КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КЛЕТОК КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК Российский патент 2012 года по МПК C12N5/775 A61K35/12 A61P17/00 

Заявляемое изобретение относится к биомедицинским клеточным технологиям, более точно заявляемое изобретение касается композиции для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек.

Изобретение найдет широкое применение в медицине, в частности, для лечения трофических поражений кожных и слизистых покровов, развивающихся при сахарном диабете, хронической венозной недостаточности, облитерирующем эндартериите, стоматите, ожогах, заболеваниях слизистых мочеполовых путей.

Известно, что питательная среда, используемая для культивирования клеток, обычно включает незаменимые аминокислоты, витамины, минералы, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Внесение в питательную среду гормонов и ростовых факторов обеспечивает условия для нормального роста и дифференцировки культивируемых клеток. В процессе культивирования клеточная культура продуцирует, секретирует ряд важных клеточных метаболитов, которые регулируют пролиферацию клеток, их адгезию, дифференцировку, миграцию, определяют спектр синтезируемых и секретируемых биологически активных веществ. Спектр продуцируемых веществ напрямую зависит от фенотипического состава культивируемых клеток, а также от факторов роста, которые были исходно привнесены в культуральную среду. Таким образом, в процессе культивирования клетки модифицируют культуральную среду, обогащая ее продуктами своей жизнедеятельности. После инкубирования культуральной среды с клетками эта среда становится так называемой кондиционированной средой. Кондиционированные среды содержат много исходных компонентов самой среды, а также, как сказано выше, различные клеточные метаболиты и секретированные белки, включая, например, биологически активные факторы роста, медиаторы воспаления и другие внеклеточные белки.

В последние годы интенсивно проводят исследования возможностей получения из различных типов стволовых клеток разных по направлению дифференцировки клеток, которые посредством трансплантации могут применяться для замещения утраченных или поврежденных клеток в жизненно важных органах или тканях.

В процессе роста и индукции направленной дифференцировки исходных стволовых клеток в специализированные клетки происходит формирование соответствующей кондиционированной среды, которая также может обладать различной биологической активностью, в том числе и лечебным эффектом, изучаемым в регенеративной медицине.

Известна композиция для стимулирования роста и регенерации клеток, описанная в патенте РФ 2341270 (опубл. 10.07.2008 по кл. МПК A61K 35/12). Эта композиция содержит разрушенные клетки лейкоцитов периферической крови, разрушенные стволовые клетки и/или разрушенные прогениторные клетки, взятые в кондиционированной среде их совместного культивирования в присутствии тканеспецифического антигена, соответствующего органу, регенерацию которого намереваются осуществить, также композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. При этом указывается, что питательная среда может быть кондиционирована стромальными клетками, клетками костного мозга, паренхиматозными клетками, резервными клетками печени, стволовыми нервными клетками, стволовыми клетками поджелудочной железы и/или эмбриональными стволовыми клетками. Указанные клетки представляют собой клетки животных или человека, а в качестве ростовой среды может быть использована любая известная определенная или неопределенная культуральная питательная среда.

В качестве прототипа выбрана фармацевтическая композиция, содержащая питательную среду, кондиционированную трехмерной клеточной культурой при культивировании in vitro в течение 10-14 дней (патент РФ 2280459, опубл 27.07.2006 по кл. МПК A61K 35/12). Клеточные культуры, культивированные в трех измерениях, включают стромальные и/или паренхимные клетки, в том числе генетически сконструированные клетки. Указанная фармацевтическая композиция содержит названную кондиционированную культуральную среду, из которой отделены клеточные культуры, при этом включающую такие внеклеточные продукты, как факторы роста, противовоспалительные медиаторы, ферменты, цитокины, гормоны, факторы свертывания крови, регуляторные факторы, ангиогенные факторы или антиангиогенные факторы.

Помимо кондиционированной культуральной среды фармацевтическая композиция содержит фармацевтический носитель, а также может содержать антибиотики, антивирусные агенты, противогрибковые агенты, стероиды, аналгетики, противоопухолевые лекарственные средства, любые соединения, которые должны приводить к образованию комбинации с присутствующими в кондиционированной среде факторами, обладающей усиливающим или синергическим действием.

