КОНДИЦИОННАЯ СРЕДА, ОБЛАДАЮЩАЯ ЛЕЧЕБНЫМ ЭФФЕКТОМ Российский патент 2007 года по МПК A61K35/28 A61P17/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению и применению средства для терапевтических целей, содержащего набор органических активных ингредиентов из среды культур клеток, приготавливаемых для целей клеточной терапии, с использованием кондиционной среды, полученной в результате культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека.

В последние годы в России и за рубежом интенсивно проводятся исследования возможностей получения из различных типов стволовых клеток разных по направлению дифференцировки клеток, которые посредством трансплантации могут применяться для замещения утраченных или поврежденных клеток в жизненно важных органах или тканях. При росте и индукции направленной дифференцировки исходных стволовых клеток в специализированные клетки, которые затем могут использоваться для трансплантации в организм для замещения поврежденных или погибших клеток, и процессе роста и дифференцировки стволовых клеток происходит формирование соответствующей кондиционной среды, которая также может обладать различной биологической активностью, в том числе и лечебным эффектом.

Известна фармацевтическая кондиционная клеточная среда, относящаяся к препаративной биохимии, содержащая очищенный и изолированный человеческий белок онкоингибин, продуцируемый эритробластоидными клетками и обладающий антинеопластической активностью против клеточной линии карциномы груди (MCF7) и карциномы матки HeLa. Он обладает также пролиферативным эффектом на нормальные фибробласты крайней плоти человека [патент РФ 2139087, приоритет США 24.04.1992 г.]. Дополнительно в состав среды входит фармацевтически приемлемый носитель. Способ получения заключается в выращивании человеческих эритробластоидных клеток (К-562) в питательной среде, сборе кондиционной клеточной среды из этих культур, изоляции и очистки человеческого онкоингибина и создании на основе выделенного белка новой кондиционной среды, которая используется для лечения онкологических больных.

Недостатки данной кондиционной клеточной среды связаны с тем, что она обладает только свойством ингибировать рост опухоли, но не восстанавливать пролиферацию нормальных, выживших после противоопухолевой терапии клеток, обеспечивающих регенерацию поврежденных нормальных тканей.

Известна бессывороточная среда (культура мезенхимальных стволовых клеток в бессывороточной культуральной среде) для хондроцитоподобных клеток [заявка на изобретение РФ 2001116126 от 08.11.1999 г., приоритет Италия], включающая FGF-2, LIF, SCF, пантотенат, биотин, селен, PDGFbb, IGF-1, аскорбиновую кислоту, холестерин, альбумин, меркаптоэтанол, дексаметазон, трансферин) и минимальную незаменимую среду.

Несмотря на то что эта среда обеспечивает рост и развитие мезенхимальных стволовых клеток в направлении их дифференцировки в хондроциты, у нее не доказаны свойства лечебного эффекта при поражении нормальной кожи или слизистых.

Известен также способ получения кондиционной среды на основе культуры мезенхимальных стволовых клеток, в которой накапливаются биологически активные продукты, способствующие росту и дифференцировке нормальных клеток [Mbalaviele G, Jaiswal N, Meng A, Cheng L, Van Den Bos C, Thiede M. Human mesenchymal stem cells promote human osteoclast differentiation from CD34+ bone marrow hematopoietic progenitors // Endocrinology. 1999 Aug; 140(8): 3736-3743]. Способ заключается в сокультивировании гемопоэтических стволовых клеток с мезенхимальными стволовыми клетками. При этом обеспечивается ускорение роста мезенхимальных стволовых клеток и дифференцировка их в остеобласты.

Недостаток получаемой среды заключается в накоплении биологически активных продуктов, которые выполняют очень узкую задачу обеспечения роста и дифференцировки нормальных клеток в направлении остеобластов.

Известна кондиционная среда, в которой культивируются мезенхимальные стволовые клетки человека [Majumdar MK, Thiede MA, Haynesworth SE, Bruder SP, Gerson SL. Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages // J.Hematother. Stem Cell Res. 2000 Dec; 9(6): 841-848]. В получаемой культуре поддерживают дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в направлении образования стромальных механоцитов или остеобластов, которые выделяют цитокины, обладающие способностью активировать продолжительный рост культуры гемопоэтических стволовых клеток. Способность мезенхимальных стволовых клеток выделять цитокины в окружающую их среду позволяет рекомендовать ее к применению в качестве средства для клеточной терапии, направленной на стимуляцию нарушенного гемопоэза.

Недостатком получаемой кондиционной среды является ее ограниченное стимулирующее действие всего лишь регенерацией нарушенного гемопоэза.

