СПОСОБ ЦИТОМЕТРИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к гистологии, патогистологии, урологии и онкологии.

Основным методом диагностики рака предстательной железы является полифокальная биопсия с последующим патогистологическим анализом. Отмечая ее высокую информативность, следует также указать на трудоемкость и на то, что и она не всегда обеспечивает 100% надежность. Это может быть обусловлено как малым размером опухоли, так и наличием соответствующего оборудования и квалификацией медперсонала.

И в этой связи определенный интерес представляет цитологическое исследование сока простаты. Так как интраэпителиальная неоплазия и рак простаты на начальных стадиях являются локализованными процессами, можно предположить, что эпителиальный компонент сока простаты в этих случаях будет представлен как неизмененными клетками, так и с признаками неоплазии и малигнизации.

Имея ввиду определенные ограничения, накладываемые на массаж простаты при подозрении на рак, необходимо указать, что в практике встречаются случаи, когда при цитологическом исследовании сока простаты, к примеру, по поводу простатитов возникает необходимость в дифференциальной диагностике.

Известные способы цитологической диагностики заболеваний основаны на классической панхроматической окраске клеток и их визуальном анализе. Определенным недостатком данных подходов является то, что их разрешающая способность не позволяет в ряде случаев дифференцировать тяжелые диспластические изменения клеток при доброкачественных заболеваниях и высокодифференцированные формы рака. В этих случаях на помощь приходят новые методы окраски клеток и количественный, морфометрический анализ [Автандилов Г.Г. "Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина 1990 - 384 с.; Автандилов Г.Г., Глухов Ю.К. и Шабалова И.П. Плоидометрическая диагностика предраковых процессов и рака шейки матки по цитологическим препаратам // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №3. - С.45-47, Новик В.И., Агроскин Л.С., Папаян Г.В. и др. Биометрические исследования в диагностике предопухолевых состояний и эндоцервикального рака. // Архив патологии. 1989, №12, с.45-49; Погорелов В.М., Байдурин С.А., Капланская И.Б. и др. Морфометрические параметры злокачественных клеток при нелейкемических гемобластозах с первичным поражением лимфатических узлов. // Гематология и трансфузиология, 1992, №3, с.5-10; Bittinger A, von Keitz A., Ruschoff J., Melekos M.D. Silver staining nucleolar organizer region in prostate cytology. // Zentralbl Pathol. 1994. Mar. 140 (1): 103-6].

Однако следует упомянуть, что в этих работах даются, как правило, усредненные, групповые метрические характеристики клеточных популяций в целом, что делает весьма затруднительным идентификацию единичных злокачественных клеток. В этой связи становится актуальным разработка способов морфометрической идентификации таких клеток в препаратах секрета простаты, что будет способствовать повышению качества диагностики рака предстательной железы.

Наиболее близким аналогом нашего предложения является работа В.И.Цыганкова, Н.П.Мельниковой Н.П. и Г.Л.Могилевой [Морфотипы железистого эпителия при добро- и злокачественных заболеваниях молочных желез. // Клиническая лабораторная диагностика. 2004, №1. - С.43-45], в которой авторам, анализируя цитологический материал молочной железы, окрашенный 50% раствором азотнокислого серебра, удалось разделить популяцию ядер на 6 морфотипов, увязав их с определенными клинико-морфологическими диагнозами. Показано, что для рака молочной железы характерны морфотипы ядер, не встречающиеся при дисплазиях, и на этом основании высказывается мнение, что их обнаружение может указывать на наличие рака. Данный подход имеет интерес для диагностики, когда среди массива доброкачественных клеток присутствуют единичные злокачественные клетки. Несомненным плюсом данного подхода является и то, что к клеткам, окрашенным 50% раствором азотнокислого серебра, затруднительно применение критериев визуальной диагностики, используемые для клеток, окрашенных классическими цитологическими красителями.

Недостатком же данного прототипа является то, морфометрические параметры даны для клеток пунктатов молочной железы, что исключает их использование для анализа цитологических препаратов предстательной железы.

Задача изобретения - разработка цитометрических подходов к дифференциальной диагностике доброкачественной гиперплазии, простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН), рака, а также цитометрической идентификации редких атипичных клеток в цитологических препаратах предстательной железы.

Указанная задача решается следующим образом. Клеточные отпечатки биоптатов предстательной железы 27 пациентов фиксировались спиртом и окрашивались для выявления ядрышковых организаторов 50% раствором AgNO₃. Измерения проводили с помощью анализатора изображений "Мекос-Ц". Группировку препаратов (доброкачественная гиперплазия, интраэпителиальная неоплазия и рак простаты) проводили на основании данных патогистологического исследования. Данные результатов измерений статистически обрабатывались в программе «Statistica 5».

Проведенное морфометрическое исследование показало, что при доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) площадь ядер составляет 35,74±7,52 мкм², а ядрышек - 1,88±0,53 мкм². При простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) площадь ядер эпителиальных клеток возрастает до 46,88±3,55, а ядрышек - до 3,94±0,39 мкм². Среднее число ядрышек и значения ядрышково-ядерного отношения при ПИН также статистически достоверно превышают соответствующие показатели ДГПЖ (р<0,01). При раке предстательной железы средние значения всех исследованных морфометрических параметров статистически достоверно превышают аналогичные показатели не только ДГПЖ, но и ПИН (табл.1).

Показатель корректной классификации всех случаев на основе дискриминантного анализа значений четырех морфометрических показателей составил 100%.

Все исследованные 1122 ядра цитологических препаратов 27 пациентов с помощью процедур кластерного анализов были разбиты на 6 групп. Число групп было подобрано эмпирически, при выборе которого придерживались двух ограничений: первое - это чтобы их число было довольно большим, и второе - чтобы разделение значений ядерно-ядрышковых параметров клеток не было излишне дробным, т.е. чтобы значения соседних групп достаточно существенно отличались друг от друга. Первичное разделение клеток проводилось на основе кластерного анализа (K-means) значений суммарной площади ядрышек, результаты которого были в дальнейшем использованы для дискриминантного разделения клеток по четырем морфометрическим показателям. Каждая группа представляет собой совокупность клеток определенного морфотипа с близкими значениями морфометрических параметров (табл.2). Показатель общей корректной классификации составил 98,31%.

И хотя средние величины ядер каждого морфотипа статистически достоверно отличаются друг от друга, но крайние значения как по min и max, так и по величинам 25 и 75%% квартилей перекрывают значения соседних морфотипов, что делает затруднительным их идентификацию на основе только лишь анализа площадей ядер или ядрышек (табл.3).

Многопараметрическое же описание ядерно-ядрышкового аппарата и разделение на его основе с помощью дискриминантного анализа позволяет выявить качественное своеобразие представительства ядер различных морфотипов при доброкачественной гиперплазии (ДГПЖ), интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и раке предстательной железы. Так при ДГПЖ встречаются ядра 1 -3 морфотипов, при ПИН появляются ядра 4 морфотипа, а при раке - 5 и 6 морфотипов (табл.4).

Преимущества предлагаемого по изобретению способа:

- повышение качества диагностики опухолевых заболеваний простаты на основе компьютерной морфометрии ядерно-ядрышкового аппарата клеток в цитологических препаратах секрета железы;

- возможность идентификации редких, единичных злокачественных клеток, на основе цитометрической классификации морфотипов ядер;

- данный метод не требует дорогих реактивов, технически прост и его проведение с выдачей результатов возможно в течение одного-двух дней.

ПРИМЕРЫ ДИАГНОСТИКИ:

Пример 1. Наблюдение №165. Морфологический диагноз: доброкачественная гиперплазия предстательной железы. Морфометрические измерения: площадь ядер 39,68±1,31 мкм²; площадь ядрышек 1,68±0,09 мкм². Морфотипы ядер: I - 73,2%; II - 26,8%.

Пример 2. Наблюдение №184. Морфологический диагноз: простатическая интраэпителиальная неоплазия.

Морфометрические измерения: площадь ядер 45,41±1,28 мкм²; площадь ядрышек 3,40±0,19 мкм². Морфотипы ядер: I - 26,3; II - 39,4; III - 20, 2%; IV-14, 1%.

Пример 3. Наблюдение №229. Морфологический диагноз: рак предстательной железы. Морфометрические измерения: площадь ядер 84,07±3,46 мкм²; площадь ядрышек 9,49±0,63 мкм². Морфотипы ядер: I - 7,0%; II - 2,3%; III - 9,3%; IV - 13,9%; V - 53,5%; VI - 14,0%.

Таблица 1Морфометрические параметры (М±ско) ядерно-ядрышкового аппарата эпителиальных клеток при доброкачественной гиперплазии (ДГПЖ), интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и раке предстательной железыДиагнозnМорфометрические показателиЧисло ядрышекПлощадь ядер, мкм²Площадь ядрышек, мкм²Ядрышково-ядерное отношениеДГПЖ81,52±0,4735,74±7,521,88±0,530,054±0,008ПИН92,00±0,21*46,88±3,55*3,94±0,33*0,0841±0,009*Рак103,57±0,81*/**87,47±13,66*/**10,03±3,19*/**0,109±0,022*/**Примечание: * - р<0,01 в сравнении с ДГПЖ;
** - р<0,01 в сравнении с ПИН.

