СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА EX VIVO Российский патент 2008 года по МПК C12N5/08 

Заявляемое изобретение относится к биотехнологии, точнее к клеточной технологии, и касается способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo.

В настоящее время одним из перспективных путей внедрения в медицинскую практику достижений молекулярной и клеточной биологии является трансплантация стволовых клеток с целью замещения в организме поврежденных и изношенных клеток и тканей.

Накопленные экспериментальные данные и начальный опыт клинических испытаний позволяют считать, что клеточные культуры, получаемые из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, имеют хорошие перспективы для использования в разрабатываемых методах трансплантации стволовых клеток при лечении различных заболеваний, связанных с повреждением и потерей клеток в жизненно важных органах.

Выявлено, что мезенхимальные стволовые клетки обладают иммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток и снижают вероятность возникновения и степень выраженности РТПХ при совместной трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками. При этом они существенно ускоряют восстановление поврежденного гемопоэза. Полученные данные о том, что мезенхимальные стволовые клетки не содержат мембранных маркеров, характерных для гемопоэтических клеток, а также антигенов гистосовместимости позволяют рассматривать мезенхимальные стволовые клетки как кандидаты не только для аутологичной, но и для аллогенной клеточной терапии.

Результатом трансплантации больным мезенхимальных стволовых клеток костного мозга может быть восстановление популяции стромальных клеток в различных органах. Стромальные клетки являются источником важных цитокинов и ростовых факторов, которые способствуют активированию и нормализации иммунного ответа, сниженного в результате болезни, а также развитию регенеративных процессов в поврежденных тканях и органах.

Мезенхимальные стволовые клетки обнаружены в костном мозге, селезенке, тимусе, лимфатических узлах, плевральной и перитонеальной полостях. Наибольшая их концентрация (10^-4) обнаружена в костном мозге; в селезенке их примерно на порядок меньше. При этом в костном мозге здоровых доноров их концентрация мала (10^-4), поэтому их трудно изолировать, очистить и размножить в культуре до необходимого для эффективной трансплантации количества.

В патенте США №5486359, патенте РФ №2164240, патенте РФ №2272839 описаны способы культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo, осуществляемые в жидкой культуральной среде. Так в патенте РФ №2272839 описан способ пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека, предназначенных для реконструкции костных и хрящевых сегментов, например в травматологической хирургии. В соответствии с этим патентом образец костного мозга человека промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Клетки с ядрами подсчитывают с использованием красителя и в среде F12, включающей 10% сыворотки и 1 нг/мг FGF -2, высевают на дно культурального сосуда в количестве 5×10⁶ клеток в виде нефракционированного костного мозга на 10 кв.см сосуда для культуры ткани. Через 48 часов эту среду удаляют, клетки промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером и выдерживают 24-48 часов в среде F12 без каких-либо добавок. Для поддержания остеохондрогенного потенциала в мезенхимальных стволовых клетках и способствования пролиферации клеток в среду добавляют определенную смесь факторов. Полученные клетки использовали в эксперименте на бестимусных мышах для образования кости in vivo.

Известен способ культивирования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, предназначенных для восстановления сократительной функции миокарда (Шумаков В.И. и соавт. «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда». Российский кардиологический журнал. Том 43, 2003 г., стр.42-50, №5). В соответствии с этим способом из пунктата аутологичных клеток костного мозга, взятого из гребня подвздошной кости больного в количестве 150-300 мл, лизировали гипотоническим раствором эритроциты и тромбоциты. Гемолизированный супернатант полностью удаляли, а ядросодержащие клетки суспендировали в ростовой среде Iscove's (Gibco, Grand Island) и высаживали в чашки Петри диаметром 150 кв.мм. Чашки помещали в CO₂-инкубатор в атмосферу газовой смеси, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха, при 95% влажности и 37°С. В конце вторых суток в среду на 72 часа вводили деметилирующий агент 5-азацитидин в концентрации 6 мкМ для индукции процесса дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в направлении кардиомиоцитов. За 2-3 месяца культивирования в ростовой среде с добавлением различных факторов роста производных мезенхимальных стволовых клеток - кардиомиоцитов удалось вырастить 15-50 млн клеток, которые снимали со дна чашки Петри с использованием трипсина.