Известна фармацевтическая композиция, содержащая кондиционированную клеточную культуральную среду [RU 2001133453/13. Дата подачи заявки: 12.05.2000 г., приоритет US: 09/313,538 от 14.05.1999], которая ранее поддерживала рост эукариотических клеток, культивированных в трех измерениях, и фармацевтический носитель. Она может иметь форму в виде жидкости, твердой или лиофилизованной фазы, порошка, геля или пленки. Фармацевтический носитель может включать пониженное или повышенное содержание одного или нескольких внеклеточных продуктов, являющихся компонентами указанной кондиционированной клеточной среды и выделяемых методами разделения белков. Внеклеточными продуктами являются: фактор роста, противовоспалительный медиатор, фермент, цитокин, гормон, фактор свертывания крови, регуляторный фактор, ангиогенный фактор или антиангиогенный фактор. Среда может быть использована в качестве пищевого продукта с повышенным содержанием питательных веществ и питательной добавки в форме жидкости, таблетки или капсулы.

Получение фармацевтической композиции предусматривает: 1) культивирование эукариотических клеток в трех измерениях в клеточной культуральной среде, удовлетворяющей потребностям в питательных веществах, необходимых для роста клеток in vitro; 2) культивирование клеток in vitro продолжается до тех пор, пока данная клеточная среда не будет содержать нужный уровень внеклеточных продуктов, необходимых для образования кондиционированной среды; 3) отделение кондиционированной среды от клеток, использованных для кондиционирования среды; 4) объединение указанной кондиционированной среды с фармацевтически приемлемым носителем.

Фармацевтическую композицию используют для стимуляции заживления ран и лечения ожогов, а также для коррекции косметического дефекта.

Недостатками рассматриваемой фармацевтической композиции, содержащей кондиционную клеточную среду, является то, что лечебное действие обеспечивается не применением самой кондиционной среды из-под клеток, в том числе и стволового типа, а комплексом внеклеточных продуктов и других элементов композиции. Роль кондиционной среды заключается в поддержании жизнедеятельности используемых в композиции клеток и среды для сохранения внеклеточных продуктов, составляющих фармацевтический носитель. Кроме того, пониженное или повышенное содержание одного или нескольких внеклеточных продуктов фармацевтического носителя свидетельствует об отсутствии критериев качества созревания среды в целом, несмотря на то, что она выдерживается до тех пор, пока в ней не сформируется нужный уровень внеклеточных продуктов, необходимых для образования кондиционированной среды. Такой подход не исключает возможность проявления непредвиденных свойств фармацевтической композиции.

Вместе с тем, следует отметить, что свойства кондиционной среды зависят также от исходного состава ростовой среды и конечного содержания входящих в нее биологически активных ингредиентов, типа применяемых клеток и, следовательно, в данном изобретении она не является постоянной.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения рассматривается ростовая среда, которая используется при выращивании популяции кардиомиоцитов из исходных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, в большей мере удовлетворяющая требованиям трансплантации клеток для регенерации ткани сердца. Такая среда IMDM (Iscove's modified Dulbecco's) была использована Fukuda К. Development of Regenerative Cardiomiocites from Mesenchymal Stem Cells for Cardiovascular Tissue Engineering // Artificial Organs, 2001, V.25, N 3, pp.187-195. Она содержит наряду с солевым раствором и аминокислотами также пенициллин (100 μg/ml), стрептомицин (250 ng/ml), амфотерицин В (85 (μg/ml), L-глютамин 2-3 mM и 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Для индукции процесса дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в направлении кардиомиоцитов в ростовую среду вводят препарат 5-азацитидин, обладающий свойствами деметилирующего агента, который направляет на новый путь дифференцировки до 30% клеток. В результате роста и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток и их дифференцировки в кардиомиоциты в среде накапливаются продукты жизнедеятельности.

Недостатками прототипа является то, что свойства продуктов жизнедеятельности не идентифицированы и эффект их не изучен. Кроме того, в среде сохраняются остатки препарата 5-азацитидин, которые обладают мутагенным действием.

Накопленный нами опыт в области изучения механизмов регуляции стволовых клеток в системах клеточного обновления в интактном и облученном организме, опыт работы с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга человека и лабораторных животных позволил в процессе специфической дифференцировки установить эффект повышения клеточной радиорезистентности, связанный с усилением активности ферментативных систем, обеспечивающих пролиферативную и репаративную функции клеток в системах клеточного обновления [Коноплянников А.Г. Радиобиология стволовых клеток. М., Энергоатомиздат, 1984, 120 с.].