Фармацевтическая композиция предложена для стимуляции заживления ран и лечения ожогов, а также для коррекции косметического дефекта.

Как композиция, описанная в патенте РФ 2341270, так и композиция, выбранная в качестве прототипа, содержат кондиционированные среды, специально и направленно получаемые в отношении веществ, продуцируемых культивируемыми клетками. Используются при этом не всегда до конца изученные в отношении влияния на организм человека клеточные линии, а также применяются сложные, затратные и неопробированные технологии, получаемые кондиционированные среды содержат вещества неоднозначного действия на организм человека. Кроме того, свойства/состав кондиционированных сред, присутствующих в указанных композициях, не определены и не изучены, что не исключает возможность проявления непредвиденных свойств фармацевтической композиции. Помимо этого, следует сказать, что свойства композиций, заявленных в патенте РФ 2341270 и в патенте РФ 2280459, обусловлены присутствием разного рода дополнительно вносимого биологического материала и активных веществ, а не собственно кондиционированной средой.

В основу заявляемого изобретения положена задача путем использования побочных продуктов изученных медицинских клеточных технологий создать такую композицию для стимулирования роста и регенерации клеток, которая обладала бы высокой эффективностью при восстановлении поврежденных клеток в самообновляющихся клеточных системах, в первую очередь, в коже и слизистых, а также безопасностью в медицинском и этическом отношениях.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемой композиции, заключается в возможности в экономически привлекательных условиях эффективно осуществлять восстановление поврежденных клеток кожи и слизистых оболочек человека в безопасном режиме с точки зрения медицины и этики.

Эта задача решается за счет того, что композиция, включающая культуральную питательную среду, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro эукариотических клеток, и кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами эукариотических клеток, выделяемыми ими в питательную среду в процессе их культивирования, согласно заявляемому изобретению, дополнительно содержит костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека в количестве по меньшей мере 10⁵ клеток/мл, а в качестве кондиционированной среды она содержит культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически-активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам, в количестве по меньшей мере n×10, где n - количество названных биологически активных соединений в исходной культуральной питательной среде.

При этом, согласно изобретению, заявляемая композиция содержит костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека преимущественно в количестве от 10⁵ клеток/мл до 10⁶ клеток/мл.

Еще одна особенность заявляемого изобретения заключается в том, что в основном заявляемая композиция содержит следующие ингредиенты, г/л: L-аргинин 0,2; L-аспарагин (безводный) 0,05; L-аспарагиновую кислоту 0,02; L-цистин 0,0652; L-глютаминовую кислоту 0,02; L-глютамин 0,3; L-глицин 0,01; L-гистидин 0,015, L-гидроксипролин 0,02; L-изолейцин 0,05, L-лейцин 0,05; L-лизин HCl 0,04; L-метионин 0,015; L-фенилаланин 0,015; L-пролин 0,02, L-серин 0,03; L-треонин 0,02, L-триптофан 0,005; L-тирозин 0,02883; L-валин 0,02; биотин 0,0002; пантотенат 0,00025; холинхлорид 0,00362; фолиевую кислоту 0,001; инозит 0,035; никотинамид 0,001; РАВА 0,001; пиридоксин солянокислый 0,001; рибофлавин 0,0002; тиамин солянокислый 0,001; витамин В12 0,000005; нитрат кальция 0,1; хлорид калия 0,4; сульфат магния 0,04884; хлорид натрия 6,0; фосфат натрия 0,8; Д-глюкоза 2,0; глютатион 0,001; феноловый красный 0,0053.

Заявленное изобретение иллюстрируется чертежами, где одинаковые или сходные элементы имеют одни и те же ссылочные позиции.

На фиг.1 графически представлен результат хроматографического анализа исходной культуральной питательной среды в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).

На фиг.2 графически представлен результат хроматографического анализа кондиционированной культуральной питательной среды, собранной из культуры мезенхимальных стволовых клеток на стадии логарифмической фазы их роста, в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).

На фиг.3 графически представлен результат хроматографического анализа кондиционированной культуральной питательной среды, собранной из культуры мезенхимальных стволовых клеток на стадии стационарной фазы их роста, в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).