Таблица 2Средние значения морфометрических показателей ядерно-ядрышкового аппарата клеток различных морфотипов в цитологических препаратах предстательной железыМорфотипыЧисло ядрышекПлощадь ядер, мкм²Площадь ядрышек, мкм²Ядрышково-ядерное отношениеЧисло ядер11,2934.431,430,04328421,7345,712,780,06435732,3651,644,600,09323943,1562,706,960,1168554,2694,9111,070,11810164,17111,4616,350,14956

Таблица 3Статистические параметры площадей ядер и ядрышек, различных морфотипов ядерМорфотипыМорфометрические показателиСреднее значениеMinMax25% Quartile75% Quartile1Площадь ядер, мкм²34,4313,7657,7730,0640,09Площадь ядрышек, мкм²1,430,472,221,081,732Площадь ядер, мкм²45,7120,7679,9137,6950,67Площадь ядрышек, мкм²2,781,284,272,343,083Площадь ядер, мкм²51,6421,4395,4042,5459,32Площадь ядрышек, мкм²4,601,316,314,145,114Площадь ядер, мкм²62,7039,4490,5152,8675,08Площадь ядрышек, мкм²6,965,698,916,437,305Площадь ядер, мкм²94,9169,71150,8281,45108,1Площадь ядрышек, мкм²11,078,5614,609,5912,376Площадь ядер, мкм²111,4680,00150,8298,92122,71Площадь ядрышек, мкм²16,3513,7420,1414,5918,09

Таблица 4Представительство различных морфотипов ядер (%) в цитологических препаратах при ДГПЖ, ПИН и раке предстательной железыДиагнозМорфотипы123456ДГПЖ55,9938,165,85   ПИН12,5540,2136,8110.43  Рак8,1910,5815,3612,2934,4719,11

Изобретение относится к гистологии, патогистологии, урологии и онкологии. Для осуществления способа клеточные отпечатки биоптатов предстательной железы фиксируют спиртом и окрашивают 50% раствором AgNO₃. Далее проводят компьютерную морфометрию ядерно-ядрышкового аппарата и выделяют 6 морфотипов ядер, имеющих следующие характеристки по средним значениям площадей: 1-й морфотип - ядра 34,43 мкм², ядрышки 1,43 мкм²; 2-й морфотип - ядра 45,71 мкм², ядрышки 2,78 мкм²; 3-й морфотип - ядра 51,64 мкм², ядрышки 4,60 мкм²; 4-й морфотип - ядра 62,70 мкм², ядрышки 6,96 мкм²; 5-й морфотип - ядра 94,91 мкм², ядрышки 11,07 мкм², 6-й морфотип - ядра 111,46 мкм², ядрышки 16,35 мкм². При этом при выявлении 1-3 морфотипов диагностируют доброкачественную гиперплазию, 1-4 морфотипов - интраэпителиальную неоплазию, 1-6 морфотипов - рак предстательной железы. Использование изобретения позволяет повысить качество диагностики опухолевых заболеваний простаты и дает возможность идентификации редких, единичных злокачественных клеток. 4 табл.

Способ цитометрической диагностики опухолевых заболеваний предстательной железы, заключающийся в окраске цитологических препаратов 50%-ным раствором азотно-кислого серебра, компьютерной морфометрии ядерно-ядрышкового аппарата, отличающийся тем, что выделяются 6 морфотипов ядер, имеющих следующие характеристики (средние значения площадей): 1-й морфотип - ядра 34,43 мкм², ядрышки 1,43 мкм²; 2-й морфотип - ядра 45,71 мкм², ядрышки 2,78 мкм²; 3-й морфотип - ядра 51,64 мкм², ядрышки 4,60 мкм²; 4-й морфотип - ядра 62,70 мкм², ядрышки 6,96 мкм²; 5-й морфотип - ядра 94,91 мкм², ядрышки 11,07 мкм², 6-й морфотип - ядра 111,46 мкм², ядрышки 16,35 мкм², при этом при выявлении 1-3 морфотипов диагностируют доброкачественную гиперплазию, 1-4 морфотипов - интраэпителиальную неоплазию, 1-6 морфотипов - рак предстательной железы.