2,3-9,7, и не менее 9% белка.

Ульцэп растворим в водных и солевых растворителях таких, как изотонический раствор натрия хлорида, физиологические среды и нерастворим в органических растворителях таких, как эфир, хлороформ, ацетон, спирт, диметилсульфоксид.

УФ-спектр ульцэпа имеет основной максимум в области 220 нм.

Раствор 1 мг ульцэпа в 1 мл деионизованной воды имеет рН 4-6.

Ульцэп имеет структуру, отличную от структуры полисахарида из Hibiscus sabdariffa L., так как он характеризуется наличием белка в его структурной организации.

Детектирование белка ульцэпа было проведено в полиакриламидном геле с помощью гель-электрофореза.

Для гель-электрофореза использовали 7,5% полиакриламид, содержащий 2,5% бисакриламида в присутствии 1% додецилсульфата натрия (Laemmli, U.K. Nature (London) (1970), 227, 680-685).

Для идентификации полосы белка, входящего в состав ульцэпа, исследуемое вещество наносили в лунки гелевого блока. После проведения электрофореза гелевый блок окрашивали раствором, содержащим 50% метанола, 10% уксусной кислоты и 0,125% кумасси марки R-250. Куски геля обесцвечивались в течение 72 ч раствором, содержащим 5% метанола и 7% уксусной кислоты. Для оценки молекулярного веса в качестве маркеров были использованы: бычий сывороточный альбумин (67 кДа), куриный овальбумин (45 кДа), глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа из мышцы кролика (36 кДа), трипсиноген из бычьей поджелудочной железы (24 кДа) ультрафиолетового света. Полиакриламидный гель с полосами, окрашенными на белок, сканировали на сканнере "Arcus II, AGFA". Для ульцэпа характерно наличие белковой полосы в зоне соответствующей молекулярной массе белка 70 кДа.

Предположительно именно это отличие сообщает новое свойство ульцэпу, которое проявляется в активизации регенераторно-репаративных процессов в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта.

Возможность осуществления изобретения приведена на примере получения ульцэпа из проростков картофеля.

Клубни картофеля закладывали в темную комнату с влажной атмосферой при 37°С. Через 3-4 недели с проросших клубней собирали ростки. Промывали проточной водой и сушили на воздухе.

Чистые, сухие ростки картофеля измельчали электрической мясорубкой и полученный гомогенат заливали кипящей дистиллированной водой в соотношении 1:1 (w:w) при постоянном перемешивании. Затем клеточный дебрис удаляли отжимом, а водный экстракт центрифугировали при 4000 g в течение 20 мин.

К полученному охлажденному до 0-2°С супернатанту медленно добавляли холодный (-10°С) ацетон, до концентрации 50% (v:v). Образовавшуюся муть удаляли центрифугированием 4000g в течение 20 мин. Затем концентрацию ацетона увеличивали до 70% и повторным центрифугированием собирали осадок. Осадок растворяли в воде и вновь осаждали ацетоном по указанной схеме. Процедуру повторяли дважды. Фракцию, осаждаемую в интервале концентраций ацетона 50-70%, растворяли в воде, диализовали против дистиллированной воды при 4°С и высушивали лиофильно.

Навеску, полученную после высушивания, растворяли в минимальном объеме дистиллированной воды, наносили на колонку (1,7 см×14 см) DEAE-650 S TSK (Whatman). Элюирование осуществляли линейным градиентом 0,1 М-1 М KCl. Детектирование проводили при 220 нм.

Основной пик вещества собирали и высушивали на лиофильной сушке.

Было проведено изучение антиульцерогенных свойств ульцэпа на двух моделях, у крыс: 1) модель "резерпиновых язв" желудка и 2) после 22-часовой иммобилизации по методу Селье Г.

В первой модели крысы, предварительно, в течение 24 часов, голодали в индивидуальных клетках при свободном доступе к питьевой воде. Язвенные повреждения желудка вызывали путем внутрибрюшинного введения резерпина в дозе 8 мг/кг. Животным опытной группы за 5 часов до введения резерпина, и, одновременно с введением резерпина инъецировали подкожно ульцэп в исследуемых дозах, а животным контрольной группы - физиологический раствор. Забой животных осуществляли через 18 часов после введения резерпина. В изолированный желудок с наложением на пищевод и привратник лигатурами вводили 6 мл 2% формалина для фиксирования слизистой. В желудках, раскрытых по большой кривизне, фиксировалось наличие язв с помощью бинокулярной лупы при 8-кратном увеличении. В качестве референс-препарата был использован глицирам. В результате эксперимента было установлено, что число животных с кровоизлияниями в слизистой желудка было на 30% меньше при лечении ульцэпом, чем глицирамом и на 50% меньше, чем у контрольных животных. Количество животных с язвами было в 3 раза меньше при лечении ульцэпом, чем при лечении глицирамом и в 5 раз меньше контрольных животных.

Во второй модели эксперименты проводили на крысах с 22-часовой иммобилизацией. Ульцэп вводили за 1 час до иммобилизации. Через 22 часа производили забой животных. Поверхности слизистых извлеченных желудков тщательно просматривались через бинокулярную лупу с увеличением 8. У контрольных животных изменения в слизистой желудка наблюдали в 100% случаев. В основном это были точечные кровоизлияния на складках слизистой, гиперемия слизистой, огрубления складок. В результате было установлено, что при введении ульцэпа воспалительные признаки и кровоизлияния на слизистой желудка в 50-75% случаев отсутствовали, тогда как при лечении глицирамом эффект был лишь в 20-25% случаев.

Результаты опытов показывают, что действие ульцэпа в качестве активатора регенераторно-репаративных процессов в слизистой оболочке желудка проявляется не только в терапевтическом, но и в защитном эффекте.

В токсикологических опытах было установлено, что вещество ульцэп не токсично как при введении животным (мыши, собаки) в больших дозах, в 100 и 1000 раз превышающих терапевтическую дозу, так и при добавлении в культуру лимфоцитов in vitro. При этом каких-либо отрицательных воздействий на слизистую желудка и кишечника обнаружено не было.

Заявленное вещество класса полисахаридов может использоваться в медицинской и ветеринарной практике как лекарственное средство для активизации регенеративно-репаративных процессов в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта. Описан способ получения вещества из растительных клеток на примере его выделения из проростков картофеля. Вещество представляет собой полисахаридную цепь (в мас.%) остатков сахаров 30,3-71, арабинозы 9,7-23,5, галактозы 23,3-37,5, уроновых кислот 2,3-9,7, белка не менее 9%. Вещество нетоксично и проявляет протективное и терапевтическое воздействие на регенерацию слизистой желудочно-кишечного тракта при воспалительных и язвенных заболеваниях, и расширяет арсенал средств указанного назначения.

Вещество, обладающее способностью активизировать регенераторно-репаративные процессы в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, характеризующееся тем, что оно выделено из водного экстракта проростков картофеля, имеет молекулярную массу 70±10 кД и представляет собой полисахаридную цепь, состоящую из, мас.%: остатков сахаров 30,3-71, арабинозы 9,7-23,5, галактозы 23,3-37,5, уроновых кислот 2,3-9,7 и не менее 9% белка, при этом вещество нерастворимо в органических растворителях и растворимо в водных и солевых растворителях.