На фиг.4 графически представлен результат хроматографического анализа кондиционированной культуральной питательной среды, собранной из культуры мезенхимальных стволовых клеток и обогащенной мезенхимальными стволовыми клетками в количестве 10⁵ клеток/мл, в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).

Подробное описание изобретения

Заявляемая композиция включает культуральную питательную среду, кондиционированную в процессе культивирования in vitro костномозговых мезенхимальных стволовых клеток человека.

В качестве основного компонента заявляемой композиции используется продукт культивирования именно мезенхимальных стволовых клеток, так как такие клетки свободны, то есть не содержат фенотипические (мембранные) маркеры, характерные для гемопоэтических клеток (CD34, CD45, CD25, CD14, CD4), а также антигены гистосовместимости (HLA-DR, MH-II), и поэтому могут использоваться как для аутологичной, так и для аллогенной трансплантации. Всего на мезенхимальных стволовых клетках с помощью проточника выявлено более 50 антигенов, однако специфических для них маркеров не выявлено. Наиболее часто для выделения чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток используют такие маркеры, как CD90, CD105, CD106, CD73, CD 166, SSEA-4, STRO-1, SH-4, HLA-ABC (MHC-II).

Культуральная питательная среда для культивирования мезенхимальных стволовых клеток может быть любой средой, которая адекватно соответствует потребностям культивируемых клеток в питательных элементах. Примерами таких сред являются, но не ограничиваются ими, модифицированная по методу Дульбекко среда Игла (DMEM), среда Хэма F12, RPMI 1640, среда Исков, среда Маккой и другие композиции сред, известные специалистам, включая среды, описанные в работах Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss, New York (1984) и Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England 1996. Питательная среда может быть дополнена любыми компонентами, необходимыми для поддержания клеточной культуры. Если это необходимо, то дополнительно может быть добавлена эмбриональная телячья сыворотка, которая представляет собой комплексный раствор альбуминов, глобулинов, стимуляторов роста и гормонов. Такая сыворотка не должна содержать патогенов и должна быть тщательно проверена на загрязнение микоплазмой, бактериями, грибками и вирусами.

Более подробно скажем, что ингредиентами культуральной питательной среды для культивирования мезенхимальных стволовых клеток являются аминокислоты (D- и/или L-аминокислоты), такие как глутамин, аланин, аргинин, аспарагин, цистеин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин, валин и их производные; подгруппы растворимых кислот, таких как тиамин, аскорбиновая кислота, соединения железа (3), соединения железа (2), пурины, глутатион и одноосновные фосфаты натрия.

Другими ингредиентами являются сахара, дезоксирибоза, рибоза, нуклеозиды, водорастворимые витамины, рибофлавин, соли, металлы в следовых количествах, липиды, соли уксусной кислоты, соли фосфорной кислоты, HEPES, феноловый красный, соли пировиноградной кислоты и буферы.

Другими ингредиентами, часто используемыми в композициях сред, являются жирорастворимые витамины (включая A, D, E и K), стероиды и их производные, холестерин, жирные кислоты и липиды, твин 80, 2-меркаптоэтанолпирамидины, а также ряд добавок, включая названную выше сыворотку, белки (инсулин, трансферрин, факторы роста, гормоны и т.п.), антибиотики (гентамицин, пенициллин, стрептамицин, амфотерицин В и т.п.), ультрафильтрат цельного яйца и факторы адгезии (фибронектины, витронектины, коллагены, ламенины, тенасцины и т.п.).

Само собой разумеется, что в указанные среды могут быть добавлены факторы роста и другие белки.

Согласно изобретению, использованная культуральная питательная среда кондиционирована продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами и получена на стадиях логарифмической фазы (S-фаза клеточного цикла) и стационарной фазы (Go-фаза клеточного цикла) роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток. Экспериментально было установлено, что культуральная питательная среда в указанных фазах роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток преимущественно содержит биологически-активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам, в количестве по меньшей мере n×10, где n - количество названных биологически активных соединений в исходной культуральной питательной среде.

Кондиционированная среда, являющаяся одним из ингредиентов заявляемой композиции, представляет собой побочный продукт медицинской технологии получения высококачественных мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека. Эта технология основана на размножении в культуре при строго определенных условиях чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток в большом количестве (100-500 млн) из малого исходного количества костного мозга (0,5-1,0 мл), получаемого при пункции грудины или подвздошной кости у пациентов любого возраста. Такое количество мезенхимальных стволовых клеток достаточно для проведения эффективной их трансплантации (локальной, внутривенной). Преимущество данной предпочтительной технологии перед другими заключается в том, что костный мозг человека является универсальным источником получения в культуре мезенхимальных стволовых клеток, которые в отличие от мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из других источников (эмбриональные, фетальные мезенхимальные стволовые клетки), являются наиболее безопасными при их применении в медицинской практике.

В соответствии со сказанным, кондиционированная среда с показателями, указанными выше и пригодная для использования в заявляемой композиции для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек, предпочтительно получена в процессе нескольких циклов культивирования ядросодержащих костномозговых клеток в питательной среде, pH которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0. При этом в процессе каждого цикла культивирования регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, и увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток до образования из нее сплошного монослоя, который обрабатывают 0,03-0,1%-ным раствором трипсина. Перед и после указанной обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов питательной среды и следов трипсина соответственно, при этом в процессе каждого последующего цикла культивирования используют мезенхимальные стволовые клетки предыдущего цикла культивирования. Более подробно эта технология культивирования мезенхимальных стволовых клеток описана в патенте РФ 2323252, выданном на изобретение «Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo».

При исследовании автором настоящей заявки разработанной им медицинской технологии получения высококачественных мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека было выявлено, что на стадии фазы логарифмического роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток (иначе говоря, фазы удваивания количества мезенхимальных стволовых клеток за определенный промежуток времени, называемый «периодом генерации») происходит интенсивное, активное синтезирование мезенхимальными стволовыми клетками биологически активных соединений, таких как ростовые факторы, низкомолекулярные пептиды, и выделение их в окружающую питательную среду. При сравнении данных, показанных на фиг.1 и на фиг.2, видно, что на стадии фазы логарифмического роста в питательной среде резко возрастает содержание фракции 4 (соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа) и фракции 5 (соответствует веществам (активным цитокинам) с молекулярной массой 2-3 кДа).

Также активное синтезирование ростовых факторов и низкомолекулярных пептидов отмечено на стадии стационарной фазы роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток (см. фиг.3).

Полученные данные позволили использовать кондиционированную культуральную питательную среду, полученную при реализации способа, защищенного патентом РФ 2323252, на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста мезенхимальных стволовых клеток, в качестве компонента заявляемой композиции.

Исследованиями установлено, что для эффективного стимулирования роста и регенерации клеток кожных и слизистых покровов композиция должна содержать мезенхимальные стволовые клетки в количестве по меньшей мере 10⁵ клеток/мл. Преимущественно заявляемая композиция содержит костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека в количестве от 10⁵ клеток/мл до 10⁶ клеток/мл.

Следует отметить, что при хроматографическом анализе выявлена прямая корреляция между содержанием фракций 4 и 5 (фиг.4) и числом добавленных мезенхимальных стволовых клеток в кондиционированную среду. Однако при добавлении мезенхимальных стволовых клеток в количестве свыше 10⁶ кл/мл отмечают снижение фракции 3 (альбуминов), что свидетельствует о распаде белка. В связи с этим наиболее оптимальным обогащением кондиционированной среды мезенхимальными стволовыми клетками нам представляется добавление их в концентрации от 10⁵ кл/мл до 10⁶ кл/мл.

В процессе исследований было определено, что преимущественно заявляемая композиция содержит следующие ингредиенты, г/л: L-аргинин 0,2; L-аспарагин (безводный) 0,05; L-аспарагиновую кислоту 0,02; L-цистин 0,0652; L-глютаминовую кислоту 0,02, L-глютамин 0,3; L-глицин 0,01, L-гистидин 0,015; L-гидроксипролин 0,02; L-изолейцин 0,05; L-лейцин 0,05; L-лизин HCl 0,04, L-метионин 0,015; L-фенилаланин 0,015; L-пролин 0,02; L-серин 0,03, L-треонин 0,02; L-триптофан 0,005; L-тирозин 0,02883; L-валин 0,02; биотин 0,0002; пантотенат 0,00025; холинхлорид 0,00362; фолиевую кислоту 0,001; инозит 0,035, никотинамид 0,001; РАВА 0,001; пиридоксин солянокислый 0,001; рибофлавин 0,0002; тиамин солянокислый 0,001, витамин В12 0,000005; нитрат кальция 0,1; хлорид калия 0,4; сульфат магния 0,04884; хлорид натрия 6,0; фосфат натрия 0,8; Д-глюкоза 2,0; глютатион 0,001, феноловый красный 0,0053.

Таким образом, как видно из вышесказанного, одним из компонентов заявляемой композиции является побочный продукт изученной медицинской клеточной технологии, что благоприятно с точки зрения медицины и этики, а также экономически привлекательно.

В соответствии с изобретением, заявляем композицию для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек.

Известно, что мезенхимальные стволовые клетки в процессе культивирования секретируют ряд цитокинов (IL-6, -7, -8, -11, -12, -14, -15, -27, LIF, SCF, M-CSF)), некоторые из которых обеспечивают критические взаимодействия «клетка-клетка», ускоряя дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток;

мезенхимальные стволовые клетки in vitro синтезируют различные ростовые факторы, включая фактор роста для эндотелия сосудов (VEGF), стимулирующий ангиогенез, IL-1, IL-6, TNF-, которые относятся к воспалительным цитокинам, обусловливая выраженное противовоспалительное действие мезенхимальных стволовых клеток, а также гепатоцитарный фактор роста (ГФР), который индуцирует митогенную и антиапоптогенную активность в различных системах, ускоряет заживление ран, что подтверждает активную роль мезенхимальных стволовых клеток в регенеративной медицине (в тканевой репарации). На мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека выявлены также рецепторы для тромбоцитарного фактора роста (PDGF), эпидермального фактора роста (EGF), нейротрофического фактора роста ((NGF), инсулиноподобного фактора роста (IGF) и др., что также расширяет возможности клинического применения мезенхимальных стволовых клеток.

Мезенхимальные стволовые клетки обладают также иммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток и снижают вероятность и степень выраженности реакции трансплантата против хозяина при их совместной трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками; при этом они существенно ускоряют восстановление поврежденного гемопоэза. В экспериментах по совместному культивированию разных клеток показано, что мезенхимальные стволовые клетки не подвергаются аллогенному отторжению как у людей, так и у экспериментальных животных.

Эти данные по соединениям, которые секретируют мезенхимальные стволовые клетки в процессе их культивирования, и названные свойства мезенхимальных стволовых клеток являлись отправной точкой при создании заявляемого продукта. В процессе исследований, как указано выше, было обнаружено, что культуральная питательная среда именно на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста клеточной линии мезенхимальных стволовых по меньшей мере на порядок (в 10 раз) обогащается различными биологически активными веществами, включая пептиды и другие низкомолекулярные вещества (цитокины), уровни которых определены хроматографически, что показано на фиг.2 и фиг.3.

Такая среда, как показали тесты, обладает выраженным противовоспалительным и ранозаживляющим действием.

Кроме того, для достижения стабильной активности кондиционированной питательной среды, описанной выше, ее дополнительно обогащают костномозговыми мезенхимальными стволовыми клетками человека в различном количестве от 10⁵ клеток/мл до 10⁶ клеток/мл, но не менее 10 клеток/мл, при этом предпочтительно использовать здоровые высокачественные клетки, полученные в соответствии с технологией, защищенной патентом РФ 2323252.

Разработанная новая композиция для стимулирования роста и регенерации клеток кожи и слизистых оболочек расширяет возможности клинического применения костного мозга человека, при этом она безопасна в медицинском и этическом отношениях. Как показали исследования, заявляемый продукт обладает противовоспалительным, иммуномодулирующим, выраженным ранозаживляющим, антистрессовым и адаптогенным действием; продукт способствует клеточному обновлению, стимулирует и повышает собственный потенциал клеток, усиливает выработку коллагена, укрепляет стенки сосудов, стимулирует микроциркуляцию и регенерацию тканей. Заявляемый продукт проявляет высокую эффективность при борьбе со всеми видами повреждения тканей, в том числе с трофическими, лучевыми, послеоперационными. Заявляемая композиция проявляет высокую эффективность при лечении трофических поражений кожных и слизистых покровов, развивающихся при сахарном диабете, хронической венозной недостаточности, облитерирующем эндартериите, стоматите, ожогах, заболеваниях слизистых мочеполовых путей.