Указанная технология позволяет вырастить производные мезенхимальных стволовых клеток - кардиомиоциты в количестве, достаточном для восстановления сократительной функции миокард, только из 150-300 мл костного мозга, взятого у больного. При использовании столь большого количества костного мозга в процессе указанного метода культивирования наблюдают повреждение и потерю клеток, в том числе при приготовлении клеточной суспензии, что не обеспечивает условий для умножения популяции кардиомиоцитов и использования указанного способа в терапии для лечения кардиомиопатий различной этиологии.

В качестве прототипа выбран способ культивирования из клеток костного мозга таких производных мезенхимальных стволовых клеток, как стромальные фибробласты (патент РФ №2142285, МКИ А61К 35/28, публ. 10.12.97). В соответствии с описанным способом образец костного мозга кролика калифорнийской породы суспендировали в питательной среде L-MEM, затем фильтровали и ядросодержащие клетки высевали в культуральный сосуд из расчета 10⁴-10⁵ на 1 кв.см дна сосуда. Культивирование проводили на синтетических средах L-MEM и Фишера, содержащих 20% сыворотки эмбрионов коров и антибиотиков - по 100 ед.пенициллина и стрептомицина в 1 мл среды, в атмосфере, содержащей углекислый газ и воздух, при температуре 37°С. По достижении сплошного монослоя колоний стромальных фибробластов на дне культурального сосуда в сосуд вводили 0,25%-ный раствор трипсина, с помощью которого слой клеток отделяли от дна сосуда и переносили в культуральный сосуд, имеющий большую площадь дна. После проведения 4-5 пассажей число выросших in vitro стромальных клеток во много раз превышает их содержание среди первично эксплантированной суспензии клеток костного мозга.

Однако указанный способ культивирования разработан применительно к костному мозгу животных, кроме того указанная методика не обеспечивает возможности получения из малого количества материала, содержащего ядросодержащие клетки, получить достаточное для лечебных целей количество производных мезенхимальных стволовых клеток, в частности, из-за повреждения значительной части клеток при обработке их раствором трипсина и нарушения их пролиферативного потенциала.

В основу заявляемого изобретения положена задача путем создания и поддержания условий, необходимых для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток, разработать способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo, позволяющий из малого исходного количества костного мозга получать в культуре мезенхимальные стволовые клетки в количестве, достаточном для проведения эффективной их трансплантации в терапевтических целях.

Эта задача решается при разработке способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo, включающего выделение из костного мозга ядросодержащих костномозговых клеток и осуществление по меньшей мере двух циклов их культивирования в ростовой среде до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток, в процессе каждого из которых высевают выделенные клетки в соответствующий культуральный сосуд, в котором в ростовой среде увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток до образования из нее сплошного монослоя, который извлекают из культурального сосуда путем обработки монослоя мезенхимальных стволовых клеток раствором трипсина, при этом в процессе каждого последующего цикла культивирования в качестве выделенных клеток используют мезенхимальные стволовые клетки, извлеченные из культурального сосуда предыдущего цикла культивирования, в котором, согласно изобретению, в процессе каждого цикла культивирования регулярно определяют рН ростовой среды и заменяют ростовую среду, рН которой менее 6,0 или более 8,0, на ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0, при этом регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а для обработки монослоя мезенхимальных стволовых клеток используют 0,03-0,1%-ный раствор трипсина, причем перед и после указанной обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и следов трипсина соответственно.

Благодаря изобретению стало возможно получить в культуре 100-500 млн мезенхимальных стволовых клеток из 0,5-1,0 мл исходного количества костного мозга человека, забираемого для диагностических целей при пункции костного мозга из грудины или подвздошной кости пациентов любого возраста.

Согласно изобретению полезно, чтобы в процессе осуществления первого цикла культивирования в культуральный сосуд высевали выделенные ядросодержащие клетки в количестве 5×10⁴-5×10⁵ клеток на 1 кв.см дна сосуда, что обеспечивает достоверную вероятность увеличения из указанного количества клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток.

Согласно изобретению целесообразно увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток в ростовой среде осуществлять в физиологически приемлемых условиях, необходимых для жизнедеятельности этих клеток.