На основе выявленного эффекта предлагается изобретение, направленное на создание кондиционной среды, обладающей лечебным эффектом широкого действия, в первую очередь, при лечении повреждений нормальных тканей (кожи и слизистых), вызванных действием ионизирующей радиации или ожога.

Поставленная цель достигается тем, что кондиционная среда, содержащая минеральные соли, антибиотики и питательные вещества, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста мезинхимальных стволовых клеток, включает продукты жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека, концентрация которых пропорциональна доле клеток, находящихся в Go периоде клеточного цикла, в стадии стационарного роста культуры стабильной линии МСК.

Предлагаемое решение позволяет установить ранее не известное свойство клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, связанное с выделением в питательную клеточную среду наряду с различными продуктами жизнедеятельности также и активных факторов, способствующих репаративной регенерации поврежденных тканей. При этом следует учесть один факт, часто понимаемый ошибочно, заключающийся в том, что пролиферативно "покоящиеся" клетки, находящиеся в стадии G₀ клеточного цикла, отнюдь не покоятся метаболически и в них идет активный синтез разнообразных соединений и выделение в культуральную среду многих биологически активных соединений (Dash B.C., El-Deiry W.S. Checkpoint Controls and Cancer.V. 1: Reviews and Model Systems. 2004, Humana Press; Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. 2003, М., МИА). Стадия стационарного роста стабильной линии мезенхимальных стволовых клеток, по нашим данным, является критерием формирования зрелости кондиционной среды, что позволяет констатировать изобретательский уровень найденного решения.

Вместе с тем, следует отметить, что клеточная терапия в конечном счете не сводится только к пересадке живых и способных приживаться в новом организме клеток. Ранее в ней имелись также примеры пересадки различных клеточных экстрактов, консервированных клеток и тканей (Балтайтис Ю. Клеточная терапия. - 2003, Vitanova).

Пример 1. (Получение среды)

Клеточный материал в виде клеток костного мозга был получен при пункции подвздошной кости человека при использовании местной анестезии 0,5% раствором новокаина строго в стерильных условиях, объемом 0,5-1,0 мл, при клеточности полученного материала порядка 5×10⁷ клеток и помещен в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывали в среде 199 ("Sigma", USA), центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды служила содержащая минеральный солевой раствор и аминокислоты среда RPMI-1640 ("Sigma", USA) с добавлением антибиотиков - пенициллина (до 100 ЕД/мл), амфотерицина (до 100 нг/мл), стрептомицина (до 100 мкг/мл), L-глютамина (2-4 мМ) и 20% эмбриональной телячьей сыворотки (все добавки "Sigma", USA).

Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см², в которые вносили 5×(10⁶-10⁷) клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Для очищения культуры от кроветворных клеток, увеличения общего количества мезенхимальных клеток и достижения сливного (конфлюентного) монослоя культуру пересевали 2-4 раза. В большинстве случаев 3-х раз было вполне достаточно для избавления от гемопоэтических клеток, сохранения в культуре только мезенхимальных стволовых клеток и накопления достаточного количества продуктов их жизнедеятельности. Культуральные флаконы продували газовой смесью, содержащей 4-6% углекислого газа (остальное воздух), каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. Среду меняли каждые 3-4 суток по мере ее закисления размножающимися стволовыми клетками. Культуральные флаконы в процессе роста содержались в обычном термостате при 37°С. Стадию стационарного роста стабильной линии мезенхимальных стволовых клеток, когда наступает созревание кондиционной среды, мы оценивали посредством наблюдения за образованием конфлюентного слоя клеток с помощью инвертированного микроскопа.

Кондиционную среду собирали из выросшей культуры в стерильную посуду. Ее можно использовать непосредственно по назначению или хранить в течение продолжительного времени в определенных условиях. Например, если предполагалось использование кондиционной среды в течение одной недели, то ее хранили в холодильнике при температуре около 3-4°С. При сроках использования более чем через одну неделю ее замораживали и хранили при температуре -20°С и ниже. Перед употреблением среду размораживали.

Таким образом, к концу 5-6 недели от начала культивирования клеток костного мозга человека можно получить популяцию мезенхимальных стволовых клеток человека достаточного количества (1-2)×10⁸ клеток для аутологичной трансплантации и одновременно получить до 800 мл надлежащего качества кондиционной среды, которая используется при лечении лучевых поражений нормальных тканей человека.