ПРИМЕР 1

Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.

Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).

После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают, центрифугируют с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA) и низкомолекулярные пептиды.

Далее подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×10⁶.

Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см² высевают взятые в виде суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×10³ клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона.

Культивирование проводят в атмосфере газовой смеси, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, при 37°C.

В процессе культивирования регулярно определяют pH питательной среды. Регистрируют изменение pH среды до значения не менее 6,0.

Осуществляют удаление такой питательной среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую питательную среду, pH которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение pH среды до значения не менее 6,0.

Осуществляют удаление такой питательной среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую питательную среду, pH которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей питательной среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.

По истечении 6 суток культивирования регистрируют изменение pH среды до значения не менее 6,0.

Осуществляют удаление такой питательной среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую питательную среду, pH которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.

На 10-й день после образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток во флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно питательной среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы питательной среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.

Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.

В аналогичном растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают со дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в питательной среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).

Далее осуществляют второй, третий и четвертый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, суммарная площадь дна которых превосходит суммарную площадь дна флаконов Карреля, используемых на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной питательной среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.

При этом посев осуществляют с плотностью 10³-10⁴ мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона Карреля.

Каждый цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.

Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×10⁸ выращено за 40 суток культивирования.

При этом среды, удаляемые как на стадии логарифмической фазы (до формирования сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток), так и на стадии стационарной фазы (после формирования сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток) собирают в стерильную посуду, объединяют и используют для исследования и лечения.

Собранную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, подвергают анализу. Анализы молекулярно-массового распределения в образце собранной кондиционированной среды и в образце исходной питательной среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, проведены методом ВЭЖХ (гель-фильтрации) на колонке TSK-gel 7,5×66 мм, подвижная фаза 0,2 М K₂HPO₄, pH 6,8 с 0,01% азидом натрия. Скорость потока 1 мл/мин. На уравновешенную буфером колонку наносили по 20 мкл образцов, предварительно разбавленных буфером в 10 раз. Регистрацию проводили по измерению оптической плотности при 280 нм. Результаты анализов показаны на фиг.1, 2, 3 и фиг.4, где фракция 4 соответствует низкомолекулярным пептидам (мол. масса 6-8 кДа), фракция 5 соответствует низкомолекулярным веществамам (мол. масса 2-3 кДа) - наблюдают значительное, не менее чем в 10 раз увеличение относительного содержания фракции 4 и фракции 5.

Пример 2 (эксперимент)

Термический ожог кожи моделировали на 20 крысах-самцах популяции Wistar, массой 180-220 г. Площадь ожоговой раны составляла 12 см².

При проведении эксперимента животные были разделены на 2 группы по 10 животных: 1) крысы с глубоким термическим ожогом III-Б степени и применение заявленной композиции (опыт); 2) крысы с глубоким термическим ожогом III-Б без применения раневого покрытия с использованием только сухой асептической повязки (контроль).

На 2-й день после механического удаления струпа и стандартного туалета ожеговых ран на ожоговую поверхность животных опытной группы наносили покрытие, смоченное композицией, содержащей культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, и мезенхимальные стволовые клетки в количестве 10^-5 клеток/мл, полученные в примере 1.

Для животных группы контроля использовали асептическую марлевую повязку, смачивали ее в стерильном физиологическом растворе и наносили на ожоговую поверхность.

Клиническую оценку результатов производили на основе динамического визуального, планиметрического контроля состояния ожоговой поверхности.

Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляли 3, 7, 13, 16 и 30 суток с момента травмы.

Результаты анализа планиметрического исследования показали, что при использовании заявляемой композиции происходит существенное ускорение процессов заживления, что отражается в сроках полного восстановления кожи. Применение при обширной глубокой ожоговой ране III-Б приводит к формированию прочного раневого струпа, играющего роль наружного барьера, препятствующего суперинфицированию дефектной поверхности. Имеющая место микробная флора мало активизирована. Собственно раневая ожоговая поверхность уже в ранние сроки не содержит микробной флоры. Имеет место в сроки 15-20 дней после аппликации раневого покрытия на раны активное формирование краевой пролиферативной реакции эпидермиса, на дне раны формируется слой зрелой и незрелой соединительной ткани, образуется морфологический субстрат будущей тканевой подложки для появления элементов дермы. Активное формирование элементов дермы начинается после 20 суток лечения, имеет место хорошая фибробластная реакция, способная формировать и закрывать дно раны слоем молодой соединительной ткани. В поздние сроки лечения появляется морфологическая волокнисто-клеточная структура, способная сформировать дермальный слой кожи. При использовании для закрытия ожоговой поверхности раневых покрытий очевидна более ранняя реакция продуктивного воспаления как по краям ожогового дефекта кожи, так и в центре обширного ожога, вся поверхность ожогового дефекта выстлана послойно молодой и зрелой грануляционной тканью, содержащей множество вновь образованных микрососудов. Деградация раневого покрытия начинается с 20-х суток. Характерной особенностью является быстрое формирование дермального слоя кожи, содержащего необходимое клеточное микроокружение.

Таким образом, применение композиции для лечения глубокого ожога III-Б степени существенно ускоряет процесс заживления, создавая благоприятные условия для полноценного восстановления дермального слоя кожи.

Пример 3 (клинический)

Больная М., 11 лет, находилась на лечении в ожоговом отделении с диагнозом: ожог пламенем 2%, II-III-A степени правой голени.

Первая помощь не оказывалась. В стационар поступила через 7 часов после травмы.

При первичном осмотре пациентка предъявляла жалобы на резко выраженную боль в области ожоговой раны. На передней поверхности правой голени имелась ожоговая рана с отслоенным эпидермисом, обнаженная дерма преимущественно розового цвета с небольшими участками белого цвета. Кожа вокруг раны гиперемирована и отечна. Примерно 80% раневой поверхности составляет ожог II степени, остальная часть - III-А степени.

Выполнен первичный туалет ожоговых поверхностей - на раневые поверхности наложены повязки с композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁵ клеток/мл).

В клиническом анализе крови при поступлении лейкоцитоз (11,7·10⁹/л), остальные показатели в норме. Клинический анализ мочи без особенностей. В первичном посеве из раны роста какой-либо микрофлоры не обнаружено. Показатели неспецифической резистентности были также в пределах нормы.

Больной ежедневно производили смену повязок с названной композицией (всего 7 процедур).

После первых двух процедур отмечено уменьшение болевого синдрома и отека, также снижение гиперемии прилежащих тканей. После 7 сеансов показатели неспецифической резистентности были в пределах нормы. В ранах интенсивно шли процессы эпителизации.

Пример 4

Больной О., 9 лет, находился на лечении в ожоговом отделении с диагнозом: ожог горячей водой 5%, II-III-A степени стоп, голеней.

Первая помощь не оказывалась. В стационар поступил через 7 часов после травмы.

При первичном осмотре пациент предъявлял жалобы на резко выраженную боль в области ожоговой раны. В области нижней трети обеих голеней, на тыльной и боковой поверхностях обеих стоп имеется ожоговая рана с бледно-розовым дном, обильным серозным отделяемым, остатками эпидермальных пузырей. Кожа вокруг раны гиперемирована и отечна.

На раневые поверхности наложены повязки с композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁵ клеток/мл. Больному ежедневно производили смену повязок (всего 10 процедур).

После первых двух процедур отмечено уменьшение болевого синдрома и хорошая переносимость данной процедуры. Исчезли отек и гиперемия прилежащих тканей.

Болевой синдром при выписке на 12-е сутки ребенок оценил как незначительный.

После 10 сеансов в ранах наблюдают интенсивные процессы эпителизации. Таким образом, после проведения лечения с применением 10 процедур у пациента отмечалось практически полное выздоровление с купированием болевого синдрома.

Пример 5

Больной Р., 28 лет, с обширными пролежнями пояснично-крестовой области и тазобедренных суставов.

На фоне общей антибактериальной и дезонтоксикационной терапии 1 раз в сутки проводили смазывание пролежней композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл).

Полное очищение и эпителизация наступили на 7-8 сутки.