Чтобы создать условия для увеличения популяции мезенхимальных стволовых клеток в процессе осуществления каждого последующего цикла культивирования целесообразно использовать культуральный сосуд, площадь дна которого больше площади дна культурального сосула, используемого в процессе осуществления предыдущего цикла культивирования.

Согласно изобретению полезно в качестве ростовой среды использовать минерально-солевой раствор, содержащий аминокислоты, антибиотики, L-глютамин и эмбриональную телячью сыворотку, в том числе среду RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).

Согласно изобретению полезно увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток осуществлять в атмосфере, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух, и при температуре в интервале от 33 до 38°С, что полностью соответствует физиологически приемлемым условиям, необходимым для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток.

Согласно изобретению целесообразно в качестве изотонического раствора использовать физиологический раствор или раствор Хэнкса, не содержащий солей кальция и магния.

Согласно изобретению полезно в качестве культурального сосуда использовать пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA).

Другие цели и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo и конкретных примеров выполнения этого способа.

В заявляемой технологии культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo источником клеток костного мозга служат пунктаты из грудины или подвздошной кости человека. Как правило, пункцию костного мозга проводят в строго стерильных условиях, пунктат в количестве 0,5-1,0 мл, включающий от (15-50)·10² до (30-100)·10² соответственно мезенхимальных стволовых клеток (такое количество костномозгового пунктата обычно используется для диагностических целей), помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA) или буферным раствором, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим получение суспензии осадка в ростовой среде. Далее обычными методами, например, с использованием красителя метилфиолетового, подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии и разбавляют ростовую среду до концентрации, обеспечивающей содержание (1-2)×10⁶ ядросодержащих клеток в 1 мл ростовой среды.

В качестве ростовой среды используют, например, среду RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).

Согласно изобретению культивирование осуществляют по меньшей мере в два цикла, при этом в процессе первого цикла высевают 5×10⁴-5×10⁵ выделенных клеток на 1 кв.см дна первого культурального сосуда. При посеве менее 5×10⁴ клеток на 1 кв.см возможен очень скудный рост мезенхимальных стволовых клеток или даже отсутствие их роста, а при посеве более 5×10⁵ клеток на 1 кв.см наблюдают эффект контактного ингибирования, что также негативно влияет на последующую пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток.

Культивирование проводят, например, в таких культуральных сосудах, как пластиковые флаконы Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см².

В процессе культивирования осуществляют увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток в физиологически приемлемых условиях, необходимых для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток. Согласно изобретению полезно увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток осуществлять в атмосфере, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух, и при температуре, исключающей появление повреждающего эффекта, то есть при температуре в интервале от 33 до 38°С, что полностью соответствует физиологически приемлемым условиям, необходимым для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток. Практически это осуществляют путем продувания культурального сосуда газовой смесью, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух.

Согласно изобретению в процессе каждого цикла культивирования и увеличения популяции мезенхимальных стволовых клеток регулярно определяют рН ростовой среды и, в том случае, когда в процессе культивирования регистрируют изменение рН среды (вследствие, в том числе, метаболизма клеток) до значения менее 6,0 или более 8,0, осуществляют удаление такой ростовой среды, а в культуральный сосуд сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0. При этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток.

Регулярное элиминирование клеток, не относящихся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, обеспечивает условия, необходимые для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток, благоприятствует их росту, а также способствует образованию в процессе культивирования более чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток.

После образования на дне первого культурального сосуда сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно культурального сосуда, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой культуральный сосуд, как правило, с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из культурального сосуда собственно ростовой среды, затем, согласно изобретению, монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в изотоническом растворе (например, физиологическом растворе или растворе Хэнкса, не содержащем солей кальция и магния) и удаляют следы ростовой среды. Затем в культуральный сосуд вводят, согласно изобретению, 0,03 - 0,1%-ный раствор трипсина для разрушения межклеточных связей в сплошном слое мезенхимальных стволовых клеток и отделения клеток от дна культурального сосуда.

Было найдено, что при использовании 0,03-0,1%-ного раствора трипсина разрушению подвергаются только межклеточные связи в слое мезенхимальных стволовых клеток, при этом не наблюдают повреждений самих мезенхимальных стволовых клеток и, значит, не происходит снижения их пролиферативного потенциала.