Пример 2. (Лечение в эксперименте)

Противолучевое действие кондиционной среды (КС) из культуры мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей было изучено на модели острого лучевого поражения кожи кончика хвоста крыс. Для этого у крыс линии Вистар, самцов, массой 120-140 г, дистальный участок хвоста длиной 2 см подвергали локальному гамма-облучению (гамма-лучи Со⁶⁰) на установке "Луч" в дозе 20 Гр при мощности дозы порядка 0,5 Гр/мин. Перед облучением крысы получали для обездвиживания инъекцию нембутала (60 мг/кг). Процедура лечения заключалась в том, что, начиная с первого дня после облучения, в течение двух недель, ежедневно, проводили по одной аппликации марлевой салфеткой, смоченной неразведенным раствором КС.

Результаты наблюдения показали, что у контрольных крыс на второй неделе после облучения развивался влажный эпидермит, который у 4-х из 15 (26,6%) подопытных животных через 3-4 недели после облучения привел к развитию лучевой язвы. Заживление рубцом у остальных животных этой группы (у которых язвы не развились) завершалось только через 5-6 недель. У 2-х из 15 (13,3%) подопытных животных к этому сроку пали.

У всех подопытных крыс в период максимального развития лучевых реакций, на 2-й неделе после облучения, наблюдалось и проявлялось развитие эритемы и сухого шелушения. Признаков развития влажного эпидермита и лучевых язв ни у одного из подопытных животных не наблюдали. Через 1 месяц после начала опыта у подопытных животных наблюдали только нерезко выраженные изменения интенсивности окраски и тургора кожи кончика хвоста.

Таким образом, аппликации зрелой КС обладали в наших опытах выраженным лечебным эффектом при остром лучевом поражении кожи животных. При использовании КС из культур, в которых не наступало конфлюэнтного роста, лечебный эффект не был выявлен. Существенных различий в эффективности КС, полученной из культур мезенхимальных стволовых клеток костного мозга различной длительности пассирования, также не было выявлено (на примере использования культур после 1-го, 4-го и 20-го пассажей).

Клинические исследования

Традиционно применяемый в клинике МРНЦ РАМН способ лечения лучевых повреждений прямой кишки заключается в ежедневном двукратном введении 5-10% раствора диметилсульфоксида (ДМСО) - димексида. Он в основном пригоден для снятия острых воспалительных явлений, что ограничивает возможности репаративного процесса пораженных тканей и приводит к необходимости проведения повторных длительных курсов лечения сроком до 25-30 дней.

Появление кондиционной среды культуры стволовых клеток костного мозга человека существенно расширяет спектр терапевтических возможностей для лечения различных лучевых повреждений.

В клинике МРНЦ РАМН кондиционную среду использовали для лечения у 55 больных в возрасте от 19 до 70 лет лучевыми повреждениями прямой кишки, развившихся после сочетанной лучевой терапии рака шейки матки и предстательной железы. По характеру лучевого повреждения катаральные изменения были у 8 больных, эрозивно-десквамативный ретит - у 16 больных и язвенно-некротический ректит - у 14 пациентов. Эффективность лечения оценивали по субъективным критериям (характер болей, характер стула, консистенция кала) и по результатам эндоскопического исследования, проводившихся перед началом лечения, а затем каждую неделю и в заключении лечения.

Пример 3. Больная Ш-ва, 51 год, история болезни №6229/03, поступила в клинику с диагнозом поздний лучевой геморрагический ректит, развившийся через 6 месяцев после сочетанной лучевой терапии рака шейки матки. Ректоскопия выявила сочно гиперемированную слизистую прямой кишки, отечность. Слизистая кишки легко ранима, обильно контактно кровоточит. Дефектов в виде язв, эрозий не выявлено.

Проведен курс лечения: на фоне традиционной медикаментозной терапии в прямую кишку вводили кондиционную среду из-под культуры стволовых клеток костного мозга утром и вечером по 30-50 мл. В результате отмечено улучшение состояния больной уже на третий день после начала лечения, а на 7-8 день положительная динамика нарастала в виде значительного уменьшения болевого синдрома при акте дефекации, а также уменьшения выделения крови вплоть до ее исчезновения к концу курса лечения. Для стабилизации состояния которой лечение продолжали в течение 15 дней.

После окончания лечения выполнена повторная ректоскопия. Слизистая прямой кишки розовая, отек исчез, кровоточивость не наблюдается.

Пример 4. Больная С-на, 60 лет, история болезни №6371/03.

Диагноз: поздний лучевой язвенно-некротический ректит, развившийся через год после окончания сочетанной лучевой терапии рака шейки матки. Эндоскопическое исследование выявило лучевую язву диаметром до 1,5 см на передней стенке прямой кишки на расстоянии 7-8 см от ануса. Дно язвы выполнено гнойно-некротической пленкой, края отечны, легко и обильно контактно кровоточат.

Проведено общее традиционное лечение в сочетании с местным введением кондиционной среды культуры стволовых клеток костного мозга человека в виде микроклизм по 30-50 мл два раза в день утром и вечером. Вследствие проведенного лечения улучшение отмечено уже на 2-й день в виде уменьшения болевых ощущений и геморрагических проявлений. Местное введение кондиционной среды продолжали в течение 14-ти дней.

После окончания лечения проведена контрольная ректоскопия. Края язвы спокойные, отечность исчезла, кровоточивость не наблюдается, сократились ее размеры.

У больных с катаральным ректитом после лечения кондиционной средой уже на 5-6 день отмечалось улучшение самочувствия, хотя эндоскопическая картина не изменилась. При лечении 10% раствором ДМСО положительная динамика наблюдалась всего лишь у 30% больных.

Применение кондиционной среды у больных с эрозивно-десквамативным ретитом уже к концу первой недели лечения позволило снизить боли в кишке, уменьшить кровоточивость и гиперемию слизистой. На 14-15 день лечения у 70% леченых больных отмечалось заживление поврежденного сегмента кишки. Тогда как лечение с применением 10% ДМСО к 14-15 дню приводило всего лишь к снижению болей и уменьшению кровоточивости только у 15% больных.

Особенно эффективное лечение с испльзованием кондиционной среды отмечено у больных с язвенным ректосигмоидитом: язвенно-некротический ректит - всего у 14 пациентов. У 11 больных из них к 15-20 дням отмечено рубцевание язвенного ректита, а к 21 дню заживление отмечено у 13 из 14 пациенток этой группы. Лечение 10% ДМСО приводило к улучшению на 15-20 день всего лишь у 25% больных, а к 21 дню - у 36% пациентов.

Использование кондиционной среды культуры стволовых клеток костного мозга человека для лечения больных с лучевыми повреждениями позволяет уменьшить проявления патологических симптомов, сократить сроки лечения в 2 раза и удлинить состояние ремиссии до 1 года и более по сравнению с использованием ДМСО. Общее улучшение состояния, подтвержденное клинически и эндоскопически, отмечено более чем у 90% больных.

Пример 5. (лечение ожогов)

Пациент Т-ов Ю.Н., 30 л., находился на лечении в хирургическом отделении МСО-8 в ноябре-декабре 2004 г.

Диагноз - термический ожог 2-3 степени обеих рук и головы (10-15% всех кожных покровов).

Лечение: - мазь левомиколь. Наблюдение состояния больного - аллергическая и пирогенная реакция, подъем температуры до 39°С, болевой синдром, гиперемия кожных покровов и т.д. Эпителизация проходила вяло. При смене повязки проявлялись острые боли.

Принимая во внимание тяжелое состояние больного, было принято решение использовать кондиционную среду из-под культуры стволовых мезенхимальных клеток костного мозга человека. Курс лечения заключался в ежедневных аппликациях кондиционной среды.

В результате проводимого лечения больной отметил снижение болевого синдрома.

Объективные показатели - ускорились эпителизация кожи и заживление раневых поверхностей. При перевязке отсутствовали случаи травматизации вновь образующейся кожи. Лечение кондиционной средой не вызывало побочных реакций, что позволило завершить его в домашних условиях самостоятельно. В конечном итоге применение кондиционной среды обеспечило за 3-4 недели заживление ожоговой поверхности без образования рубцов, восстановления поврежденных нервных окончаний и ускорение процесса выздоровления больного в 5-6 раз быстрее по сравнению с использованием традиционных препаратов.

Таким образом, предлагаемая кондиционная среда культуры стволовых клеток костного мозга человека обладает лечебным эффектом и может быть расширен спектр ее применения.

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к биологически активным веществам, которые обладают свойством усиления активности ферментативных систем, а также обеспечивающих пролиферативную и репаративную функцию клеток в системах клеточного обновления. Кондиционная среда предназначена для лечения повреждений нормальных тканей (коржи и слизистых), вызванных ожогом. Она содержит минеральные соли, антибиотики и питательные вещества, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека, включая продукты их жизнедеятельности. Кондиционную среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в Go периоде клеточного цикла, а затем среду собирают. Изобретение обеспечивают улучшение лечебного эффекта.

Кондиционная среда, обладающая лечебным эффектом при термических ожогах и содержащая солевой состав и аминокислоты, пенициллин, амфотерицин, L-глутамин и эмбриональную телячью сыворотку, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, отличающаяся тем, что среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в Go периоде клеточного цикла, а затем среду собирают.