Пример 6

Больная К., 60 лет. Диагноз: сахарный диабет, 2-й тип, тяжелая форма. Синдром диабетической стопы. Флегмона тыла правой стопы.

В день поступления произведено вскрытие и дренирование флегмоны, некрэктомия. В послеоперационном периоде рана ежедневно перевязывалась с использованием композиции, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл).

Рана очистилась на 3-и сутки от начала лечения. Полное заживление наступило на 12-13-е сутки.

Пример 7

Больной И., 27 лет, прооперирован но поводу абсцесса предплечья. После оперативного вмешательства в течение 7 суток на раневую поверхность наносили композицию, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁵ клеток/мл).

На седьмые сутки произошло полное заживление раневой поверхности.

Пример 8

Больной С., 30 лет. Диагноз: карбункул межлопаточной области.

После предварительной предоперационной подготовки больному под внутривенным наркозом произведено иссечение карбункула спины, в первой фазе раневого процесса рана перевязывалась ежедневно композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл.

Полное очищение раны наступило на 2-3 сутки от начала лечения.

Пример 9

Больной С., 72 года, находился на стационарном лечении с диагнозом: трофическая язва нижней трети левой голени на фоне сахарною диабета. При местном применении композиции, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл; в течение трех дней уменьшилась отечность, появились свежие грануляции, уменьшилась болезненность. Произошла полная эпителизация раневой поверхности на 12-е сутки.

Таким образом, предлагаемая композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек обладает выраженным противовоспалительным и ранозаживляющим лечебным эффектом и может быть использована в медицинской практике для лечения трофических поражений кожи и слизистых, развивающихся при различных заболеваниях, например, таких как сахарный диабет, хроническая венозная недостаточность, облитерирующий эндартериит, пролежни, стоматит, ожоги, заболевания слизистых мочеполовых путей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам для регенерации кожи и слизистых оболочек, и может быть использовано в медицине. Композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек включает культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам, в количестве по меньшей мере n x 10, где n - количество названных биологически активных соединений в исходной культуральной питательной среде. В состав композиции также входят костномозговые мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека в количестве по меньшей мере 10⁵ клеток/мл. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения различных повреждений кожи и слизистых оболочек и устранить проблемы, возникающие при использовании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, за счет использования МСК, полученных из костного мозга человека. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 9 пр.

1. Композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек, включающая культуральную питательную среду, включающую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro эукариотических клеток, и кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами эукариотических клеток, выделяемыми ими в питательную среду в процессе их культивирования, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека в количестве по меньшей мере 10⁵ клеток/мл, а в качестве кондиционированной среды она содержит культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам, в количестве по меньшей мере n·10, где n - количество названных биологически активных соединений в исходной культуральной питательной среде.

2. Композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек по п.1, отличающаяся тем, что костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека она содержит преимущественно в количестве от 10³ клеток/мл до 10⁶ клеток/мл.

3. Композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек по п.1, отличающаяся тем, что в основном она содержит следующие ингредиенты, г/л: L-аргинин 0,2; L-аспарагин (безводный) 0,05; L-аспарагиновую кислоту 0,02; L-цистин 0,0652; L-глютаминовую кислоту 0,02; L-глютамин 0,3; L-глицин 0,01; L-гистидин 0,015; L-гидроксипролин 0,02; L-изолейцин 0,05; L-лейцин 0,05; L-лизин HCl 0,04; L-метионин 0,015; L-фенилаланин 0,015; L-пролин 0,02; L-серин 0,03; L-треонин 0,02; L-триптофан 0,005; L-тирозин 0,02883; L-валин 0,02; биотин 0,0002; пантотенат 0,00025; холинхлорид 0,00362; фолиевую кислоту 0,001; инозит 0,035; никотинамид 0,001; РАВА 0,001; пиридоксин солянокислый 0,001; рибофлавин 0,0002; тиамин солянокислый 0,001; витамин В12 0,000005; нитрат кальция 0,1; хлорид калия 0,4; сульфат магния 0,04884; хлорид натрия 6,0; фосфат натрия 0,8; Д-глюкоза 2,0; глютатион 0,001; феноловый красный 0,0053.