Затем раствор трипсина удаляют и вводят, согласно изобретению, в культуральный сосуд изотонический раствор, содержащий сыворотку, например физиологический раствор или раствор Хэнкса, не содержащий солей кальция и магния, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.

В изотоническом растворе мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна культурального сосуда, отмывают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин и суспендируют либо в ростовой среде (для последующего пересева), либо в фармакопейном физиологическом растворе, содержащем 10 МЕ/мл гепарина (для последующего использования в терапевтических целях путем трансплантации пациенту мезенхимальных стволовых клеток).

Далее осуществляют высевание взятых в виде суспензии в ростовой среде мезенхимальных стволовых клеток, полученных и выделенных в процессе первого цикла культивирования, во второй культуральный сосуд, площадь дна которого превосходит площадь дна культурального сосуда, используемого на предыдущем цикле культивирования.

Необходимо отметить, что каждый раз при замене ростовой среды или пересеве клеточной популяции в новый культуральный сосуд по мере нарастания клеточной массы, осуществляют продувание культурального сосуда газовой смесью, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух.

Согласно изобретению второй цикл культивирования, как и каждый возможный последующий цикл культивирования, осуществляют в условиях, аналогичных названным в первом цикле культивирования, с получением заданного количества чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток.

Благодаря заявляемому способу культивирования необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×10⁸ может быть выращено из (15-100)·10² клеток за 35-40 суток культивирования.

Пример 1

Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл (такое количество костномозгового пунктата обычно используется для диагностических целей).

Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA). Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×10⁶.

Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см² высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×10⁴ клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.

В процессе культивирования регулярно определяют рН ростовой среды. Регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

После образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.

Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, не содержащий солей кальция и магния, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.

В растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).

Далее осуществляют второй, третий и четвертый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, площадь дна которых превосходит площадь дна флакона Карреля, используемого на предыдущем цикле культивирования. Во каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.

При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.

Циклы культивирования осуществляют до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.

Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×10⁸ выращено за 35 суток культивирования.

Пример 2

Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 0,5 мл.

Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).

После отстаивания эритроцитов в течение 2 часов при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA). Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×10⁶.

Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см² высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×10⁵ клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.

При определении изменения рН среды до значения менее 6,0 осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

После образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в растворе Хэнкса, не содержащем солей кальция и магния, и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,1%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.

Затем раствор трипсина удаляют и вновь вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.

В растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).

Далее осуществляют второй, третий, четвертый и пятый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, площадь дна которых превосходит площадь дна флакона Карреля, используемого на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.

При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.

Циклы культивирования осуществляют до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.

Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×10⁸ было выращено за 40 суток культивирования.

Пример 3

Забор аутологичных клеток костного мозга проводят у донора, имеющего возраст 7 лет.

Забор клеток проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.

Пунктат костного мозга содержит только чистые клетки костного мозга, незагрязненные клетками перефирической крови.

Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).

После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).

Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет примерно 5×10⁷ (при этом содержание МСК составляет 5×10³).

Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×10⁴ клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.

В процессе культивирования регулярно определяют рН ростовой среды. Регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

После образования (на 10 день культивирования) на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.

Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.

В аналогичном растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).

Далее осуществляют второй цикл культивирования, в процессе которого во флаконы Карреля высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе первого цикла культивирования.

При этом посев осуществляют с плотностью 10³-10⁴ мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона Карреля.

При пересеве клеток в новые культуральные флаконы осуществляют продувание флаконов газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.

Второй цикл культивирования клеток молодого донора, которые обладают отличной способностью к пролиферации, позволил по истечении 10 дня получить с использованных флаконов Карреля 5·10⁷-10⁸ мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции, что является минимальной эффективной терапевтической дозой.

Пример 4

Забор аутологичных клеток костного мозга проводят у донора, предварительно индуцированного препаратами, усиливающими пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток.

Забор клеток проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.

Пунктат костного мозга содержит только чистые клетки костного мозга, незагрязненные клетками перефирической крови.

Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).

После отстаивания эритроцитов в течение 2 часов при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).

Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (2-5)×10⁷.

Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см² высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×10⁵ клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.

При определении изменения рН среды до значения менее 6,0 осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

На 10-й день культивирования после образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для пересева выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна.

Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в растворе Хэнкса, не содержащем солей кальция и магния, и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,1%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.

Затем раствор трипсина удаляют и вновь вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.

В растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).

Далее осуществляют второй и третий циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, суммарная площадь дна которых превосходит суммарную площадь дна флаконов Карреля, используемых на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования. Высевают клетки с плотностью 10³-10⁴ мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона.

При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.

Второй цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней с получением 5·10⁷-10⁸ мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.

Третий цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней с получением 3·10⁹ мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.

Пример 5

Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.

Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).

После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).

Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×10⁶.

Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см² высевают взятые в виде суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×10³ клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. При этом используют фактор роста - инсулиноподобный фактор.

Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.

В процессе культивирования регулярно определяют рН ростовой среды. Регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.

Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

На 10-й день после образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.

Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.

В аналогичном растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).

Далее осуществляют второй, третий и четвертый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, суммарная площадь дна которых превосходит суммарную площадь дна флаконов Карреля, используемых на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.

При этом посев осуществляют с плотностью 10³-10⁴ мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона Карреля.

При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.

Каждый цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.

Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×10⁸ выращено за 40 суток культивирования.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека ех vivo включает по меньшей мере два цикла культивирования ядросодержащих костномозговых клеток в ростовой среде до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток. В процессе каждого цикла высевают выделенные клетки в соответствующий культуральный сосуд, регулярно определяют рН ростовой среды и заменяют ростовую среду, рН которой менее 6,0 или более 8,0, на ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0, при этом регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток. Процесс культивирования в каждом цикле ведут до образования сплошного монослоя популяции МСК, который извлекают из культурального сосуда путем его обработки 0,03-0,1%-ным раствором трипсина, а перед и после указанной обработки МСК отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и следов трипсина соответственно. Изобретение позволяет за достаточно короткий период (приблизительно 40 суток) вырастить из 0,5-1,0 мл пунктата костного мозга эффективную терапевтическую дозу МСК (по меньшей мере 5·10⁷-10⁸). 8 з.п. ф-лы.

1. Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo, включающий выделение из костного мозга ядросодержащих костномозговых клеток и осуществление по меньшей мере двух циклов их культивирования в ростовой среде до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток, в процессе каждого из которых высевают выделенные клетки в соответствующий культуральный сосуд, в котором в ростовой среде увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток до образования из нее сплошного монослоя, который извлекают из культурального сосуда путем обработки монослоя мезенхимальных стволовых клеток раствором трипсина, при этом в процессе каждого последующего цикла культивирования в качестве выделенных клеток используют мезенхимальные стволовые клетки, извлеченные из культурального сосуда предыдущего цикла культивирования, отличающийся тем, что в процессе каждого цикла культивирования регулярно определяют рН ростовой среды и заменяют ростовую среду, рН которой менее 6,0 или более 8,0, на ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0, при этом регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а для обработки монослоя мезенхимальных стволовых клеток используют 0,03-0,1%-ный раствор трипсина, причем перед и после указанной обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и следов трипсина, соответственно.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе осуществления первого цикла культивирования в культуральный сосуд высевают выделенные ядросодержащие клетки в количестве 5·10⁴-5·10⁵ клеток на 1 см² дна сосуда.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток в ростовой среде осуществляют в физиологически приемлемых условиях, необходимых для жизнедеятельности этих клеток.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе осуществления каждого последующего цикла культивирования используют культуральный сосуд, площадь дна которого больше площади дна культурального сосуда, используемого в процессе осуществления предыдущего цикла культивирования.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ростовой среды используют минерально-солевой раствор, содержащий аминокислоты, антибиотики, L-глютамин и эмбриональную телячью сыворотку.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ростовой среды используют среду RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).7. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве физиологически приемлемых условий, необходимых для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток, используют атмосферу, содержащую от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух, и температуру в интервале от 33 до 38°С.8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве изотонического раствора используют физиологический раствор или раствор Хэнкса, не содержащий солей кальция и магния.9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве культурального сосуда используют пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA).